Summary

माइक्रोबियल संक्रमण और विश्लेषण के लिए Drosophila melanogaster लार्वा से Hemocytes का निष्कर्षण

Published: May 24, 2018
doi:

Summary

इस विधि को दर्शाता है कि कैसे तीन आयामी (3 डी) मॉडल के साथ कीट कोशिकाओं में रोगज़नक़ आक्रमण कल्पना करने के लिए । Drosophila लार्वा से Hemocytes वायरल या जीवाणु रोगजनकों, या तो पूर्व vivo या vivo मेंसंक्रमित थे । संक्रमित hemocytes तो तय कर रहे थे और एक फोकल माइक्रोस्कोप और बाद में 3 डी सेलुलर पुनर्निर्माण के साथ इमेजिंग के लिए दाग ।

Abstract

Drosophila melanogaster के रोगजनक संक्रमण के दौरान, hemocytes संक्रमण भर में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक विधि विकसित करने के लिए मक्खियों के एक विशिष्ट प्रतिरक्षा डिब्बे में रोगज़नक़ आक्रमण कल्पना, अर्थात् hemocytes है । यहां प्रस्तुत विधि का उपयोग कर, 3 × 106 जीवित hemocytes २०० Drosophila 3rd instar लार्वा से 30 मिनट में पूर्व vivo संक्रमण के लिए प्राप्त किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, hemocytes 3rd instar लार्वा के इंजेक्शन के माध्यम से vivo में संक्रमित किया जा सकता है hemocyte निष्कर्षण के बाद 24 एच के बाद संक्रमण. ये संक्रमित प्राथमिक कोशिकाओं, तय दाग थे, और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि । फिर, 3 डी निरूपण निश्चित रोगज़नक़ आक्रमण दिखाने के लिए छवियों से उत्पन्न किया गया । इसके अतिरिक्त, qRT-पीसीआर के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए संक्रमण के बाद रोगज़नक़ mRNA का पता लगाने के लिए प्राप्त किया जा सकता है, और पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए इन कोशिकाओं से पर्याप्त प्रोटीन निकाला जा सकता है । एक साथ लिया, हम रोगज़नक़ आक्रमण और जीवाणु और वायरल रोगज़नक़ प्रकार और hemocyte निष्कर्षण के लिए एक कुशल विधि का उपयोग कर संक्रमण की पुष्टि के निश्चित सुलह के लिए एक विधि मौजूद करने के लिए पर्याप्त Drosophila से लाइव hemocytes प्राप्त करने के लिए पूर्व vivo और vivo संक्रमण प्रयोगों में के लिए लार्वा ।

Introduction

Drosophila melanogaster जन्मजात उन्मुक्ति1के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है । जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दौरान, hemocytes रोगज़नक़ चुनौती के जवाब में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । Hemocytes परजीवी encapsulating के लिए महत्वपूर्ण हैं, साथ ही कवक के दौरान phagocytic कार्रवाई के माध्यम से रोगज़नक़ का मुकाबला करने में एक महत्वपूर्ण समारोह होने, वायरल, और बैक्टीरियल संक्रमण2,3.

आदेश में सबसे अच्छा रोगजनक माइक्रोबियल संक्रमण के लिए मेजबान के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए, यह कल्पना कैसे रोगज़नक़ संक्रमण के दौरान मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह दृश्य आक्रमण के तंत्र की समझ में योगदान देता है । एक साथ रोगज़नक़ intracellular स्थानीयकरण और सेलुलर प्रतिक्रिया के विवरण के साथ, इन आंकड़ों के साथ संक्रमण और सेलुलर organelles जिसके साथ सूक्ष्म जीव इंटरैक्ट करता है के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के बारे में सुराग प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, 3 डी मॉडल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के बाद पुनर्निर्माण के लिए मेजबान कोशिकाओं में रोगजनकों के सटीक स्थान का निर्धारण मददगार हो सकता है । इस अध्ययन में, हम Coxiella burnetii के आक्रमण की कल्पना (सी. burnetii), क्यू बुखार के प्रेरणा का एजेंट, एक पशुजन्य रोग है कि दोनों मानव और पशु स्वास्थ्य के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है, प्राथमिक Drosophila hemocytes में । हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गयाहै कि Drosophila के लिए अतिसंवेदनशील है २ ९ माइल द्वितीय चरण (NMII) C. burnetii के क्लोन 4 तनाव और है कि इस तनाव को Drosophila 4 में दोहराने में सक्षम है, यह दर्शाता है कि Drosophila एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है सी. burnetii रोगजनन अध्ययन ।

पिछले अध्ययनों hemocytes का इस्तेमाल किया है मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच । Hemocytes का उपयोग रूपात्मक टिप्पणियों के लिए किया गया है5,6,7, morphometric विश्लेषण2,8, phagocytosis विश्लेषण2,3, qRT-पीसीआर2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent एनालिसिस10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 और immunohistochemistry9,14. हालांकि Drosophila S2 कोशिकाओं को भी विभिंन इन विट्रो प्रयोगों, immortalization और संभावित पहले से मौजूद वायरल संक्रमण उनके व्यवहार में परिवर्तन15,16के लिए उपलब्ध हैं । इस तरह के S2 कोशिकाओं के रूप में एक अमर सेल लाइन, के खिलाफ प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग, एक प्रणाली में जंमजात प्रतिरक्षा समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है और पूरे जीव के प्रतिनिधि । इसके अतिरिक्त, vivo मेंhemocytes के संक्रमण, निष्कर्षण से पहले, कोशिकाओं अंय मेजबान प्रोटीन और ऊतक, hemocytes के निष्कर्षण पर एक लाभ से पहले पूर्व vivo संक्रमण के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है । विभिंन तरीकों की एक संख्या के लिए समय की एक छोटी अवधि में hemocytes की एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया है hemocytes जिंदा रखने के लिए8,17,18,19

इस अध्ययन में, हम सी. burnetii, लिस्टिरिया monocytogenes (लिस्टिरिया), या Invertebrate इंद्रधनुषी के साथ रोगजनक माइक्रोबियल संक्रमण के लिए Drosophila 3आरडी instar लार्वा से hemocytes निकालने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं वायरस 6 (IIV6) । हम दोनों के लिए तरीकों का वर्णन vivo और पूर्व vivo hemocyte संक्रमण में vivo में-और पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ visualized थे और C. burnetii आक्रमण के 3 डी मॉडल का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अतिरिक्त, निष्कर्षण प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, पूर्व vivo-संक्रमित hemocytes जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति परख के लिए इस्तेमाल किया गया । विशेष रूप से, IIV6 और लिस्टिरियाके साथ संक्रमण की सीमा की जांच करने के लिए, कुल आरएनए या प्रोटीन qRT-पीसीआर या पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए कोशिकाओं से अलग किया गया था । एक साथ लिया, प्रोटोकॉल तेजी से 3rd instar लार्वा और सबूत है कि प्राथमिक hemocytes से hemocytes की उच्च संख्या इकट्ठा करने के लिए तरीके प्रदान करता है, vivo में या तो संक्रमित या पूर्व vivo, माइक्रोबियल के लिए एक उपयुक्त मंच हैं रोगज़नक़ संक्रमण अध्ययन और ऐसे माइक्रोस्कोपी, transcriptomics, और प्रोटियोमिक् के रूप में लागू बहाव के विश्लेषण ।

Protocol

1. पूर्व vivo संक्रमण मध्यम और उपकरण बाँझ शर्तों के तहत, ताजा Drosophila Hemocyte अलग मध्यम (धिम) 25% भ्रूण गोजातीय सीरम (Drosophila) और फिल्टर के साथ ७५% Schneider के FBS माध्यम से युक्त तैयार करें । परत एक stereomicroscope के तह?…

Representative Results

पूर्व vivo संक्रमण के लिए लाइव hemocytes इकट्ठा करने के लिए, अप करने के लिए 3 × 106 hemocytes २०० Drosophila 3rd instar लार्वा से निकाले गए थे । हमारी विधि विकसित करने के लिए, विभिंन तकनीकों का एक नंबर का प्रया…

Discussion

बेहतर समझने के लिए कैसे मेजबान कोशिकाओं संक्रमित हो जाते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं में रोगज़नक़ के स्थानीयकरण स्पष्ट है, खासकर जब पहले untested रोगज़नक़ और सेल प्रकार संयोजन पर प्रयोग कर4। ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम mCherry-एक्सप्रेस Coxiella burnetiiके स्टॉक्स प्रदान करने के लिए डॉ रॉबर्ट Heinzen के आभारी हैं । हम Invertebrate इंद्रधनुषी वायरस 6 प्रदान करने के लिए Dr. Luis Teixeira और ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र फ्लाई स्टॉक प्रदान करने के लिए धंयवाद । इस परियोजना के हिस्से में NIH ग्रांट R00 AI106963 (A.G.G. को) और वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii – mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9 (10), 1003720 (2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85 (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7 (4), 34721 (2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10 (8), 0136593 (2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419 (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3 (11), 173 (2007).
  20. . Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11 (11), 0166088 (2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286 (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0150910 (2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143 (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358 (6360), 194-199 (2017).

Play Video

Cite This Article
Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

View Video