माइक्रोबियल संक्रमण और विश्लेषण के लिए Drosophila melanogaster लार्वा से Hemocytes का निष्कर्षण
Summary
इस विधि को दर्शाता है कि कैसे तीन आयामी (3 डी) मॉडल के साथ कीट कोशिकाओं में रोगज़नक़ आक्रमण कल्पना करने के लिए । Drosophila लार्वा से Hemocytes वायरल या जीवाणु रोगजनकों, या तो पूर्व vivo या vivo मेंसंक्रमित थे । संक्रमित hemocytes तो तय कर रहे थे और एक फोकल माइक्रोस्कोप और बाद में 3 डी सेलुलर पुनर्निर्माण के साथ इमेजिंग के लिए दाग ।
Abstract
Drosophila melanogaster के रोगजनक संक्रमण के दौरान, hemocytes संक्रमण भर में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक विधि विकसित करने के लिए मक्खियों के एक विशिष्ट प्रतिरक्षा डिब्बे में रोगज़नक़ आक्रमण कल्पना, अर्थात् hemocytes है । यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग कर, 3 × 106 जीवित hemocytes २०० Drosophila 3rd instar लार्वा से 30 मिनट में पूर्व vivo संक्रमण के लिए प्राप्त किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, hemocytes 3rd instar लार्वा के इंजेक्शन के माध्यम से vivo में संक्रमित किया जा सकता है hemocyte निष्कर्षण के बाद 24 एच के बाद संक्रमण. ये संक्रमित प्राथमिक कोशिकाओं, तय दाग थे, और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि । फिर, 3 डी निरूपण निश्चित रोगज़नक़ आक्रमण दिखाने के लिए छवियों से उत्पन्न किया गया । इसके अतिरिक्त, qRT-पीसीआर के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए संक्रमण के बाद रोगज़नक़ mRNA का पता लगाने के लिए प्राप्त किया जा सकता है, और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं से पर्याप्त प्रोटीन निकाला जा सकता है । एक साथ लिया, हम रोगज़नक़ आक्रमण और जीवाणु और वायरल रोगज़नक़ प्रकार और hemocyte निष्कर्षण के लिए एक कुशल विधि का उपयोग कर संक्रमण की पुष्टि के निश्चित सुलह के लिए एक विधि मौजूद करने के लिए पर्याप्त Drosophila से लाइव hemocytes प्राप्त करने के लिए पूर्व vivo और vivo संक्रमण प्रयोगों में के लिए लार्वा ।
Introduction
Drosophila melanogaster जन्मजात उन्मुक्ति1के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, hemocytes रोगज़नक़ चुनौती के जवाब में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । Hemocytes परजीवी encapsulating के लिए महत्वपूर्ण हैं, साथ ही कवक के दौरान phagocytic कार्रवाई के माध्यम से रोगज़नक़ का मुकाबला करने में एक महत्वपूर्ण समारोह होने, वायरल, और बैक्टीरियल संक्रमण2,3.
आदेश में सबसे अच्छा रोगजनक माइक्रोबियल संक्रमण के लिए मेजबान के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए, यह कल्पना कैसे रोगज़नक़ संक्रमण के दौरान मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह दृश्य आक्रमण के तंत्र की समझ में योगदान देता है । एक साथ रोगज़नक़ intracellular स्थानीयकरण और सेलुलर प्रतिक्रिया के विवरण के साथ, इन आंकड़ों के साथ संक्रमण और सेलुलर organelles जिसके साथ सूक्ष्म जीव इंटरैक्ट करता है के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, 3 डी मॉडल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के बाद पुनर्निर्माण के लिए मेजबान कोशिकाओं में रोगजनकों के सटीक स्थान का निर्धारण मददगार हो सकता है । इस अध्ययन में, हम Coxiella burnetii के आक्रमण की कल्पना (सी. burnetii), क्यू बुखार के प्रेरणा का एजेंट, एक पशुजन्य रोग है कि दोनों मानव और पशु स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है, प्राथमिक Drosophila hemocytes में । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गयाहै कि Drosophila के लिए अतिसंवेदनशील है २ ९ माइल द्वितीय चरण (NMII) C. burnetii के क्लोन 4 तनाव और है कि इस तनाव को Drosophila 4 में दोहराने में सक्षम है, यह दर्शाता है कि Drosophila एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सी. burnetii रोगजनन अध्ययन ।
पिछले अध्ययनों hemocytes का इस्तेमाल किया है मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच । Hemocytes का उपयोग रूपात्मक टिप्पणियों के लिए किया गया है5,6,7, morphometric विश्लेषण2,8, phagocytosis विश्लेषण2,3, qRT-पीसीआर2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent एनालिसिस10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 और immunohistochemistry9,14. हालांकि Drosophila S2 कोशिकाओं को भी विभिंन इन विट्रो प्रयोगों, immortalization और संभावित पहले से मौजूद वायरल संक्रमण उनके व्यवहार में परिवर्तन15,16के लिए उपलब्ध हैं । इस तरह के S2 कोशिकाओं के रूप में एक अमर सेल लाइन, के खिलाफ प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग, एक प्रणाली में जंमजात प्रतिरक्षा समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और पूरे जीव के प्रतिनिधि । इसके अतिरिक्त, vivo मेंhemocytes के संक्रमण, निष्कर्षण से पहले, कोशिकाओं अंय मेजबान प्रोटीन और ऊतक, hemocytes के निष्कर्षण पर एक लाभ से पहले पूर्व vivo संक्रमण के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है । विभिंन तरीकों की एक संख्या के लिए समय की एक छोटी अवधि में hemocytes की एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया है hemocytes जिंदा रखने के लिए8,17,18,19।
इस अध्ययन में, हम सी. burnetii, लिस्टिरिया monocytogenes (लिस्टिरिया), या Invertebrate इंद्रधनुषी के साथ रोगजनक माइक्रोबियल संक्रमण के लिए Drosophila 3आरडी instar लार्वा से hemocytes निकालने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं वायरस 6 (IIV6) । हम दोनों के लिए तरीकों का वर्णन vivo और पूर्व vivo hemocyte संक्रमण में । vivo में-और पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ visualized थे और C. burnetii आक्रमण के 3 डी मॉडल का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अतिरिक्त, निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति परख के लिए इस्तेमाल किया गया । विशेष रूप से, IIV6 और लिस्टिरियाके साथ संक्रमण की सीमा की जांच करने के लिए, कुल आरएनए या प्रोटीन qRT-पीसीआर या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं से अलग किया गया था । एक साथ लिया, प्रोटोकॉल तेजी से 3rd instar लार्वा और सबूत है कि प्राथमिक hemocytes से hemocytes की उच्च संख्या इकट्ठा करने के लिए तरीके प्रदान करता है, vivo में या तो संक्रमित या पूर्व vivo, माइक्रोबियल के लिए एक उपयुक्त मंच हैं रोगज़नक़ संक्रमण अध्ययन और ऐसे माइक्रोस्कोपी, transcriptomics, और प्रोटियोमिक् के रूप में लागू बहाव के विश्लेषण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
बेहतर समझने के लिए कैसे मेजबान कोशिकाओं संक्रमित हो जाते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं में रोगज़नक़ के स्थानीयकरण स्पष्ट है, खासकर जब पहले untested रोगज़नक़ और सेल प्रकार संयोजन पर प्रयोग कर4। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम mCherry-एक्सप्रेस Coxiella burnetiiके स्टॉक्स प्रदान करने के लिए डॉ रॉबर्ट Heinzen के आभारी हैं । हम Invertebrate इंद्रधनुषी वायरस 6 प्रदान करने के लिए Dr. Luis Teixeira और ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र फ्लाई स्टॉक प्रदान करने के लिए धंयवाद । इस परियोजना के हिस्से में NIH ग्रांट R00 AI106963 (A.G.G. को) और वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Schneider's Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 21720024 | 1.1.1), 2.1.2) |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences (HyClone) | SH30070.03HI | 1.1.1), 2.1.2) |
| Filter (0.22 µL) | RESTEK | 26158 | 1.1.1) |
| Strainer (100 µm) | Greiner bio-one | 542000 | 1.2.1), 2) |
| Stereo microscope | Amscope | SM-1BSZ-L6W | 1.2), 2) |
| Glass capillary | Fisher Scientific | 21-171-4 | 1.1), 1.2), 2) |
| Capillary puller | Narishige International USA, Inc. | PC-10 | 1.1.3) |
| Mineral oil | Snow River Products | 1.1.4) | |
| Nanoinjector | Drummond Scientific Company | 3-000-204 | 1.1), 1.2), 2.2) |
| Forceps | VWR | 82027-402 | 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7) |
| CO2 delivery apparatus | Genesee Scientific | 59-122BC | 1.2), 2) |
| Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific (Gibco) | 15250061 | 1.3) |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | 1.3) |
| 24 well plate | Greiner bio-one | 662160 | 1.4), 2.2) |
| Coxiella burnetii – mCherry | Dr. Heinzen, R. | 1.4), 2.2) | |
| Drosophila fruit juice plates | Cold Spring Harbor Protocols | 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full | |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | 2.1.1.1) |
| Methyl paraben | Amresco | 0572-500G | 2.1.1.2) |
| Absolute ethanol | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | 2.1.1.2) |
| Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL | Amazon | B0025UJVGM | 2.1.1.3) |
| Petri dishes, 10 x 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | 2.1.1.4) |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-80 | 1.4.4), 2.2.2) |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 0210140001 | 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v) |
| Tungsten needle | Fine Science Tools | 10130-20 | 2.1) |
| Holding forceps | VWR | HS8313 | 2.1) |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | FLO4042-500 | 3.1.3) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | 3.1.3) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9706-100 | 3.1.3) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | Thermo Fisher Scientific | 62247 | 3.1.4) |
| Antifade mounting medium | Thermo Fisher Scientific | P36930 | 3.1.6) |
| Confocal microsope | Leica | TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope | 3.2) |
| 3D imaging reconstruction software | Leica | LASX with 3D visualization module | 3.3) |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-3 | 3.1.6) |
| Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) | Dr. Teixeria, L. | 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008) | |
| Listeria monocytogenes | ATCC | strain: 10403S | 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C. |
| DNase I | Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) | 18068015 | gDNA degradation |
| cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IIV6_193R_F | IDT | qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3' | |
| IIV6_193R_R | IDT | qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3' | |
| RpII_qRTPCR_fwd | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG | |
| RpII_qRTPCR_rev | SIGMA-ALDRICH | qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG | |
| SYBR Green qRT-PCR reagent | Thermo Fisher Scientific | K0251, K0252, K0253 | qRT-PCR |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4351107, 7500 Software v2.0 | qRT-PCR |
| Anti-Listeria monocytogenes antibody | abcam | ab35132 | Western blot |
| Anti-Actin antibody produced in rabbit | SIGMA-ALDRICH | A2066 | Western blot |
| Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate | Promega | W4011 | Western blot |
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