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Immunology and Infection

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57077
Automatic Translation
1, 2, 1
1School of Molecular Biosciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Integrative Physiology and Neuroscience, College of Veterinary Medicine, Washington State University

Summary

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Abstract

Durante l'infezione patogena di Drosophila melanogaster, emociti gioca un ruolo importante nella risposta immunitaria durante l'infezione. Così, l'obiettivo del presente protocollo è di sviluppare un metodo per visualizzare l'invasione di agente patogeno in un apposito comparto immune di mosche, vale a dire emociti. Utilizzando il metodo presentato qui, fino a 3 × 106 live emociti sono ottenibili da 200 drosofila 3rd instar larve in 30 min per infezione ex vivo . In alternativa, emociti possono essere infetti in vivo attraverso l'iniezione di 3rd instar larve seguita da estrazione di emociti post-all'infezione 24 h. Queste cellule primarie infette sono stati corretti, macchiato e imaging utilizzando la microscopia confocale. Quindi, rappresentazioni in 3D sono stati generati da immagini per mostrare definitivamente l'invasione dell'agente patogeno. Inoltre, può essere ottenuto RNA di alta qualità per qRT-PCR per la rilevazione delle seguenti mRNA patogeno infezione e sufficienti proteine possono essere estratte da queste cellule per l'analisi Western blot. Presi insieme, presentiamo un metodo per la riconciliazione definitiva dell'invasione di agente patogeno e conferma dell'infezione utilizzando tipi di agente patogeno batterico e virale e un metodo efficiente per l'estrazione di emociti per ottenere abbastanza emociti dal vivo dalla drosofila larve per esperimenti di infezione ex vivo ed in vivo .

Introduction

Drosophila melanogaster è un organismo modello consolidata per lo studio della immunità innata1. Durante la risposta immunitaria innata, emociti gioca un ruolo importante nella risposta alla sfida di agente patogeno. Emociti sono critici per incapsulare i parassiti, oltre ad avere una funzione importante nella lotta contro l'agente patogeno attraverso azione fagocitica durante infezione fungine, virali e batteriche2,3.

Al fine di meglio comprendere la risposta immunitaria innata dell'ospite all'infezione microbica patogena, è importante visualizzare come l'agente patogeno invade le cellule dell'ospite durante l'infezione. Questa visualizzazione contribuisce alla comprensione del meccanismo di invasione. Insieme ai dettagli della localizzazione intracellulare di agente patogeno e la risposta cellulare, questi dati possono fornire indizi circa la risposta dell'ospite all'infezione ed organelli cellulari con cui interagisce il microbo. Così, la ricostruzione del modello 3D dopo formazione immagine di microscopia può essere utile per determinare l'esatta posizione di agenti patogeni e cellule ospiti. In questo studio, abbiamo visualizzato l'invasione della Coxiella burnetii (c. burnetii), l'agente eziologico della febbre Q, una malattia zoonotica che rappresenta una grave minaccia per la salute umana e animale, in primarie emociti di Drosophila . Recentemente, è stato dimostrato che Drosophila sono sensibili al livello di biosicurezza 2 fase di Nine Mile II (NMII) clonare 4 ceppo di c. burnetii e che questo ceppo è in grado di replicare in drosofila4, che indica che Drosofila può essere utilizzato come organismo modello per studiare la patogenesi da c. burnetii .

Gli studi precedenti hanno usato emociti di esaminare la risposta immunitaria innata dell'ospite. Emociti sono stati utilizzati per osservazioni morfologiche5,6,7, analisi morfometrica2,8, fagocitosi analisi2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitazione10,11, analisi immunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Anche se le cellule della drosofila S2 sono anche disponibile per vari esperimenti in vitro , immortalizzazione e potenziale pre-esistente infezione virale cambiare loro comportamento15,16. L'utilizzo di cellule primarie al contrario di una linea di cellule immortalizzate, quali cellule S2, consente lo studio della funzione immune innata in un sistema più rappresentativo dell'intero organismo. Inoltre, l'infezione di emociti in vivoprima dell'estrazione, permette alle cellule di interagire con altre proteine ospite ed il tessuto, un vantaggio sopra estrazione di emociti prima dell'infezione ex vivo . Un numero di metodi differenti è stato utilizzato per ottenere un numero sufficiente di emociti in un breve periodo di tempo per mantenere l'emociti vivo8,17,18,19.

In questo studio, presentiamo un metodo per estrarre emociti da Drosophila 3rd instar larve per infezione microbica patogena con da c. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) o invertebrato iridescente Virus 6 (IIV6). Descriviamo i metodi per le infezioni di emociti sia in vivo ed ex vivo . In vivo- ed ex vivo-emociti infetti sono stati visualizzati con microscopia confocale e utilizzati per creare modelli 3D di invasione da c. burnetii . Inoltre, utilizzando il protocollo di estrazione, ex vivo-emociti infetti sono stati utilizzati per l'espressione genica e proteica saggi. In particolare, per esaminare l'estensione dell'infezione con IIV6 e Listeria, RNA o la proteina totale è stata isolata dalle cellule per qRT-PCR o analisi Western blot. Presi insieme, il protocollo fornisce i metodi per raccogliere rapidamente un numero elevato di emociti da 3rd instar larve e prove che primari emociti, infetto in vivo o ex vivo, sono una piattaforma adatta per microbica agente patogeno infezione studi e analisi applicabili a valle quali microscopia, trascrittomica e proteomica.

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Protocol

1. infezione ex vivo

  1. Medium e attrezzature
    1. In condizioni di sterilità, preparare fresco Drosophila emociti isolamento medio (DHIM) contenente di 75% Schneider Drosophila medie con 25% siero bovino fetale (FBS) e filtro sterilizzarlo.
    2. Strato 2-3 pezzi di pellicola di paraffina di 10 x 10 cm sotto un microscopio stereoscopico.
    3. Preparare il capillare di vetro. Impostare la stufa capillare estrattore al 55% del massimo. Tirare il tubo capillare di una punta acuminata di circa 10 µm.
    4. Recupero di informazioni del capillare con olio minerale.
    5. Assemblare il tubo capillare riempito sul nanoinjector (Figura 1A) e aprire punta fuso tubo capillare rompendo fuori la punta con il forcipe (Figura 1B). Il diametro esterno della punta dovrebbe essere 100 µm per facile assorbimento degli emociti.
    6. Espellere tanto olio quanto possibile dalla punta tubo capillare, quindi riempire con DHIM. Per una visualizzazione semplice del bordo dell'emolinfa up-preso e l'olio, includono una bolla d'aria tra l'olio e DHIM (Figura 1B').
  2. Estrazione di emolinfa
    1. Scegli 3rd instar larve di Drosophila dall'interno muro di cibo fiale delicatamente usando il forcipe e inserirli in un colino di 100 µm (Figura 1C). 3rd instar larve si trovano 3-6 giorni successivi fertile uova da una femmina adulta.
      Nota: Questi esperimenti usato il genotipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, poiché emociti da questi animali esprimono la proteina fluorescente verde avanzata (EGFP) per aiutare nella identificazione delle cellule mediante microscopia.
    2. Versare 5 mL di acqua sterile sopra larve e scuotere il filtro per 5 s. posto il filtro sulla cancellazione di attività eliminare l'acqua in eccesso (Figura 1C').
    3. Trasferire le larve in una microcentrifuga da 1,5 mL. Anestetizzare li con CO2 gas per 5 s (Figura 1D).
    4. Posizionare le larve sulla pellicola di paraffina sotto lo stereomicroscopio, con il dorso rivolto verso l'alto (Figura 2A).
    5. Luogo il vetro capillare leggermente sul corpo posteriore larvale per tenerlo in posizione e disturbare la cuticola posteriore aperto utilizzando una pinzetta appuntita (Figura 2B).
    6. Consentire l'emolinfa di fluire sulla pellicola paraffina (Figura 2C).
    7. Rendere un pool di emolinfa compreso emociti da larve di 20-50 alla volta sul film di paraffina.
    8. Prendere l'emolinfa pool utilizzando il vetro capillare su nanoinjector (Figura 2D).
      Nota: Ci dovrebbe essere di circa 10-20 µ l di emolinfa.
    9. Espellere l'emolinfa in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 500 µ l di DHIM (Figura 2E).
    10. Ripetere i passaggi da 1.2.4) - 1.2.9) per ogni batch di larve.
  3. Contare il numero di emociti.
    1. Pipettare 5 µ l di soluzione di blu di Trypan 0,4% in un tubo del microcentrifuge 0,6 mL a macchiare le cellule morte. Delicatamente mescolare il DHIM ed emociti nel tubo da 1,5 mL utilizzando una pipetta e trasferire 5 µ l di DHIM tra cui emociti al tubo del microcentrifuge 0,6 mL e mescolare delicatamente.
    2. Pipettare 10 µ l di cellule da miscela 1:1 di Trypan blu: emociti nell'emocitometro.
    3. Contare il numero di emociti dal vivo che non sono macchiati con Trypan blu in ogni campo 4 angolo dell'hemocytomter e calcolare la concentrazione di emociti per millilitro usando la formula:
      Equation 1
      dove X è la concentrazione di emociti live per millilitro; a, b, c e d sono contato il numero di cellule vive (come determinato dall'esclusione del Trypan blu) in ogni 4 dei campi nell'emocitometro. Divisione per 2 il numero totale di cellule contate è dovuto alla diluizione di 1:1 delle cellule con Trypan blue. Le cellule colorate con Trypan blue sono considerate morte.
  4. Ex vivo Infezioni
    1. Determinare il numero di pozzetti di essere seminato con celle basate su punti temporali e biologico replica necessario per ogni esperimento. 5.0 × 104 emociti sono desiderabili per la purificazione di RNA e proteine dopo l'infezione.
    2. Calcolare il volume di stock di agente patogeno essere diluiti con DHIM per infezione utilizzando la seguente formula:
      Equation 2
      dove molteplicità di infezione (MOI) è il numero di virali o batteri desiderato per ogni cella.
      Nota: MOI utilizzato dipende dal singolo esperimento e analisi eseguite. Qui, 10 equivalenti di genoma (GE) / cellula di c. burnetii, 10 CFU/di Listeriao 1 TCID50valore di IIV6 è stato usato.
    3. Preparare 500 µ l di terreno di agente patogeno per ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti aggiungendo un volume adeguato di DHIM al volume virale o batterico in un tubo.
    4. Posto un 12 millimetri rotonda copertura in vetro (spessore n ° 1) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
    5. Dividere il DHIM compreso gli emociti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
    6. Aggiungere 500 µ l di terreno di agente patogeno di emociti in un pozzo.
    7. Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min.
    8. Incubare la piastra per 1 h a 28 ° C. Ogni 15 min, inclinare delicatamente la piastra dalla parte posteriore a anteriore, quindi da sinistra a destra per 5 s a mano.
    9. Dopo 1 h di passaggio invasione/allegato 1.4.8), delicatamente Pipettare fuori il mezzo di agente patogeno e lavare gli emociti con DHIM fresco e riempirlo con 500 µ l di DHIM fresca.
    10. Incubare gli emociti infetti per il tempo desiderato. In questi esperimenti, da c. burnetii- o IIV6-infettati emociti vengono incubati per 24 h e Listeria-emociti infetti vengono incubate per 1, 2 o 4 h.

2. infezione in vivo

  1. Infezione
    1. Caldo il piatto di agar succo frutta Drosophila a temperatura ambiente per 15 min. piastre sono realizzati come precedentemente descritto20.
      1. Aggiungere 30 g di agar a 700 mL di acqua e autoclave per 40 min.
      2. Sciogliere 0,5 g di paraben metilico in 10 mL di etanolo assoluto.
      3. Aggiungere la soluzione di paraben metilico in 300 mL di succo di frutta concentrato.
      4. Mescolare il succo concentrato nella soluzione agar sterilizzato nell'autoclave e pipettare 5 mL in 10 × 35 mm piastre Petri rapidamente.
      5. Dopo le piastre sono raffreddati per 15 min, conservarli a 4 ° C.
    2. Preparare 3rd instar larve come segue 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Posizionare la pasta di lievito su una piastra di agar. Fare un taglio sottile nella piastra di agar dove le larve possono migrare per evitare la disidratazione (Figura 3A). Montare un ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm con che tiene il forcipe usando la pellicola di paraffina (Figura 3B, C).
    4. Pipettare 50 µ l di alto-titolo mCherry esprimenti -da c. burnetii (5.95 × 109 GE/mL) sulla paraffina della pellicola sotto il microscopio stereo e posizionare le larve nella piscina di batteri.
    5. Posizionare le larve nella piscina di batteri. Pungere le larve con un ago di tungsteno (Figura 3D). Trasferire le larve su una piastra di agar (Figura 3E).
    6. Trasferire il restante mezzo agente patogeno sulla piastra di agar e sigillare la piastra con la pellicola di paraffina.
    7. Mantenere le larve sulla piastra in aria umida fino a quando post-l'infezione tempo desiderato (Figura 3F). In questo esperimento, da c. burnetii-larve infette sono sul piatto per 24 h.
  2. Estrazione di emolinfa e placcatura di emociti
    1. Preparare il mezzo e attrezzatura seguendo passo 1.1).
    2. Posto un 12 millimetri rotonda copertura in vetro (spessore n ° 1) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Pipettare 500 µ l di DHIM nel pozzo.
    3. Estrarre l'emolinfa dalle larve infette come segue 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Espellere l'emolinfa in seguito di ben punto 2.2.2).
    5. Ripetere 2.2.3) e 2.2.4) per più gruppi di larve.
    6. Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 5 min.

3. visualizzazione

  1. Fissazione e colorazione
    1. Dopo aver consentito l'emociti di stabilirsi sul vetro di copertura rotondo nel pozzo, rimuovere delicatamente il mezzo da ogni pozzetto.
    2. Delicatamente aggiungere 200 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) in ciascun pozzetto di emociti depositati. Incubare gli emociti per 20 min a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere il 4% PFA e delicatamente aggiungere 200 µ l di PBS contenente 0,1% Triton X-100 e 1% albumina di siero bovino (BSA) in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 10 min a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il PBS e delicatamente aggiungere 200 µ l di 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 10 min al buio a temperatura ambiente.
    5. Rimuovere la soluzione DAPI e aggiungere delicatamente PBS in ciascun pozzetto. Incubare gli emociti per 5 min a temperatura ambiente.
    6. Goccia 10 µ l del mezzo di montaggio antifade su un vetrino per microscopio.
    7. Dopo aver rimosso il PBS da ogni pozzetto, è necessario rimuovere il vetro di copertura dalla piastra 24 pozzetti utilizzando forcipe ammenda-aguzzo. Posizionare delicatamente il vetro di copertura sul supporto montaggio antifade su vetrino, con gli emociti rivolto verso il basso.
    8. Lasciar asciugare inserendolo nella notte scura.
  2. Formazione immagine confocal
    1. Configurare il microscopio confocale per formazione immagine di DAPI, EGFP e mCherry tre di colore. Utilizzare la seguente impostazione: eccitazione DAPI (ex) 405 nm, emissione (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Posizionare il campione sul microscopio e messa a fuoco sul campione utilizzando un 63 X / 1.4 obiettivo apertura numerica (NA). Individuare gli emociti desiderati nel campo di vista per l'imaging.
    3. Regolare i guadagni di potenza e rilevatore laser per ottenere esposizione appropriata del campione. Verifica z-piani multipli per garantire che il livello di esposizione è appropriato per lo spessore dell'intero campione.
    4. Trovare la posizione superiore e inferiore sull'asse z di un intero emociti. Impostare queste posizioni come le posizioni di inizio e di fine per il sezionamento di z.
    5. Utilizzare solo scansione zoom all'immagine l'area che contiene l'emociti. Spesso vengono utilizzati fattori di zoom di 3x.
    6. Raccogliere la serie di immagini a risoluzione appropriata come 1024 x 1024 pixel nel piano x-y e 0,3 µm spaziatura nella dimensione z.
  3. Ricostruzione del modello 3D
    Nota: Il software Open source esistente che esegue molte delle funzioni descritte di seguito per la ricostruzione del modello 3D.
    1. Importare il file di serie z-sezionato immagine nel software associato con il microscopio confocale per la ricostruzione del modello 3D.
    2. Selezionare una cella risultati co-localizzazione dei nuclei macchiato con DAPI e mCherry esprimendo da c. burnetii in un EGFP esprimendo emociti. Ritagliare l'immagine in serie per contenere solo la singola cella.
    3. Selezionare l'opzione Visualizzatore 3D che ricostruisce il modello 3D utilizzando pre-confezionati algoritmo del software. Scegliere il tipo di rappresentazione 3D tra Blend, superficie e opzioni miste desiderato. In questo metodo, emociti, nei nuclei e da c. burnetii sono illustrati utilizzando modelli di superficie.
    4. Osservare la cella ricostruita 3D da diverse angolazioni di visualizzazione tenendo premuto il pulsante del mouse e trascinando il cursore sullo schermo. Regolare l'orientamento della cella e la posizione della sorgente luminosa modellata per ottimizzare l'immagine. Esistono altre opzioni per opacità, minimo e massimo soglia, speculare, Ambient, Shineness e Gamma per ottimizzare l'immagine.
    5. Prendere le sezioni trasversali attraverso il modello utilizzando i comandi di clipping e sezionamento per visualizzare il contenuto interno degli emociti.

4. l'applicazione per l'analisi genica e/o proteine

  1. Dopo l'infezione con IIV6 e Listeria, lisare cellule per successive qRT-PCR o analisi Western blot come precedentemente descritto21 e le istruzioni del produttore riportato di seguito.
    Nota: Consultare la Tabella dei materiali per i primers per qRT-PCR e gli anticorpi per la macchia occidentale.
  2. Analizzare i prodotti di PCR di elettroforesi del gel dell'agarosi, come descritto in precedenza22, per garantire la corretta lunghezza del prodotto amplificato.

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Representative Results

Per raccogliere vivere emociti per infezione ex vivo , fino a 3 × 106 emociti sono stati estratti da 200 drosofila 3rd instar larve. Per sviluppare il nostro metodo, una serie di diverse tecniche sono stata tentata. Dissezione larvale individuale sarebbe prendere fino a 1,5 h, e una media di ~ 8000 cellule sono state ottenute utilizzando questo metodo18, la maggior parte dei quali non erano viva alla fine della raccolta. Successivamente, abbiamo cercato di estrarre l'emolinfa, che conteneva gli emociti, materiale e l'emolinfa da 20 larve in un momento usando un tubo capillare di vetro19, ma il capillare è diventato intasato con cuticola non era in grado di essere ripreso in modo efficiente al bicchiere capillare. Infine, abbiamo meccanicamente interrotta la cuticola delle larve di 20-50 per ogni batch con una pinzetta12e fatto un pool di emolinfa di facile assorbimento. Questo ha permesso la facile raccolta di una grande quantità di emociti da un gran numero di larve (tabella 1).

Per indicare che gli emociti estratti erano vivi e adatto per l'infezione, è stata eseguita un'analisi di esclusione del blu di Trypan per calcolare la percentuale di emociti live estratto utilizzando il metodo qui presentato (Figura 6A). Inoltre, abbiamo confrontato il nostro metodo per l'estrazione di emociti con un metodo precedentemente pubblicato dove l'obiettivo era quello di sviluppare un metodo di rottura meccanica per isolare e differenziare tra circolanti e residenti emociti da individuo Drosophila della larva23. Dopo il confronto tra i due metodi da 10 isolamenti sperimentali indipendenti, abbiamo osservato che l'attuabilità delle cellule era leggermente maggiore utilizzando il metodo qui presentato (Figura 6A); Tuttavia, il metodo da Petraki et al. ha prodotto vicino due volte altretanti emociti da ogni 10 larve dissecate (Figura 6B). Un motivo per l'aumento del numero di emociti dall' Petraki et al. Metodo è che questo metodo raccoglie residente emociti (sessili), come pure emociti circolanti. Per confermare che le cellule estratte con il metodo presentato qui erano infatti emociti, abbiamo utilizzato una linea di volo contenente transgeni per il promotore di hemolectin (Hml) guida GAL4 in emociti di circolazione che lega la sequenza di attivatore a Monte (UAS) per attivare migliorata della proteina fluorescente verde (EGFP) trascrizione ed espressione negli emociti. Emociti da hml-GAL4 > UAS-EGFP larve sono stati estratti sui vetrini coprioggetto chambered, fissati, permeabilized e macchiato con DAPI come precedentemente descritto21. La figura 7 Mostra che la maggior parte delle cellule di DAPI-positive sono anche EGFP-positivi. Quantificazione di co-espressione è stato effettuato da più immagini, da cui abbiamo calcolato che 86±9% delle cellule isolate erano emociti.

Il protocollo in 3D innovativi modelli di invasione di agente patogeno in Drosophila emociti estratte da 3rd instar larve dopo l'infezione ex vivo o da c. burnetii in vivo . Siamo stati in grado di infezione da c. burnetii di immagine, poiché i batteri esprimono mCherry. Dopo emociti infetti erano fissi e macchiati, essi erano imaged per DAPI, EGFP e mCherry usando la microscopia confocal. Tassi di infezione di emociti, come determinato dalla percentuale di cellule positive EGFP che inoltre hanno esibito mCherry segnale, per le infezioni sia ex vivo ed in vivo C. burnetii era quasi al 100%. Questo era previsto poiché un MOI di GE/cella 10 è stato usato per ex vivo l'infezione, che dovrebbe provocare l'infezione del 100% di cellule24. Per quanto riguarda le infezioni in vivo , poiché le larve sono collocate in una goccia di alto-titolo di mCherry esprimenti -da c. burnetii (5.95 × 109 GE/mL), il numero di batteri è approssimativamente 10,000-fold superiore al numero di emociti a larva. Di conseguenza, si prevede un tasso di infezione del 100% per le infezioni in vivo .

Successivamente, Z-sezioni sono stati raccolti attraverso gli emociti, per visualizzare l'intera cella in 3D e per confermare la presenza di c. burnetii all'interno della cella. La figura 4 Mostra trasparente sezioni trasversali di un emociti (in verde) con c. burnetii (in rosso) visto all'interno della cella. Le immagini sono state ricostruite anche in un modello 3D (Figura 5) che rappresentano le superfici del emociti e da c. burnetii, mostrando di nuovo da c. burnetii all'interno della le emociti. È interessante notare che, in vivo-emociti infetti hanno esibito le estensioni citoplasmiche maggiore e sono stati più piatta in natura, mentre ex vivo-emociti infetti erano più sferica (Figura 5). Questo potrebbe indicare una popolazione maggiore di lamellocytes nel vivo-popolazione e plasmatocytes in ex vivo popolazione7infetti. Mentre lamellocyte differenziazione viene generalmente indotta durante la Vespa parassita infezione25, ferimento delle larve di Drosophila è anche sufficiente per indurre la differenziazione di lamellocyte26. Infine, mentre non utilizzati negli esperimenti presentati qui, ci sono forme che esprimono GFP di Listeria27 e IIV628 che potrebbero essere utilizzati per generare modelli 3D di infezione di emociti. Invece, Listeria- e IIV6-infettati emociti sono stati usati per esperimenti Western blotting e qRT-PCR.

Utilizzando il metodo presentato qui, infezioni vengono eseguite sia ex vivo ed in vivo per l'imaging. Inoltre, analisi di mRNA e proteina patogeno seguito ex vivo infezioni. In particolare, emociti estratti sono stati infettati con IIV6 e sono stati applicati all'analisi di qRT-PCR. Ha mostrato i livelli elevati significativamente di IIV6-193R, un gene virale che codifica per un presunto inibitore dell'apoptosi29, tra cellule mock - e IIV6-infettate (Figura 8A). L'elettroforesi dei prodotti amplificati ha confermato la presenza di una banda per il prodotto del gene di IIV6-193R nel campione infetto, ma non il campione mock-infettati (Figura 8B). Amplificato bande per il controllo di RpII endogeno sono stati trovati in tutti i campioni, e l'infezione di IIV6 in cellule S2 sono state eseguite come controllo positivo. Poiché le infezioni IIV6 sono state eseguite a un valore di MOI di 1 TCID50, circa il 50% delle cellule dovevano essere infettato, basato sulla distribuzione di Poisson24.

Proteine totali da mock - o Listeria -infettati emociti è stato raccolto a 1, 2 e 4 h post-infezione e concentrazione nella proteina è stata determinata mediante analisi di bicinconinico acido (BCA). 100% delle cellule dovevano essere infetti ex vivo , poiché il MOI era 10 CFU/cella24. Macchiarsi occidentale conferma la presenza di Listeria-derivati prodotti proteici in emociti infetti, con gli alti livelli raggiunti da post-infezione 4h (Figura 9). Inoculo di Listeria è utilizzato come controllo positivo per l'individuazione di Listeria-bande specifiche. La presenza di actina è illustrata negli esempi emociti di confermare i livelli della proteina di caricamento. Presi insieme, questi risultati indicano che gli emociti estratti utilizzando il metodo presentato qui erano adatti per entrambi gli esperimenti di infezione virale e batterica.

Figure 1
Figura 1 : Struttura di attrezzature e materiali utilizzati per l'estrazione di emociti. Attrezzature in primo luogo è stata preparata prima della dissezione. A) il vaso capillare di vetro tirato è stato inserito il nanoinjector dopo essere stato retro-riempito con olio minerale. B) la punta fusa del vaso capillare di vetro era rotto con il forcipe per creare un diametro esterno di 100 µm. B) DHIM è stato ripreso dal capillare per evitare la contaminazione delle cellule e bolle d'aria sono state introdotte per operare una netta distinzione tra olio e DHIM. C) le larve sono prelevate da cibo fiale e inserite in un colino di cella. C') le larve vengono lavate in acqua sterile e l'acqua viene rimossa con un panno da attività, D) le larve sono trasferite in un tubo del microcentrifuge e anestetizzate con CO2 gas. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Timeline e flusso grafico per l'estrazione di emociti. A) le larve sono sul loro lato dorsale prima di aprire la cuticola. B) la cuticola è interrotta con una pinzetta appuntita e l'ago capillare. C) l'emolinfa è bled sulla pellicola di paraffina. D) piscine di emolinfa da 20-50 larve sono presi con il capillare in vetro e nanoinjector. E) l'emolinfa ed emociti vengono trasferiti in un tubo del microcentrifuge contenente 500 µ l DHIM essere contato con un emocitometro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: In vivo infezione. A) frutta Drosophila succo piastre di agar e pasta di lievito vengono utilizzati per l'incubazione di larve in vivo infettata. Tagli sono fatti nella piastra di agar per facilitare la longevità di larve (frecce grigie). B) un ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm è attaccato al forcipe usando la pellicola di paraffina. C) la punta dell'ago di tungsteno appuntito di 0,001 mm. D) la larva è punto con ago di tungsteno nel pool del patogeno la pellicola di paraffina sotto il microscopio stereo. E) le larve ritte sono posti sulla piastra di agar. F) la piastra è sigillata con la pellicola di paraffina e mantenuta sui tovaglioli di carta umida nel contenitore fino al momento opportuno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Le sezioni trasversali dell'invasione del patogeno negli emociti. Sezioni estratte dalla scansione confocale 3D di emociti agente patogeno-infettato. A, B) xy-sezioni Mostra da c. burnetii (nel colore rosso contrassegnato con punte di freccia bianche) all'interno dell'emociti. Le punte di freccia grigi mostrano i nuclei di emociti. A', una ", B') viste tra cui yz e xz sezione immagini mostrano l'invasione di c. burnetii in emociti da 2 punti di visualizzazione aggiuntive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Modelli 3D di invasione del patogeno negli emociti. Modelli 3D ricostruiti dell'invasione da c. burnetii negli emociti vengono generati dopo l'infezione ex vivo ed in vivo . Modello può essere ruotato liberamente utilizzando il software; qui 6 punti di visione sono mostrati con l'emociti in verde, da c. burnetii in rosso (frecce bianche) e il nucleo in blu (punte di freccia grigia). Sono indicate anche le immagini di sezione trasversale mostrando all'interno delle cellule invase di agente patogeno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : La percentuale e la popolazione di emociti live. Emociti sono stati estratti da gruppi di larve instar 10 3rd utilizzando il metodo di Petraki et al e il metodo presentato qui. A) la percentuale degli emociti dal vivo è stata calcolata per ogni tecnica dall'analisi di esclusione del blu di Trypan. B) la popolazione totale di emociti è stata confrontata fra le due tecniche. I grafici a barre rappresentano la media ± deviazione standard da N = 10 replicati biologici con il metodo di estrazione e dosaggio di tipo. P-valori sono indicati dalla varianza assumendo T-test di uno studente a due code. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Immagini di emociti estratti utilizzando il driver hemolectin. Emociti sono stati estratti da 80 larve di w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} a H2. Il promotore per Hml unità GAL4 circolanti emociti, che lega UAS per attivare espressione e trascrizione di EGFP. Gli emociti erano fissi e macchiati con DAPI come descritto in precedenza20. Emociti sono montate su vetrini coprioggetti chambered e ripreso da contratto differenziale di interferenza (DIC) e microscopia a fluorescenza. Il canale blu indica il nucleo colorato con DAPI e il canale verde indica gli emociti che esprimono EGFP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8 : qRT-PCR ed elettroforesi su gel. L'espressione del gene IIV6-193R è stata osservata mediante qRT-PCR soltanto negli emociti IIV6-infettati. A) 193R espressione genica era normalizzata per il controllo interno, RpII e presentato come un rapporto. Il numero di cicli per l'emociti mock-infettati è stato fissato arbitrariamente un numero di ciclo massimo di 40 per l'analisi poiché 193R non è stata rilevata in questi campioni. Dati rappresentano la media ± deviazione standard da N = biologici 3 ripetizioni per ogni gruppo. Il P-value indica un due code test di Student T-supponendo che la varianza. B) i prodotti di qRT-PCR sono mostrati mediante elettroforesi su gel di agarosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9 : Analisi Western Blot. L'espressione degli antigeni di Listeria e actina in mock - e Listeria-emociti infetti da 3rd instar Drosophila larve a 1, 2 e 4 ore post-infezione (p.i.) sono determinate mediante Western blotting. Concentrazioni di proteine totali sono state determinate mediante l'analisi di (BCA) acido bicinconinico per normalizzare la quantità totale di proteina caricata in ogni corsia del gel. Inoculo utilizzato per infettare gli emociti era utilizzato come un campione di controllo positivo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Metodo. Numero medio di larve
per l'estrazione di emociti		 Numero medio di emociti totale
emolinfa
estrazione capillare
(questo metodo)		 192.44 (SD: 86.05) 4,56 x 105 celle (SD: 5,83 x 105)
(Gamma: 70-390, N = 25 prove) (Gamma: 1.20 x 105 - 2.95 x 106 cellule)
individuali
dissezione di larve		 26,67 (SD: 11,55) 8,33 x 103 celle (SD: 6,66 x 103)
(Range: 20-40, N = 10 prove) (Gamma: 4,00 x 103 - 1,60 x 104 celle)
larvale
capillare estrazione *		 N/A * N/A *
* emociti erano in grado di essere estratta usando questo metodo a causa di intasamento dell'ago capillare

Tabella 1: numero di dissecato larve ed estratte utilizzando diverse tecniche di emociti. I numeri medii di larve dissecate ed emociti estratti sono stati confrontati fra il metodo presentato qui e altri metodi. Il nostro metodo ha provocato la raccolta di un numero maggiore di larve ed emociti. Il metodo di estrazione capillare larvale è stato anche tentato, ma emociti erano in grado di essere estratti a causa di intasamento della punta del capillare.

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Discussion

Per comprendere meglio come cellule dell'ospite infettate, è importante chiarire la localizzazione dell'agente patogeno nelle cellule, soprattutto quando si sperimenta il patogeno non precedentemente testato e cella tipo combinazioni4. Mentre studiando la cascata di risposta cellulare dopo l'infezione può indicare invasione produttivo dell'agente patogeno, la combinazione dei dati di risposta cellulare e imaging è essenziale per dimostrare l'infezione e l'invasione dell'agente patogeno. Mentre i rapporti che mostrano immagini 2D dell'invasione di agente patogeno in cellule dell'ospite tende a indicare l'infezione produttiva, alcune domande possono rimanere per quanto riguarda la tempistica dell'invasione di agente patogeno iniziale nelle cellule ospiti. Così, ricostruito da z-sezione scansione di immagini 2D in 3D può rispondere a queste domande e indicare la posizione di agente patogeno nelle cellule ospiti (figure 4 e 5). Tuttavia, una limitazione dell'utilizzo di emociti primarie è la loro longevità nella coltura delle cellule. Un rapporto precedente afferma che emociti sopravvivenza in terreni di coltura delle cellule è solo 8 h18, e nel nostro protocollo di infezione, siamo stati in grado di effettuare dosaggi fino a 24 h, ma non più. Di conseguenza, non era possibile osservare elevati livelli di c. burnetii replica o la formazione del vacuolo parassitoforo che non iniziano a formarsi fino a 2 giorni post-infezione e non è osservabile grandi fino a 4-6 giorni dopo l'infezione30 .

Per molti esperimenti dove i saggi di endpoint utilizzano RNA o proteine per l'analisi, un numero elevato di celle è richiesti solitamente per produrre materiale sufficiente per l'interrogatorio. Ad esempio, qui, usiamo analisi dell'endpoint come Western blotting e qRT-PCR per sondare l'estensione dell'infezione del patogeno in primarie emociti derivato da 3rd instar larve di Drosophila . Così, il metodo qui presentato si concentra sulla dissezione larvale rapida e la raccolta di emolinfa contenente emociti sufficiente dal vivo per l'infezione ex vivo dell'agente patogeno. Questo metodo introduce l'uso di un nanoinjector a prendere l'emolinfa ed emociti rapidamente. Immissione gli emociti in DHIM contenente 25% FBS è importante per la sopravvivenza di emociti. Inoltre, per le infezioni ex vivo qui presentate, è necessari un gran numero di emociti. Per evitare di melanizzazione31,32,33, la dissezione e la collezione di emociti deve accadere rapidamente. Mentre esistono altri metodi per l'estrazione di emociti18,19,23, la durata di questi metodi per raccogliere un numero sufficientemente grande di emociti per ex vivo l'infezione era troppo lungo. La punta fine 100 µm è benefica per l'assorbimento di emolinfa senza occupare altri organi che possono portare all'occlusione dell'ago capillare. L'uso di un nanoinjector può essere automatizzato anche quando è collegato ad una fase di micromanipolatore e a pedale, permettendo all'utente di concentrarsi sulla rapida dissezione delle larve di Drosophila e diminuire il tempo che gli emociti sono senza circostante larvale terreni di coltura di tessuti o cellule. Tuttavia, l'uso di una pipetta è anche disponibile per prendere l'emolinfa per il trasferimento al DHIM. Inoltre, il nostro metodo utilizza gas di CO2 per anestetizzare le larve prima della dissezione; l'uso di un blocco freddo con film di copertura di paraffina è un altro metodo utilizzabile23. Infine, la dissezione delle larve in una goccia di DHIM durante il rilascio di emolinfa può ridurre il numero di emociti che vengono persi da attaccare alla pellicola di paraffina ma aumenterà il tempo necessario per l'assorbimento dall'ago capillare.

Una comune risposta immunitaria in drosofila alla ferita, che si verifica durante l'apertura e la dissezione della cuticola larvale, è melanizzazione31,32,33. Durante l'estrazione di emociti, sarebbe osserviamo melanizzazione di emociti nella DHIM già come 10 min dopo l'estrazione. Come melanizzazione è un processo rapido, queste cellule sarebbero esclusi dagli esperimenti di infezione del patogeno. Inoltre, l'anti-coagulante feniltiourea possa essere aggiunti a DHIM per inibire il sistema di attivazione di phenoloxidase e melanizzazione durante ferendo9. Tuttavia, come melanizzazione e apoptosi sono risposte immunitarie innate di Drosophila, i loro livelli possono essere quantificati dopo l'estrazione emociti e stimolazione utilizzando i metodi descritti qui.

Mentre recuperare grandi quantità di proteina o RNA materiale è un requisito per tecniche quali qRT-PCR e Western blot, nuove tecniche, come ad esempio RNAseq richiedono molto meno materiale, meno di 10 pg di alta qualità di RNA totale da una singola cella34. Esperimenti come questi sollevare questioni sperimentali interessanti, e poiché emociti di Drosophila sono una popolazione eterogenea che contiene cellule di cristallo, plasmatocytes e lamellocytes7, uno potrebbe cominciare ad interrogare la risposta di transcriptional di ogni cella tipo35. Per esempio, Kurucz et al., hanno sviluppato gli anticorpi che potrebbero essere utilizzati per isolare i sottoinsiemi di emociti di Drosophila che potrebbero essere utilizzati per trascrizionale o proteomica profilatura seguendo vari stimoli. Inoltre, il recente sviluppo della singola cella RNAseq tecnologia potrebbe definire trascrittomi di ogni tipo di cellula senza l'uso di anticorpi inizialmente separare ogni cella tipo36,37,38, 39. Inoltre, si potrebbe chiedere domande per quanto riguarda la regolazione genica nei sottoinsiemi di emociti che può aiutarci a capire come umano delle cellule del sangue lignaggi ha avuto origine e si è evoluto da antichi organismi attraverso la genomica comparativa gli sforzi. Affrontare problemi come questi richiede la combinazione di una vasta gamma di tecniche sperimentali, e la tecnica qui descritta può essere utile per tali sforzi quando l'isolamento di un gran numero di emociti dalle larve degli invertebrati è necessaria.

Qui, vi suggeriamo che la combinazione di 3D modelli con dati numerici, biochimici per la conferma dell'infezione. In futuro gli studi, possiamo usare i metodi descritti qui per osservare le risposte immunitarie e il meccanismo dell'invasione di agente patogeno nelle cellule ospiti macchiando co-proteine ospite per analisi di microscopia.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Siamo grati al Dr. Robert Heinzen per fornire scorte di mCherry-esprimendo il burnetii della coxiella. Ringraziamo il Dr. Luis Teixeira per la fornitura di invertebrati marini iridescente virus 6 e il centro di Stock di Bloomington per fornire scorte volare. Questo progetto è stato finanziato in parte dalla concessione di NIH R00 AI106963 (al A.G.G) e Washington State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

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