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Bioengineering

मानव वायुकोशीय Periosteum और विटामिन डी के Osteogenic गतिविधि पर Periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभाव से Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का अलगाव

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

हम periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पीडीसी) विटामिन सी (विटामिन सी) और 1, 25-dihydroxy विटामिन डी [1, 25-(OH)2डी3] से प्रेरित की mRNA अभिव्यक्ति के लिए एक प्रोटोकॉल की जांच करने के लिए मौजूद है । इसके अलावा, हम osteocytes, chondrocytes, और adipocytes में अंतर करने के लिए पीडीसी की क्षमता का मूल्यांकन ।

Abstract

Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) ऊतकों की एक किस्म में मौजूद है और osteoblasts सहित कई कोशिका प्रकार में विभेदित किया जा सकता है । MSCs के दंत सूत्रों के अलावा, periosteum एक आसानी से सुलभ ऊतक है, जो केंबियम परत में MSCs को नियंत्रित करने के लिए पहचान की गई है । हालांकि, इस स्रोत का अभी तक व्यापक अध्ययन नहीं किया गया है ।

विटामिन डी3 और 1, 25-(ओह)2डी3 osteoblasts में MSCs के विट्रो भेदभाव में उत्तेजित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, विटामिन सी कोलेजन गठन और हड्डी सेल विकास की सुविधा । हालांकि, अभी तक किसी अध्ययन ने MSCs पर विटामिन डी3 और विटामिन सी के प्रभाव की जांच नहीं की है ।

यहां, हम मानव वायुकोशीय periosteum से MSCs को अलग करने की एक विधि प्रस्तुत करते है और परिकल्पना की जांच करते है कि 1, 25-(OH)2डी3 इन कोशिकाओं पर एक osteoinductive प्रभाव डालती है । हम भी मानव वायुकोशीय periosteum में MSCs की उपस्थिति की जांच और स्टेम सेल आसंजन और प्रसार का आकलन । विटामिन सी की क्षमता का आकलन करने के लिए (एक नियंत्रण के रूप में) और 1 के विभिन्न सांद्रता, 25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8, और 10−7 मी) में कुंजी mRNA में परिवर्तन करने के लिए क्षारीय फॉस्फेट (ALP) की पृथक MSCs mRNA अभिव्यक्ति, अस्थि sialoprotein (बीएसपी), कोर बाइंडिंग फैक्टर अल्फा-1 (CBFA1), कोलेजन-1, और osteocalcin (OCN) वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) का उपयोग कर मापा जाता है ।

Introduction

हालांकि कई प्रासंगिक तकनीक हाल के वर्षों में विकसित किया गया है, अस्थि पुनर्निर्माण कई बाधाओं से सीमित रहता है, और आवश्यक पुनर्निर्माण की सीमा का आकलन अक्सर असंभव है । कठिन ऊतक वृद्धि के लिए एक अनुकूल दीर्घकालिक सफलता दर के अलावा दोनों esthetic और कार्यात्मक लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । आमतौर पर इस तरह की प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया तरीकों autogenous और allogenic हड्डी भ्रष्टाचार, xenografting, और alloplastic हड्डी भ्रष्टाचार में शामिल हैं । अस्थि भ्रष्टाचार के विभिन्न प्रकार के बीच, autogenous हड्डी भ्रष्टाचार सबसे प्रभावी माना जाता है । हालांकि, दाता साइट रुग्णता, समझौता संवहनी, और सीमित ऊतक उपलब्धता1 autogenous हड्डी भ्रष्टाचार के लिए प्रमुख कमियां किया गया है । इसके अलावा, allogenic अस्थि भ्रष्टाचार और xenografts रोग संचरण के साथ संबद्ध किया गया है । वर्तमान में, सिंथेटिक अस्थि भ्रष्टाचार व्यापक रूप से इन समस्याओं को हल करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, osteogenic क्षमता की कमी के साथ, नैदानिक परिणाम व्यापक रूप से अलग है । फाइबर जैसे सामग्री मात्रा अस्थिरता, संक्रमण, और शक्ति की कमी के साथ जुड़े रहे हैं ।

हड्डी वृद्धि ऊतक इंजीनियरिंग का उपयोग काफी रुचि पैदा की है । इस तकनीक में, mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (MSCs) शुरू में osteoblast भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, जो तो हड्डी की मरंमत की प्राप्त करने के लिए अस्थि नुकसान की साइट पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं । इस प्रक्रिया को वर्तमान में सेल थेरेपी में लागू किया जाता है । ऊतक की एक सीमित मात्रा में निकालने के द्वारा अस्थि पुनर्निर्माण को प्राप्त करने के अन्य तरीकों के साथ तुलना में सरल और कम इनवेसिव है.

सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक उपकरण के रूप में MSCs की संभावित भूमिका दंत पुनर्जनन के उद्देश्य से विभिंन अनुसंधान समूहों के बीच एक उभरती हुई रुचि है । अध्ययनों से पुष्टि की है कि MSCs ऊतक के निंनलिखित प्रकार से विभेदित किया जा सकता है: अस्थि मज्जा, वसा, श्लेष झिल्ली, pericyte, trabecular हड्डी, मानव गर्भनाल, और दंत ऊतक2,3। MSCs के सामांय स्रोतों अस्थि मज्जा, वसा ऊतक, और दंत ऊतक शामिल हैं । वसा ऊतक और अस्थि मज्जा से व्युत्पंन MSCs के साथ तुलना में, दंत स्टेम कोशिकाओं के लाभ आसान पहुंच और फसल कटाई के बाद कम रुग्णता हैं । भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के साथ तुलना में, MSCs दंत ऊतक से व्युत्पन्न nonimmunogenic दिखाई देते हैं और जटिल नैतिक चिंताओं के साथ संबद्ध नहीं हैं3.

२००६ में, सेलुलर थेरेपी के लिए अंतरराष्ट्रीय समाज MSCs की पहचान करने के लिए निम्नलिखित मानकों का उपयोग करने की सिफारिश की: पहला, MSCs प्लास्टिक के लिए संलग्न करने में सक्षम होना चाहिए. दूसरा, MSCs के लिए सकारात्मक होना चाहिए सतह एंटीजन CD105, CD73, और CD90 और monocytes के लिए मार्करों के लिए नकारात्मक, मैक्रोफेज, और बी कोशिकाओं के अलावा टेम एंटीजन CD45 और CD344. एक अंतिम कसौटी के रूप में, MSCs की मानक शर्तों के तहत कोशिकाओं के निंनलिखित तीन प्रकार में अंतर करने में सक्षम होना चाहिए इन विट्रो भेदभाव: osteoblasts, adipocytes, और chondrocytes4। तारीख करने के लिए, मानव दंत स्टेम सेल के छह प्रकार अलग किया गया है और विशेषता । पहले प्रकार मानव लुगदी ऊतक और जन्मोत्तर चिकित्सकीय लुगदी स्टेम कोशिकाओं को5से अलग किया गया था । इसके बाद, दंत MSCs के तीन अतिरिक्त प्रकार अलग किया गया है और विशेषता:6, periodontal बंधन7, और शिखर papilla8, छूटना पर्णपाती दांत से स्टेम कोशिकाओं । अभी हाल ही में, दंत कूप-व्युत्पंन9, मसूड़ों ऊतक-व्युत्पंन10, दंत कली स्टेम सेल (DBSCs)11, और periapical पुटी MSCs (hPCy-MSCs)12 भी पहचान की गई है ।

Friedenstein पहले MSCs13को परिभाषित किया गया था । MSCs एक उच्च प्रसार क्षमता प्रदर्शन और पहले अंतर करने के लिए किया जा सकता है प्रत्यारोपित, जो पता चलता है कि वे reअपक्षय प्रक्रियाओं के लिए आदर्श उंमीदवार है10।

हालांकि अधिकांश अध्ययनों से स्टेम सेल के एक स्रोत के रूप में अस्थि मज्जा का इस्तेमाल किया है, periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं (पीडीसी) भी हाल ही में इस्तेमाल किया गया है14. periosteum अधिक आसानी से सुलभ है से अस्थि मज्जा है । इसलिए, इस तकनीक में, हम सर्जरी के दौरान अतिरिक्त चीरा की जरूरत को खत्म करने और रोगियों में postsurgical रुग्णता को कम करने के लिए वायुकोशीय periosteum का उपयोग करते हैं । periosteum संयोजी ऊतक है कि लंबी हड्डियों के बाहरी अस्तर रूपों और दो अलग परतों शामिल है: बाहरी रेशेदार परत fibroblasts, कोलेजन, और लोचदार फाइबर से बना15, और भीतरी कोशिका-सीधे संपर्क में अमीर केंबियम परत हड्डी की सतह के साथ । केंबियम परत एक मिश्रित सेल जनसंख्या शामिल हैं, मुख्य रूप से fibroblasts16, osteoblasts17, pericytes18, और एक महत्वपूर्ण उपजनसंख्या MSCs19,20,21के रूप में पहचाना । अधिकांश अध्ययनों ने बताया है कि पीडीसी तुलना कर रहे हैं, तो बेहतर नहीं है, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (bMSCs) में अस्थि चिकित्सा और पुनर्जनन22,23,24. periosteum आसानी से सुलभ है और उत्कृष्ट पुनर्अपक्षय प्रभावशीलता दर्शाती है । हालांकि, कुछ अध्ययनों से periosteum25,26,27पर ध्यान केंद्रित किया है ।

हड्डी की मरंमत के बारे में, वर्तमान नैदानिक अभ्यास periosteal जनक सहायक पाड़ के भीतर परिलक्षित कोशिकाओं के प्रत्यारोपण शामिल है । हाल के अध्ययनों से दोषपूर्ण क्षेत्रों में स्टेम सेल प्राप्त करने और ऊतक पुनर्जनन20के लिए जनक कोशिकाओं को रोजगार पर ध्यान केंद्रित किया है । दंत चिकित्सक भी periodontal उपचार और दंत प्रत्यारोपण में periodontal अस्थि पुनर्जनन के भविष्य के आवेदन की आशा । दाता साइट के बारे में, periosteum आसानी से जनरल डेंटल सर्जन द्वारा काटा जा सकता है । यह मज्जा stromal कोशिकाओं के खिलाफ अनुकूल तुलना करता है, के रूप में periosteum नियमित मौखिक सर्जरी के दौरान पहुंचा जा सकता है । इस प्रकार, इस अध्ययन का उद्देश्य कटाई पीडीसी के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित करना और मानव periosteum स्टेम कोशिकाओं के आकृति विज्ञान, लगाव, व्यवहार्यता, और प्रसार का आकलन करना है ।

विटामिन डी चयापचयों vivo अस्थि-खनिज गतिशील संतुलन में प्रभावित करते हैं । एक अध्ययन ने बताया कि 24R, 25-(OH)2डी3 सक्रिय रूप विटामिन डी के मानव MSCs (hMSCs)28के osteoblastic भेदभाव के लिए आवश्यक है । अस्थि homeostasis और मरंमत विटामिन डी3 चयापचयों, जो की 1, 25-(OH)2डी3 (calcitriol) के एक नेटवर्क के द्वारा विनियमित है सबसे अधिक जैविक रूप से सक्रिय और अस्थि स्वास्थ्य के विनियमन में प्रासंगिक है । विटामिन डी3 पत्थराना29के लिए आवश्यक है । 2-d-पुराने कुनमिंग सफेद चूहों का उपयोग कर एक अध्ययन में, चूहों में embryoid निकायों ने संकेत दिया कि विटामिन सी और विटामिन डी की खुराक प्रभावी ढंग से ESC के भेदभाव को बढ़ावा दिया-प्राप्त osteoblasts30. इसके अंय जैविक गतिविधियों में, 1, 25-(OH)2डी3 को उत्तेजित करता है इन विट्रो hMSCs के भेदभाव osteoblasts को, जो alkaline फॉस्फेट (ALP) एंजाइम गतिविधि या OCN जीन में वृद्धि के आधार पर निगरानी की जा सकती है अभिव्यक्ति.

कुछ अध्ययनों से पता चला है एक खुराक-विटामिन सी और 1, 25 के साथ संयुक्त उपचार की प्रतिक्रिया संबंध-(ओह)2डी3 मानव पीडीसी में हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग पर एक विशेष ध्यान देने के साथ । इसलिए, इस अध्ययन में, हम एक या 1 के संयुक्त उपचार के लिए इष्टतम सांद्रता की जांच, 25-(OH)2डी3 और विटामिन सी मानव पीडीसी के osteogenic भेदभाव उत्प्रेरण के लिए । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य निर्धारित करने के लिए है कि क्या एक कोशिका दंत वायुकोशीय periosteum से अलग आबादी एक एमएससी phenotype के साथ कोशिकाओं में शामिल है और क्या इन कोशिकाओं संस्कृति में विस्तार किया जा सकता है (इनविट्रो में) और वांछित ऊतक फार्म के लिए विभेदित . इसके अलावा, हम osteocytes, chondrocytes, और adipocytes में अंतर करने के लिए पीडीसी की क्षमता का मूल्यांकन । अध्ययन का दूसरा भाग विटामिन सी और 10−10के प्रभावों का मूल्यांकन करता है, 10−9, 10−8, और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 पर पीडीसी की osteogenic गतिविधि । इस अध्ययन का प्राथमिक उद्देश्य विटामिन सी और 1 के कार्यों का आकलन करना है, 25-(OH)2डी3 ALP गतिविधि द्वारा पीडीसी के osteoblastic भेदभाव के दौरान, और समर्थक osteogenic जीन, जैसे ALP, कोलेजन-1, OCN, बसपा, और CBFA1 के रूप में । इसके अलावा, यह अध्ययन इन निष्कर्षों के आधार पर मानव पीडीसी के लिए इष्टतम osteoinductive शर्तों का निर्धारण करता है ।

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Protocol

अध्ययन प्रोटोकॉल चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । सभी प्रतिभागियों को लिखित सूचित सहमति प्रदान की ।

1. टिशू वडा

  1. दंत शल्य चिकित्सा सर्जरी के दौरान रोगियों से periosteal ऊतकों फसल (चित्रा 1). स्थानीय संज्ञाहरण के तहत प्रालंब प्रतिबिंब के बाद, एक periosteal जक31का उपयोग कर वायुकोशीय हड्डी से periosteum ऊतक का एक टुकड़ा ले ।
  2. कटाई के बाद, periosteal ऊतकों के स्लाइस की दुकान लगभग 5 मिमी × 2 मिमी के Dulbecco के फास्फेट में बफर खारा (DPBS) के साथ ३०० U/ml और ३०० मिलीग्राम/एमएल के streptomycin के साथ. 24 घंटे के भीतर ऊतकों को प्रयोगशाला में स्थानांतरित करें ।
  3. कीमा वायुकोशीय periosteal ऊतक टुकड़े नश्तर के साथ जब तक अच्छी तरह से कीमा बनाया हुआ है और बनाए रखने के नमूने में पारित 0 मध्यम (३०० के यू/एमएल और ३०० मिलीग्राम/α-मेम, और 5% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS]) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में सुसंस्कृत humidified एयर (5% कार्बन डाइऑक्साइड) । मशीन में, नमी बनाए रखने के लिए एक पानी बेसिन तैयार करें ।
  4. इसके बाद 3 दिन और प्रति सप्ताह दो बार के बाद मध्यम बदलें ।
  5. जब कोशिकाओं उपसंगम (८०%), 3 मिनट के लिए (३७ डिग्री सेल्सियस) में ०.२५% trypsin के २०० µ एल के साथ अनुयाई कोशिकाओं को रिलीज करने के लिए, और फिर प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए मध्यम के ४.५ मिलीलीटर का उपयोग करें ।
  6. प्लेट ताजा गद्यांश में फिर से कोशिकाओं 1 मध्यम (α-मेम, 10% FBS, १०० इकाइयों/एमएल के पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल के streptomycin) । प्लेट 5 × 103 कोशिकाओं है (के रूप में एक hemocytometer द्वारा गिना) ।
  7. ८०% संगम31को प्राप्त करने के बाद प्रत्येक अनुवर्ती बीतने के बाद करें ।
    नोट: शुरुआत में मध्यम नारंगी लाल रंग का होगा । मोटे तौर पर तीन दिनों के बाद, मध्यम रंग एक गाड़ा छाया करने के लिए बदलना चाहिए । कोशिकाओं के दोहरीकरण समय लगभग 30-40 एच, 3 के लिए 7 दिनों की जरूरत है-5 पीढ़ियों है ।
  8. संस्कृति अलग पीडीसी में α-मेम के साथ पूरक 10% FBS, १०० U/मिलीलीटर की, और १०० मिलीग्राम/एमएल streptomycin की एक मशीन में (३७ ° c, 5% CO2) ।
  9. दैनिक सेल विकास का निरीक्षण करें और वृद्धि के माध्यम प्रति सप्ताह दो बार बदलें । सभी आगे के प्रयोगों के लिए तीसरी से पांचवीं पीढ़ी के कोशिकाओं का प्रयोग करें ।

2. फ्लो Cytometry

  1. trypsin पाचन के माध्यम से 1 × 106 कोशिकाओं फसल:
    1. Add २०० µ l की ०.२५% trypsin. 3 मिनट के बाद, trypsin की प्रतिक्रिया समाप्त करने के लिए FBS युक्त संस्कृति माध्यम के ४.५ मिलीलीटर का उपयोग करें और (१५०० rpm, 5 मिनट, 22 डिग्री सेल्सियस) केंद्रापसारक के माध्यम से इकट्ठा ।
    2. सेल छर्रों तीन बार 1x DPBS का उपयोग कर धो लें । २०० µ l 1x permeabilization बफ़रमें कक्ष पुनर्स्थगित । किसी hemocytometer के साथ कक्षों की गणना करना.
  2. पीडीसी प्रवाह cytometry (प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग)३२के माध्यम से व्यक्त की गई सतह मार्करों की जांच करें । CD19 (fluorescein isothiocyanate (FITC)) के विरूद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (मॉब) का प्रयोग करें, CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [pe]), CD45 (FITC), CD73 (pe), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (पीई), स्ट्रो-1 (एलेक्स), और एचएलए-डॉ (FITC)३२।
    1. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में नमूने और संस्कृति के लिए एंटीबॉडी जोड़ें ।
    2. 1x DPBS के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं ।
    3. 2% formaldehyde का उपयोग करके कक्षों को ठीक करें और प्रवाह cytometry विश्लेषण३२के साथ आगे बढ़ें ।

3. Osteogenic, Adipogenic, और Chondrogenic विभेद के साथ कोशिका लगाव और व्यवहार्यता

osteogenic, adipogenic, और chondrogenic वंश में कोशिकाओं में भेदभाव प्रेरित छह पर सभी तीन मार्ग में periosteal कोशिकाओं संवर्धन द्वारा-अच्छी तरह से विशिष्ट भेदभाव मीडिया के साथ प्लेटें ।

  1. osteogenic भेदभाव के लिए, संस्कृति α में कोशिकाओं-मेम छह पर अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों के प्रति ५००० कोशिकाओं के घनत्व पर ।
    1. ८०% संगम को प्राप्त करने पर, संस्कृति α-मेम, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 मिमी), 10− 7 एम डेक्समेतएसॉनी (०.१ मिमी), और ascorbic एसिड की 5 मिलीलीटर (१०० उम) युक्त मीडिया में कोशिकाओं । संस्कृति मीडिया में नकारात्मक नियंत्रण α-मेम और 5% FBS से मिलकर ।
    2. प्रति सप्ताह दो बार मीडिया बदलें ।
    3. 4 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं की क्षमता का आकलन एक वॉन Kossa परख है, जो एक संस्कृति३३में calcified जमा की उपस्थिति अलग का उपयोग कर कोशिकाओं धुंधला द्वारा एक osteogenic वंश में अंतर करने के लिए ।
      1. फिक्सिंग के लिए 10% formalin जोड़ें । 30 मिनट के भीतर, 5% चांदी नाइट्रेट जोड़ें और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इलाज ।
      2. 5% ना2तो4 चार बार जोड़ें, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए 3 मिनट की अनुमति । अंत में, आसुत जल के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें ।
        नोट: वॉन Kossa धुंधला एक वर्षा प्रतिक्रिया जहां चांदी आयनों और फॉस्फेट अंलीय सामग्री की उपस्थिति में प्रतिक्रिया है; यह धुंधला तकनीक कैल्शियम के लिए विशिष्ट नहीं है । इस अध्ययन में, जब जांच कोशिकाओं चांदी नाइट्रेट समाधान के साथ इलाज किया गया, कैल्शियम-जो मजबूत यूवी प्रकाश द्वारा कम है-चांदी की जगह है, जो धातु चांदी के रूप में दिखाई बन गया था ।
  2. adipogenic भेदभाव के लिए, संस्कृति α-मेम युक्त छह अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों पर अच्छी तरह से प्रति ५००० कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं ।
    1. ८०% संगम को प्राप्त करने पर, संस्कृति मीडिया में कोशिकाएं युक्त α-मेम, 5% FBS, ०.५ मिमी 3-isobutyl-1-methylxanthine (१०० मिलीग्राम/एमएल), 1% पेनिसिलिन, 10− 6 एम डेक्समेतएसॉनी (1 मिमी), इंसुलिन (5 मिलीग्राम/एमएल), और indomethacin (६० मिमी) ।
    2. संस्कृति मीडिया में नकारात्मक नियंत्रण α-मेम और 5% FBS से मिलकर ।
    3. 6-9 सप्ताह के बाद, तेल लाल हे का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं दाग और लिपिड पर प्रकाश डाला जाता है, जिससे adipogenic भेदभाव३३की उपस्थिति का निर्धारण:
      1. फिक्सिंग के लिए 10% formalin जोड़ें । 30 मिनट के भीतर, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ०.५% तेल लाल हे के साथ कोशिकाओं दाग, और फिर 3 मिनट के लिए हर बार ६०% isopropanol के साथ तीन बार कोशिकाओं धो; अंत में, आसुत जल के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
        नोट: तेल लाल हे एक lysochrome (वसा में घुलनशील) diazo तटस्थ लिपिड के धुंधला के लिए इस्तेमाल किया डाई, मुख्य रूप से triacylglycerol, लिपोप्रोटीन, और कोलेस्ट्रॉल एस्टर है । डाई कोशिका में लिपिड बूंदों में घुल, लिपिड बूंदों लाल बदल रहा है ।
  3. chondrocyte भेदभाव के लिए, छह अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से युक्त ५००० कोशिकाओं के साथ संस्कृति प्लेटों पर संस्कृति कोशिकाओं ।
    1. α-मेम, 5% FBS, 10− 7 M डेक्समेतएसॉनी (०.१ mM) से युक्त एक विभेदक मध्यम जोड़ें, सोडियम पाइरूवेट (१०० µ g/एमएल), इंसुलिन-कैल्सीटोनिन-सेलेनियम-a (1 × इसके), विकास कारक बदलने-β (10 एनजी/एमएल), और 5 ascorbic एसिड की मिलीलीटर (१०० µ M) ।
    2. संस्कृति मीडिया में नकारात्मक नियंत्रण α-मेम और 5% FBS से मिलकर ।
    3. 4-5 सप्ताह के बाद, Alcian नीले दाग का उपयोग करने के लिए glycosaminoglycans या mucopolysaccharides के कुछ प्रकार के रूप में अंलीय polysaccharides, पर प्रकाश डाला, कोशिकाओं की उपास्थि में chondrocyte भेदभाव३३की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए ।
      1. फिक्सिंग के लिए 10% formalin जोड़ें । 30 मिनट के भीतर, 3% एसिटिक एसिड जोड़ें और प्रतिक्रिया के लिए 2 मिनट की अनुमति दें । बाद में, आसुत जल के साथ तीन बार धोने, 1% Alcian नीले 8GX 30 मिनट के लिए मशीन, और फिर आसुत जल के साथ धो जोड़ें । अंत में, 3% एसिटिक एसिड जोड़ें और 3 मिनट के लिए धो लें, और फिर आसुत पानी से धो समाप्त करने के लिए ।
        नोट: इस डाई से विशेष रूप से दाग है कि सेल के भागों दाग के बाद नीले रंग के लिए नीले रंग हो जाते हैं और कहा जाता है "alcianophilic."

4.25 के प्रभाव-Dihydroxyvitamin डी3 (1, 25-(OH)2डी3) पर आस्टियोजेनेसिस

  1. 6 पर छह समूहों और संस्कृति में P5 पीडीसी के लिए पी 3 भाजित-विभिंन संस्कृति मीडिया के साथ अच्छी तरह से प्लेटें:
  2. ऋणात्मक समूह (α-मेम और 5% FBS);
  3. विटामिन सी समूह (α-मेम, 5% FBS, 10 मिमी β-glycerophosphate, और 10− 7 M डेक्समेतएसॉनी + १०० उम विटामिन सी);
  4. और 10− 7 M 1, 25-(oh)2डी3 समूह (α-मेम, 5% FBS, 10 मिमी β-glycerophosphate, और 10− 7 एम डेक्समेतएसॉनी + 10− 7 एम 1, 25-(oh)2d3).
  5. एक मशीन के माध्यम से 2 मिलीलीटर (३७ डिग्री सेल्सियस) में एक अच्छी तरह से जोड़ें और मध्यम दो बार हर हफ्ते बदल जाते हैं ।

5. रिवर्स प्रतिलेखन/मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन

  1. osteoblast भेदभाव के 7 डी के बाद, एक वाणिज्यिक रिएजेंट का उपयोग करके बर्फ पर कुल आरएनए को अलग ( सामग्री की तालिकादेखें):
    1. एक अच्छी तरह से अलगाव रिएजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें । bromochloropropane के २०० µ एल जोड़ें और 10 मिनट के लिए छोड़ दो स्तरित आरएनए उत्पंन करने के लिए, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १०,००० rpm पर केंद्रापसारक ।
    2. केंद्रापसारक के बाद, जोड़ें ५०० µ 2-propanol के ५०० µ एल आरएनए युक्त supernatant के एल । बर्फ पर शाही सेना हाला और प्रतिक्रिया के लिए 15 मिनट की अनुमति दें ।
    3. प्रक्रिया के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १२,००० rpm पर केंद्रापसारक, जिसके बाद आरएनए ट्यूब के तल पर स्थित है । बाद में, धोने के लिए ७५% शराब की 1 मिलीलीटर का उपयोग करके supernatant निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस में 8 मिनट के लिए ७,५०० rpm पर केंद्रापसारक ।
    4. supernatant निकालें और तरल के नीचे से आरएनए का उत्पादन करने के लिए एक वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग करें । पानी से रिकवर करें ।
  2. रिवर्स आरएनए (1 μg) एवियन myeloblastosis वायरस रिवर्स transcriptase का उपयोग कर टाइप करना । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के लिए 25 ° c पर चलाने के लिए सेट करें ५० ° c के लिए 10 मिनट के लिए ६० मिनट और उसके बाद ८५ ° c 5 मिनट के लिए, अंत में बनाए रखने से पहले 4 ° c.
  3. प्रथम किनारा पूरक डीएनए (सीडीएनए) संश्लेषित । मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) 1:10 पतला सीडीएनए के 5 μL का प्रयोग करते हुए । मात्रात्मक आरटी आचरण-पीसीआर (qRT-पीसीआर) ALP, बसपा, OCN, CBFA1, और कोलेजन-1 के लिए प्राइमर का उपयोग कर ।
    नोट: संकेतों द्वारा डीएनए संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक प्राइमरी के फॉरवर्ड और रिवर्स सीक्वेंस को अलग exons पर डिजाइन किया गया था ।
  4. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक पीसीआर मास्टर मिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके qPCR प्रदर्शन करते हैं । ५० ° c पर थर्मल साइकिल चालक निर्धारित 2 मिनट के लिए ९५ ° c के लिए 10 मिनट के लिए और फिर ४० चक्र प्रत्येक पर ९५ ° c के लिए 15 s के बाद ६० ° c के लिए ६० s.
    नोट: SYBR प्रोटोकॉल भी एक पिघल वक्र चरण है, जो 15 एस, ६० s के लिए ६० डिग्री सेल्सियस, और उसके बाद ९५ ° c के लिए 15 एस के लिए ९५ ° c पर चलाया जाता है की आवश्यकता है ।
  5. ALP, बसपा, CBFA1, कोलेजन-1 के लिए चक्र दहलीज मूल्यों को सामान्य, और गृह व्यवस्था जीन GAPDH की है कि करने के लिए OCN. ३४
  6. प्राइमर जोड़े सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

6. क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि

  1. पहले वर्णित तकनीक३५का उपयोग कर कोशिकाओं के ALP एंजाइम गतिविधि का आकलन, जो पी-nitrophenyl फॉस्फेट पी-nitrophenol करने के लिए धर्मांतरित; पी-nitrophenyl फॉस्फेट एक फॉस्फेट सब्सट्रेट है कि पीले रंग बदल जाता है जब ALP द्वारा dephosphorylated, के रूप में एक ४०५ एनएम तरंग दैर्ध्य पर निर्धारित. कुल p-nitrophenol को ब्रैडफोर्ड परख द्वारा निर्धारित कुल प्रोटीन के आधार पर सामांय बनाएं ।
  2. कंट्रोल की ALP एक्टिविटीज की तुलना करें (α-मेम, 5% FBS), विटामिन सी (α-मेम, 5% FBS, 10 मिमी β-glycerophosphate, 10− 7 m डेक्समेतएसॉनी + १०० उम विटामिन सी), 1, 25-(OH)2D3 (α-मेम, 5% FBS, 10 मिमी β-glycerophosphate, और 10− 7 m डेक्समेतएसॉनी + 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3), और विटामिन सी + 1, 25-(oh)2d3 (α-मेम, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10− 7 M डेक्समेतएसॉनी + १०० उम विटामिन सी + 1, 25-(oh)2D3) 1, 2, 3 और संस्कृति के 4 सप्ताह के बाद समूह ।
  3. बर्फ पर एक प्रोटीन निष्कर्षण प्रक्रिया प्रदर्शन:
    1. 6-अच्छी तरह से प्लेटों से कोशिकाओं को परिमार्जन और lysis बफर के ५० µ एल जोड़ें । बाद में, कोशिकाओं को नष्ट करने और प्रोटीन मुक्त करने के लिए 30 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं जगह है ।
    2. 30 मिनट के बाद, 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १३००० rpm पर केंद्रापसारक । केंद्रापसारक के बाद, भंडारण और उपयोग के लिए supernatant निकालें ।

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Representative Results

सभी मात्रात्मक परख के लिए, डेटा मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । सभी सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टीपरीक्षण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । कुल ३४ नमूनों में ४८.१ ± १२.३ y का माध्य भागीदार आयु के साथ प्राप्त किया गया था । इनमें से ग्यारह नमूने पुरुष रोगियों से तथा 23 महिला रोगियों से प्राप्त किए गए । बीस-आठ नमूने दाढ़ क्षेत्रों से और छह पूर्वकाल क्षेत्रों से प्राप्त किए गए; २६ को जबडा से तथा ८ को mandible से प्राप्त हुए थे. दंत प्रक्रिया और संस्कृति के बीच मतलब अवधि ०.५ ± ०.१ एच था । ३४ जांच नमूनों में से, 20 सफलतापूर्वक एमएससी कालोनियों, ५८.८% की एक सफल अलगाव दर के साथ झुकेंगे । कोई महत्वपूर्ण अंतर सफलतापूर्वक और असफल अलग पीडीसी के बीच मापदंडों में से किसी में मनाया गया (मीन उम्र: ४८.८ ± १३.० बनाम ४७.१ ± ११.५ y, सेक्स: 7 पुरुषों [३५%] बनाम 4 पुरुषों [२८.६%], स्थान: दाढ़ क्षेत्रों से 15 [७५%] बनाम 13 [९२.९%], और 15 से जबडा [७५%] बनाम 11 [७८.६%], क्रमशः) ।

कक्ष आइसोलेशन और आकृति विज्ञान: Osteogenic, chondrogenic, और adipogenic विभेदन

1-9 दिनों से, पीडीसी कालोनियों और गोलाकार क्लस्टर का गठन किया । अधिकांश कोशिकाओं एक धुरी उपस्थिति का प्रदर्शन किया और एक चरण के तहत सजातीय थे कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) । संस्कृति के 14 डी के बाद, कोशिका आकृति विज्ञान के रूप में चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के तहत मनाया धुरी के आकार का दिखाई दिया । पहली पीढ़ी के कोशिकाओं के बाद, कोशिकाओं को अब समूहों में वृद्धि हुई है लेकिन व्यापक और वर्दी प्रसार का प्रदर्शन किया ।

MSCs थे धुरी के आकार का के साथ अनियमित प्रक्रियाओं और मजबूती से जुड़ी संस्कृति डिश के बाद 1-3 d प्राथमिक संस्कृति (चित्र 2a) । प्रारंभिक संस्कृति एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत छोटे, गोल कोशिकाओं और धुरी के आकार की कोशिकाओं का प्रदर्शन किया । प्रसंस्कृत कोशिकाओं को पहली यात्रा (चित्रा 2a) से एक सजातीय, fibroblast की तरह धुरी आकार का प्रदर्शन किया । विभेदक अध्ययन से पता चला है कि पीडीसी और और osteoblasts में विट्रो में विभेदित किया जा सकता है (चित्रा 2 बी), chondrocytes (चित्र 2c), और adipocytes (चित्रा 2d) ।

osteogenic भेदभाव के अंत में, वॉन Kossa धुंधला कैल्शियम जमा और osteogenic भेदभाव की उपस्थिति का संकेत दिया (आंकड़ा बी b) । इन परिणामों दृढ़ता से संकेत दिया कि periosteal कोशिका आबादी के बीच, जनक कोशिकाओं osteogenic कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के अधिकारी ।

proteoglycans के उत्पादन का आकलन करने के लिए, Alcian नीला दाग chondrocyte विभेद (चित्रा 2c) की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कोशिकाओं को सफलतापूर्वक chondrocytes में विभेदित । इन परिणामों का सुझाव दिया है कि, periosteal कोशिका आबादी के बीच, जनक कोशिकाओं chondrogenic कोशिकाओं में अंतर करने की क्षमता के अधिकारी ।

adipogenic विभेद को ट्रिगर करने के लिए पहले उल्लेखित विशिष्ट मीडिया में कक्षों को प्रसंस्कृत किया गया था । 8 हफ्तों के बाद, तेल लाल हे intracellular लिपिड के अस्तित्व का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । दाग के बाद, intracellular सूक्ष्म वसा बूंदों पांच विभेदित नमूनों में मनाया गया (चित्रा 2d) ।

पीडीसी के लिए प्रवाह cytometric सतह मार्कर अभिव्यक्ति विश्लेषण

एक प्रवाह cytometric परख कोशिकाओं की सतह पर mesenchymal सतह मार्कर की अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए आयोजित किया गया था । एमएससी मार्करों CD73, CD90, स्ट्रो-1, और CD44 पीडीसी में दृढ़ता से सकारात्मक थे, जबकि टेम वंश मार्करों CD19, CD34, CD45, और एचएलए-डॉ नकारात्मक थे ।

विभिन्न विटामिन डी के प्रभाव 3 आस्टियोजेनेसिस पर सांद्रता

हालांकि परिणाम 1, 25 के सकारात्मक प्रभाव की पुष्टि की (OH)2डी3 (calcitriol) osteogenic गतिविधि पर, सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद केवल osteogenic के mRNA अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन के कुछ के बीच मनाया गया एंजाइमों. इस विश्लेषण उच्च एसडी मूल्यों, जो मेजबानों के बीच व्यक्तिगत विचलन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता द्वारा पक्षपाती किया गया है हो सकता है ।

दूत आरएनए की अभिव्यक्ति क्षारीय फॉस्फेट

संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद ALP के mRNA अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन ७.४३ (एसडी = ३.९६) में विटामिन सी समूह और ७.१५ (एसडी = ४.८८) था, ९.३० (sd = ५.६३), १२.९२ (sd = ७.९५), और ६.६० (sd = ६.३३) में 10−10, 10−9, 10−8 , और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह, क्रमशः (चित्र 4a) । विटामिन सी में ALP की mRNA अभिव्यक्ति का स्तर, 10−8 एम 1, 25-(oh)2डी3, और 10−9 एम 1, 25-(oh)2d3 समूह काफी ऊंचे थे (p < ०.०५) से अंय समूहों में, इन समूहों में वृद्धि हुई ALP mRNA अभिव्यक्ति का संकेत है । नियंत्रण मान 1 पर सेट किया गया था । ALP mRNA अभिव्यक्तियों में निम्नलिखित गुना बढ़ जाती है इस अध्ययन में मनाया गया: ७.४३ विटामिन सी समूह में गुना; ९.३०-10−9 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में गुना; और १२.९२-10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में गुना ।

हालांकि ALP mRNA भाव में एक बड़ा मोड़ परिवर्तन 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में देखा गया था, कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर इस समूह के बीच इन अभिव्यक्ति स्तर के बारे में देखा गया था और ऋणात्मक और विटामिन सी समूह (p = ०.२० और p = ०.५२, क्रमशः) ।

ALP कोशिकाओं की जल्दी osteogenic भेदभाव का निर्धारण करने के लिए एक मजबूत संकेतक है । ALP भी mineralization३६के दौरान अकार्बनिक pyrophosphate और रिलीज फॉस्फेट के क्षरण के लिए एक ectoenzyme के रूप में कार्य करता है । पीडीसी विटामिन सी और 10−8 और 10−9 एम 1, 25-(OH)2डी3 के साथ इलाज किया जब अंय समूहों (चित्रा 4a) से उन लोगों के साथ तुलना में महत्वपूर्ण अंतर का प्रदर्शन किया ।

मेसेंजर आरएनए एक्सप्रेशन ऑफ बोन sialoprotein

संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद बसपा के mRNA अभिव्यक्तियों में गुना परिवर्तन ३.२१ थे (एसडी = १.२०) और ४.१८ (एसडी = २.५५), १०.३४ (sd = १०.३१), २४.९१ (sd = २३.४४), और ५.२४ (sd = ३.५४) में विटामिन सी और 10−10, 10−9, 10−8 , और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह, क्रमशः (चित्रा 4b) । बसपा mRNA भाव 10−8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 समूह में अधिक थे, लेकिन अन्य समूहों में इसी भाव के साथ तुलना में कोई सांख्यिकीय महत्व नहीं है ।

बसपा में mRNA भाव विटामिन सी और 10−10 एम 1, 25-(oh)2D3 समूह उन अंय समूहों की तुलना में काफी अधिक (p < ०.०५) थे, जो यह दर्शाता है कि विटामिन सी और 10−10 एम 1, 25-(oh) 2 D3 पदोन्नत बसपा अभिव्यक्ति । नियंत्रण 1 मान के लिए सेट किया गया था । विटामिन सी और 10−10 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूहों ने क्रमश: बसपा mRNA भाव में ३.२१-और ४.१८ गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया । 10−9 एम और 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूहों ने उच्च बसपा mRNA अभिव्यक्तियों का प्रदर्शन किया । 10−9 और 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूहों के एक १०.३४-और २४.९१-बसपा mRNA अभिव्यक्ति में गुना वृद्धि का प्रदर्शन किया, क्रमशः, लेकिन इस वृद्धि सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं था (पी > ०.०५) । एक संभव विवरण है कि स्टेम सेल सभी एक ही भागीदार से प्राप्त नहीं थे । इस प्रकार, संभावित मतभेदों एसडी बढ़ सकता है और फलस्वरूप सांख्यिकीय परिणामों को प्रभावित किया ।

दूत आरएनए CBFA1 की अभिव्यक्ति

संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद CBFA1 mRNA अभिव्यक्तियों में गुना परिवर्तन ०.९६ थे (एसडी = ०.१०) और ०.९० (एसडी = ०.२६), १.०१ (sd = ०.२५), १.३१ (sd = ०.३२), और १.१२ (sd = ०.३५) में विटामिन सी और 10−10, 10−9, 10−8 , और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 ग्रुप्स, क्रमशः (figure 4c). 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 ग्रुप ने उच्च CBFA1 mRNA भाव का प्रदर्शन किया । कोई चिह्नित परिवर्तन CBFA1 mRNA जीन व्यंजक में उपचार समूह या नियंत्रण समूह में स्वीकार्य किया गया था । इसके अलावा, कोई उल्लेखनीय वृद्धि विटामिन सी या 1, 25-(OH)2डी3के अलावा के बाद mRNA मार्करों की अभिव्यक्ति में मनाया गया । इसके अलावा, कोई महत्वपूर्ण समूह मतभेद मनाया गया ।

दूत आरएनए की अभिव्यक्ति कोलेजन-1

संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद कोलेजन-1 के mRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन गुना ०.९८ थे (एसडी = ०.१७) और ०.८५ (एसडी = ०.१६), १.०५ (sd = ०.१६), १.५२ (sd = ०.३६), और १.०१ (sd = ०.३३) में विटामिन सी और 10−10, 10−9, 10−8 , और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह, क्रमशः (चित्रा 4d) । कोलेजन-1 mRNA के भाव 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में अधिक थे, लेकिन अन्य समूहों में इसी भाव के साथ तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है ।

10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 और नियंत्रण समूहों ने अपने परिणामों में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित किया (p < ०.०५) । नियंत्रण 1 मान के लिए सेट किया गया था । एक १.५२-कोलेजन-1 mRNA भाव में वृद्धि गुना मनाया गया । 10−10 एम 1, 25-(oh)2डी3 और 10−8 एम 1, 25-(oh)2d3 समूहों ने अपने परिणामों में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाया (p < ०.०५) ।

दूत आरएनए की अभिव्यक्ति osteocalcin

संस्कृति के 1 सप्ताह के बाद OCN mRNA अभिव्यक्तियों में गुना परिवर्तन ०.६० थे (एसडी = ०.१) और ०.७८ (एसडी = ०.१८), १.१३ (sd = ०.५५), २.५९ (sd = १.५९), और १.६१ (sd = ०.७३) में विटामिन सी और 10−10, 10−9, 10−8 , और 10−7 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह, क्रमशः (चित्रा 4e) । OCN mRNA भाव 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में अधिक थे, लेकिन अन्य समूहों में इसी भाव के साथ तुलना में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं है ।

कोई उल्लेखनीय वृद्धि विटामिन सी या 1, 25-(OH)2डी3के अलावा के बाद OCN mRNA मार्करों के भाव में मनाया गया । हालांकि विटामिन सी ट्रीटमेंट के बाद OCN mRNA भाव में कमी आई । नियंत्रण मान 1 पर सेट किया गया था । बेसल OCN भाव osteoblastic विभेद के दौरान एक महत्वपूर्ण ०.६-गुना कमी (p < ०.०५) दर्शाया गया है । OCN mRNA भाव काफी अधिक थे (p < ०.००१) में प्रसंस्कृत कक्ष 10−8 एम 1, 25-(OH)2D3 से अंय समूहों के इसी भाव में है, जो एक औसत गुना वृद्धि का प्रदर्शन २.५९. हालांकि, ये परिणाम सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे (p > ०.०५) । एक संभव विवरण है कि स्टेम सेल सभी एक ही भागीदार से प्राप्त नहीं थे; इस प्रकार, संभावित मतभेदों एसडी बढ़ सकता है और फलस्वरूप सांख्यिकीय परिणामों को प्रभावित किया ।

ALP गतिविधि परख

पिछले एक अध्ययन में दिखाया गया है कि 1, 25-(OH)2डी3 10−8 मीटर की एकाग्रता में सबसे प्रभावी है; इसलिए, 10−8 मीटर की osteogenic क्षमता की तुलना करने के लिए परीक्षण समूह में इस्तेमाल किया गया 1, 25-(oh)2डी3 के साथ कि नकारात्मक, विटामिन सी, और विटामिन सी + 1, 25-(oh)2d3 समूहों । osteogenic की क्षमता ALP गतिविधि द्वारा व्यक्त की गई थी । संस्कृति (चित्र 5 ए) के 1 सप्ताह के बाद, ALP गतिविधि में गुना परिवर्तन १.०० थे (एसडी = ०.००), १.९२ (एसडी = ०.८९), ३.७७ (एसडी = १.६६), और १.४६ (एसडी = ०.४९) में नकारात्मक, सी, डी, और सी + डी, क्रमशः. सभी समूहों में, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर केवल D और ऋणात्मक समूहों के बीच स्वीकार्य थे (p = ०.०३; चित्र 5 ए) । संस्कृति के 2 सप्ताह के बाद, ALP गतिविधि में गुना परिवर्तन (चित्र 5b) १.०० (sd = ०.००), २.३२ (sd = १.६८), ४.९८ (sd = ३.०२), और ४.८६ (sd = २.७३) में ऋणात्मक, c, d, और c + d, क्रमशः किया गया था । कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद समूहों में से किसी में मनाया गया । संस्कृति के 3 सप्ताह के बाद, ALP गतिविधि में गुना परिवर्तन (चित्र 5c) १.०० (sd = ०.००), २.९३ (sd = २.१५), ५.७६ (sd = ३.६०), और ५.६१ (sd = ३.८८) में ऋणात्मक, c, d, और c + d, क्रमशः किया गया था । फिर, कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद समूहों में से किसी में मनाया गया (चित्रा 5c) । संस्कृति के 4 हफ्तों के बाद, ALP गतिविधि में फ़ोल्ड परिवर्तन (चित्र 5d) १.०० (sd = ०.००), २.८३ (sd = १.९७), ३.७९ (sd = ०.७७), और ऋणात्मक, c, D, और c + d में क्रमश: ४.२४ (sd = २.८७) थे । यहां, D और ऋणात्मक समूहों ने सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित किया (p = ०.००; चित्र 5d) ।

1 सप्ताह में, केवल 10−8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 समूह ने नियंत्रण समूह (p = ०.०३) की तुलना में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाया है । 2 सप्ताह में, 10−8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 और विटामिन सी समूहों के नियंत्रण समूह (पी = ०.०४९८) के साथ तुलना में महत्वपूर्ण मतभेदों का प्रदर्शन किया । 3 सप्ताह में, समूहों में से कोई भी नियंत्रण समूह के साथ तुलना में महत्वपूर्ण मतभेदों का प्रदर्शन किया । 4 सप्ताह में, 10−8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 समूह ने नियंत्रण समूह के साथ तुलना में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाया है । यह संकेत दिया कि 10−8 एम 1, 25-(OH)2डी3 पदोन्नत ALP गतिविधि ।

संक्षेप में, 10−8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 समूह में वृद्धि हुई ALP और कोलेजन-1 mRNA अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया; विटामिन सी समूह काफी बढ़ाया ALP और बसपा mRNA अभिव्यक्ति का प्रदर्शन; और 10−9 एम 1, 25-(OH)2डी3 ग्रुप ने काफी बढ़ाया ALP mRNA एक्सप्रेशन प्रदर्शित किया । 1 सप्ताह में वृद्धि हुई ALP गतिविधि विटामिन सी और 1, 25 में मनाया (OH)2डी3 समूहों लेकिन कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंय समूहों में इसी अभिव्यक्ति के स्तर के साथ तुलना में मतभेदों के साथ । 2 सप्ताह से 4, दोनों विटामिन सी और 1, 25-(OH)2डी3 समूहों के समान परिणाम प्रदर्शित । इसलिए, इन परिणामों को स्पष्ट रूप से विटामिन सी और 1, 25-(OH)2डी3 के synergistic प्रभाव स्पष्ट कोशिकाओं (ALP गतिविधि) के osteogenic भेदभाव पर नहीं कर सका ।

Figure 1
चित्र १: मानवी वायुकोशीय periosteum. दंत शल्य चिकित्सा के दौरान Periosteal ऊतकों को काटा गया । तारक वायुकोशीय periosteum के स्थान का अर्थ है ।

Figure 2
चित्रा 2: विभेद अध्ययन । MSCs थे धुरी के आकार का अनियमित प्रक्रियाओं के साथ और मजबूती से जुड़ी संस्कृति डिश के बाद 1-3 प्राथमिक संस्कृति के डी (A; तारांकन चिह्न mesenchymal स्टेम सेल के स्थान को नोट करता है) । के अंतर्गत इन विट्रो संस्कृति की स्थिति में, MSCs थे और osteoblasts में विभेदित (ख, काले तारे को इंगित करता है क्षेत्र द्वारा सना हुआ वॉन Kossa), chondrocytes (सी, नीले तारे इंगित करता है क्षेत्र दाग Alcian नीला), और adipocytes (D, गुलाबी तारांकन चिह्न तेल लाल द्वारा दाग क्षेत्र इंगित करता है) । चित्रा 2 बायोमेडिकल रिसर्च इंटरनेशनल, वॉल्यूम २०१६, आलेख ID ३५२९५६१25से फिर से उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्रवाह cytometry. MSCs द्वारा व्यक्त सतह मार्कर CD73 (६५.२%), CD90 (७५.६%), स्ट्रो-1 (६५.२%), और CD44 (८८.१%) लेकिन न CD45 (१.३४%), CD34 (१.६१%), CD19 (२.१८%), या एचएलए-डॉ (२.२०%) । "%" चित्रा में एक सकारात्मक अनुपात अर्थ है । नियंत्रण समूह (α-मेम और 5% FBS) लाल रेखा द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । प्रयोगात्मक समूह ब्लू लाइन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: mRNA भाव. mRNA 1 सप्ताह के लिए osteoblast भेदभाव के भाव । (A) ALP (B) बसपा, (C) CBFA1, (D) कर्नल-I, और (E) OCN. p < ०.०५ है *, p < ०.०१ है * * , p < ०.००१ है * * * । mRNA गुना परिवर्तन नियंत्रण बनाम है (α-मेम और 5% FBS) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: क्षारीय फॉस्फेट गतिविधि. (एक) सप्ताह 1, (ख) सप्ताह 2, (सी) सप्ताह 3, और (घ) सप्ताह 4 के लिए osteoblast भेदभाव की alkaline फॉस्फेट गतिविधि परख । p < ०.०५ है *, p < ०.०१ है * *, p < ०.००१ है * * * । गुना परिवर्तन नियंत्रण बनाम है (α-मेम, 5% FBS) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एक हाल ही में विकसित चिकित्सीय मोडल, अर्थात् ऊतक इंजीनियरिंग जरूरत MSCs, कई फायदे हैं । MSCs, जो कई ऊतक प्रकार में मौजूद हैं, multipotent कोशिकाओं है कि कार्यात्मक mesodermal ऊतक कोशिकाओं की एक किस्म में अंतर कर सकते हैं३७ और ऐसे osteoblasts के रूप में अंय कोशिकाओं ।

periosteum जनक कोशिकाओं के लिए एक जगह के रूप में कार्य करता है और हड्डी यह ढंक लेती है के लिए एक अमीर vasculature आपूर्ति के रूप में३८। हमारे अध्ययन में, ३४ जांच नमूनों की, 20 सफलतापूर्वक एमएससी कालोनियों, ५८.८% की एक सफल अलगाव दर के साथ झुकेंगे । periosteum से प्राप्त MSCs को उनके प्रसार और osteogenic विभेदक क्षमताओं के आधार पर इस अध्ययन में चुना गया. periosteal कोशिकाओं की प्रसार दर मज्जा stromal कोशिकाओं को22की तुलना में बहुत अधिक था । periosteum की osteogenic क्षमता के संबंध में, Ousual24 कि periosteum की osteogenic क्षमता व्युत्पंन स्टेम सेल (PMSCs) BMSCs की है कि हीन था । हालांकि, Yoshimura सत्यापित कि PMSCs की osteogenic क्षमता BMSCs३९की है कि प्रदर्शन । हयाशी एट अल. अस्थि ऊतक पुनर्जनन24के लिए आदर्श उंमीदवारों के रूप में periosteal वयस्क MSCs का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, periosteal वयस्क MSCs कोशिका संस्कृति अवधि को छोटा करने में उपयोगी माना जाता है, इस प्रकार दोनों लागत और प्रदूषण के जोखिम को कम करने22। कथित तौर पर, एजिंग भी osteoprogenitor कोशिकाओं के mitogenic गतिविधि को प्रभावित करता है४०। एक अध्ययन की रिपोर्ट 1, 25-(OH)2डी3 की उत्तेजना का एक उच्च डिग्री प्रेरित इन विट्रो युवा प्रतिभागियों से hMSCs में osteoblast भेदभाव (आयु < ६५ y)४१। वर्तमान अध्ययन में युवा वयस्कों से प्राप्त periosteal कोशिकाओं के उपयोग को शामिल किया गया है (< ६५ y) । इसके अलावा अध्ययन के लिए पुराने और युवा दाताओं के बीच periosteal कोशिकाओं की हड्डी पुनर्जनन क्षमता की तुलना करने के लिए आवश्यक हैं ।

इस अध्ययन में, एक सेल की आबादी अपनी प्लास्टिक-अनुयाई संपत्ति के आधार पर अलग-थलग थी, जैसा कि Friedenstein et alद्वारा वर्णित है । 13. पीडीसी फसल यहां सेल संस्कृति प्लास्टिक का पालन किया । esenchymal मार्करों (सीडी ७३, सीडी ९०, स्ट्रो-1, और सीडी ४४) की सतह एंटीजन इन प्राथमिक संस्कृतियों कोशिकाओं की महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, टेम मार्करों (सीडी ४५, सीडी ३४, सीडी 19, और एचएलए-डॉ) अनुपस्थित थे, यह दर्शाता है कि संस्कृतिक कोशिकाओं को एक mesenchymal मूल के थे । osteogenic, chondrogenic, और पीडीसी के adipogenic भेदभाव विशिष्ट भेदभाव मीडिया का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है, के रूप में अंय मसूड़ों ऊतक और अस्थि मज्जा४२से प्राप्त नमूनों का मूल्यांकन अध्ययन में वर्णित है । वर्तमान अध्ययन के परिणाम phenotypic और मानव MSCs के कार्यात्मक परिभाषा सेलुलर थेरेपी के लिए इंटरनेशनल सोसायटी द्वारा स्वीकार किए जाते है के लिए ंयूनतम मानकों के साथ पालन4। वर्तमान अध्ययन में, मानव periosteum से MSCs अलग और विस्तार किया गया है, जो आम तौर पर BMSCs के वर्णित उन लोगों के लिए इसी तरह की विशेषताओं का पता चला ।

अध्ययनों से यह प्रस्ताव किया है कि डेक्समेतएसॉनी, ascorbate, और β-glycerophosphate कारण BMSCs को osteogenic विभेदन४३से गुजरना पड़ता है. एक अंय अध्ययन है कि 1α, 25-dihydroxyvitamin डी3 (1, 25-(OH)2डी3) ascorbic एसिड के साथ संयोजन में संवर्धित स्टेम सेल विभेदन४४का प्रदर्शन किया । इसलिए, डेक्समेतएसॉनी, ascorbate, और β-glycerophosphate स्टेम सेल विभेद को बढ़ावा देने के लिए इस अध्ययन में जोड़े गए थे । पैटर्न मनाया सभी तीन रोगी सेल नमूनों में समान थे । इस अध्ययन में, MSCs सफलतापूर्वक वायुकोशीय periosteum से ५८.८% की एक अलगाव दर के साथ की पहचान की गई । आयु, लिंग और स्थान के संबंध में सफलता की दर में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया ।

वर्तमान प्रयोगात्मक अध्ययन दो पदार्थों की जांच की, अर्थात् 1, 25-(OH)2डी3 और विटामिन सी, दोनों जिनमें से स्टेम कोशिकाओं के osteogenic भेदभाव को प्रोत्साहित कर सकते हैं । एक २००८ अध्ययन४५ संकेत दिया कि 1, 25-(OH)2डी3 हड्डी चयापचय और कैल्शियम homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है और तंत्र के माध्यम से हृदय प्रणाली को प्रभावित करता है अभी तक पूरी तरह से समझ सकता है । एक और पिछले अध्ययन४६, 1, 25-(OH)2डी3 में osteoblasts में मानव MSCs के इन विट्रो विभेद को उत्तेजित । 1, 25 की क्षमता-(OH)2डी3 के लिए इन विट्रो में osteoblast-की तरह कोशिकाओं में अंतर करने के लिए विभिंन प्रणालियों४६खोज कई अध्ययनों में प्रदर्शित किया गया है विभेदित BMSCs प्रेरित करने के लिए । कुछ अध्ययनों से यह भी दिखा दिया है कि, जब osteoblast की संस्कृतियों की तरह जोड़ा-कोशिकाओं, 1, 25-(OH)2डी3 सेलुलर प्रसार रोकता है, लेकिन ऐसे ALP, osteopontin, OCN के रूप में osteoblastic मार्करों की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है, और मैट्रिक्स Gla प्रोटीन४७,४८. पिछले एक अध्ययन में बताया कि 1, 25-(OH)2डी3 आमतौर पर सेलुलर प्रसार को रोकता है और osteoblast भेदभाव४९लाती है । एक इन विट्रो murine कोशिकाओं पर किए गए अध्ययन से संकेत दिया कि 1, 25-(OH)2डी3 osteoblastogenesis9के प्रारंभिक दौर को बढ़ावा कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, एक और इन विट्रो अध्ययन का सुझाव दिया है कि, दोनों जल्दी और देर MSCs, 1, 25-(OH)2डी3 ALP, osteopontin, बसपा, और OCN४३सहित osteogenic भेदभाव मार्करों को उत्तेजित कर सकते हैं ।

दोनों OCN-मैट्रिक्स संश्लेषण के नियंत्रण के लिए जिंमेदार माना जाता है-और कोलेजन 1A1-सबसे प्रचुर मात्रा में मैट्रिक्स प्रोटीन-महत्वपूर्ण अंलीय हड्डी मैट्रिक्स प्रोटीन है कि मैट्रिक्स संश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहे हैं । इसके अलावा, वे विशेषता परिपक्व मैट्रिक्स है osteoblasts बनाने । ५० एक पिछले अध्ययन की रिपोर्ट है कि 1, 25-(OH)2डी3 उपचार वृद्धि हुई कोलेजन 1A1 अभिव्यक्ति नहीं CBFA1 या ALP जीन अभिव्यक्ति३४उत्तेजित । osteoblastic विभेद में शामिल जीन के आकलन से पता चला है कि 1, 25-(OH)2डी3 उपचार OCN५१,५२,५३की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई । हमारे अध्ययन में, परिणामों से पता चला है कि 1, 25-(OH)2डी3 osteogenic गतिविधि पर सकारात्मक प्रभाव डालती है । अंय समूहों के साथ तुलना में, 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3 ALP, बीएसपी, CBFA1, OCN, और Col1 की बढ़ी हुई mRNA अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया । इन के अलावा, ALP और Col1 के लिए परिणाम सांख्यिकीय महत्व तक पहुंच गया । इसलिए, 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3का उपयोग करते समय इष्टतम स्थितियां प्राप्त की गईं । 10− 10 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 समूह में बीएसपी की mRNA अभिव्यक्ति काफी बढ़ गई (p < ०.०५) । हालांकि, कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर CBFA1 और OCN के mRNA अभिव्यक्तियों में गुना परिवर्तन में मनाया गया । जीन mRNA अभिव्यक्ति की समीक्षा करते समय प्रयोग के परिणामों ने इन विट्रो osteogenic विभेद को दर्शाया । इन निष्कर्षों के आधार पर, आस्टियोजेनेसिस में मनाया नकारात्मक, विटामिन सी, और 10− 10, 10− 9, 10− 7 एम 1, 25-(oh)2डी3 ग्रुप्स 10− 8 एम 1, 25-(oh)2d3 में से कमज़ोर थे समूह । इन अटकलों है कि 1, 25-(OH)2डी3 प्रधानमंत्री मैट्रिक्स mineralization (कोलेजन 1A1) के लिए आवश्यक प्रोटीन को विनियमित द्वारा पीडीसी के नेतृत्व में परिणाम ।

पिछले एक अध्ययन के एक प्रमुख लक्ष्य के रूप में OCN की सूचना दी 1, 25-(OH)2डी3, जो स्पष्ट रूप से वृद्धि हुई OCN अभिव्यक्ति५२। OCN जमाव पीडीसी के osteogenic विभेद के लिए एक मार्कर के रूप में देखा जा सकता है । इसके अलावा, OCN अभिव्यक्ति एक देर osteogenic मार्कर५४के रूप में मूल्यांकन किया गया है । OCN हड्डी गठन और आस्टियोजेनेसिस५५के लिए एक विश्वसनीय मार्कर है । इसलिए, OCN अभिव्यक्ति आमतौर पर कोशिकाओं की mineralization क्षमताओं से संबंधित है । OCN परिपक्व osteoblasts की एक संवेदनशील अगोचर है । एक इन विट्रो osteogenic तुलना के लिए, स्पष्ट रूप से ऊंचा OCN mRNA अभिव्यक्ति 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में मनाया गया था ।

एक अध्ययन से संकेत दिया कि ALP गतिविधि विकास कारक बीटा (0.1-10 एनजी/एमएल) को बदलने और 1, 25-(OH)2डी3 (५० एनएम)४६के साथ पदोंनत द्वारा बाधित किया गया । इन परिणामों का मतलब है कि 10− 8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 स्टेम सेल परिपक्वता और अस्थि विकास को बढ़ावा देता है । 10− 8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 के इष्टतम स्वीकार्य सांद्रता पर ALP गतिविधि की तुलना विटामिन सी की इसी सांद्रता के साथ की गई थी । पीडीसी ALP गतिविधि व्यक्त की । इसके अलावा, 1, 25 के अतिरिक्त-(OH)2डी3 ALP गतिविधि में वृद्धि हुई है और पीडीसी में osteoblastic भेदभाव को बढ़ावा दिया । सभी तीन सेटिंग्स में, विटामिन सी, 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3, और विटामिन सी + 10− 8 एम 1, 25-(OH)2D3 सप्ताह में बढ़ी हुई ALP गतिविधि 1 (चित्र 4a), 2 (चित्र 4b), 3 ( चित्र 4c), और 4 (चित्र 4d) द्वारा कई गुना नकारात्मक नियंत्रण समूह के साथ तुलना में । सप्ताह 1 और 4 में, ALP गतिविधि 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूह में काफी बढ़ गई । 2 सप्ताह में, ALP गतिविधि में विटामिन सी और 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3 समूहों में काफी वृद्धि हुई ।

मार्ग 3, Sakaguchi एट अलमें विभिंन मानव MSCs के एक तुलनात्मक अध्ययन के माध्यम से । ५६ में पाया गया कि BMSCs और PMSCs समान osteogenic क्षमता के अधिकारी हैं । इसलिए, सेल संस्कृति अवधि की संभावना periosteal कोशिकाओं है, जो बारी में लागत और संदूषण जोखिम कम हो जाएगा का उपयोग करके छोटा किया जा सकता है । जल्दी बीतने hMSCs का उपयोग संस्कृति में विस्तार के वृद्ध होनेवाला प्रभाव से बचा जाता है । Ousual और Yoshimura 3 गद्यांश में MSCs का इस्तेमाल किया और osteogenic विभेदन की स्थिति के तहत 2 सप्ताह के लिए उपसंस्कृत३५। इसलिए, पारित समय पर विचार किया जाना चाहिए जब विभिन्न सेल स्रोतों की सेलुलर गतिविधियों की तुलना. इस अध्ययन में तीसरी पीढ़ी के पीडीसी का इस्तेमाल किया गया क्योंकि पीडीसी की बाद की पीढ़ियों की स्टेम कोशिकाओं की osteogenic क्षमता तीसरी पीढ़ी के पीडीसी की स्टेम कोशिकाओं की तुलना में कम है.

जब एक मानव सीरम माध्यम में संस्कृति, periosteum स्टेम कोशिकाओं को केवल अपने आकार को बनाए रखने नहीं कर सकते हैं, लेकिन यह भी संलग्न कर सकते हैं, गतिविधि को बनाए रखने, और सेल विकास प्राप्त. सारांश में, इन परिणामों के आधार पर, मानव पीडीसी जीवित करने की क्षमता के अधिकारी, पैदा करना, और इन विट्रोमें osteogenic वंश में अंतर है, जो vivoमें प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में महत्वपूर्ण है. periosteum MSCs में समृद्ध है और इस प्रकार ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयुक्त है । gingiva से प्राप्त periosteum कम जटिलताओं बन गया है । इसलिए वायुकोशीय अस्थियों को आदर्श दाता स्थल माना गया है । परिणाम स्पष्ट रूप से इसी तरह periosteum से अलग MSCs और osteoblasts, chondrocytes, और adipocytes में अपने विभेद को प्राप्त करने की संभावना का प्रदर्शन किया । इस अध्ययन में, पीडीसी की osteogenic क्षमता पर विटामिन सी के प्रभाव 1, 25 के उन लोगों के साथ तुलना में थे-(OH)2डी3 विभिंन सांद्रता पर । सबसे प्रभावी एकाग्रता 10− 8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3थी । 10− 8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 संस्कृति अवधि के दौरान उपचार पीडीसी में osteogenic भेदभाव उत्प्रेरण की एक प्रभावी और किफायती तरीका था । अंत में, दोनों विटामिन सी और 1, 25-(OH)2डी3 पीडीसी के osteogenic भेदभाव को बढ़ावा देने । हालांकि, इन ALP गतिविधि परिणामों में कोई महत्वपूर्ण synergistic प्रभाव प्रदर्शित । छोटे नमूना आकार को ध्यान में रखते हुए, अतिरिक्त नमूने आगे मूल्यांकन के लिए आवश्यक हैं । इस प्रकार, osteogenic शर्तों के तहत पीडीसी संस्कृति हड्डी ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयोगी हो सकता है और उच्च सेलुलर प्रसार का लाभ प्रदान करते हैं ।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों चरणों १.२ और १.३ (कटाई और इसके बाद उचित रखरखाव के 24 घंटे के भीतर संवर्धन प्रक्रिया शुरू) शामिल हैं । ऊतक के संक्रमण से बचा जाना चाहिए और अपूतित तकनीक का उपयोग करना अनिवार्य है । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि, अस्थि मज्जा या वसा ऊतक से स्टेम सेल सोर्सिंग के साथ तुलना में, दंत ऊतक से स्टेम कोशिकाओं सोर्सिंग कोशिकाओं है कि इस तकनीक के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है की कम संख्या के संदर्भ में सीमित है ।

पहचान और periosteal स्टेम कोशिकाओं के लक्षण वर्णन बहुमूल्य कार्यों और इस ऊतक के रूप में अच्छी तरह से reअपक्षयी चिकित्सा में अपनी प्रयोज्यता की क्षमता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं । एक इष्टतम शर्त 10− 8 एम 1, 25-(OH)2डी3का उपयोग कर प्राप्त किया गया था । इसलिए 10− 8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 के साथ पीडीसी का उपचार osteogenic विभेद को बढ़ावा देता है । भविष्य के अध्ययन के लिए प्रभावी और किफायती अस्थि ऊतक इंजीनियरिंग के लिए 10− 8 मीटर 1, 25-(OH)2डी3 के vivo आवेदन में जांच करनी चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन प्रोटोकॉल को चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B, और 103-4223C) के नैदानिक अनुसंधान के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था । इस अध्ययन चांग गुंग मेमोरियल अस्पताल (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, और NMRPG3C0151) द्वारा समर्थित किया गया था । इस पांडुलिपि वालेस अकादमिक संपादन द्वारा संपादित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

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अभियांत्रिकी अंक १३५ वायुकोशीय Periosteum Mesenchymal स्टेम सेल 1 25-(OH)2डी3 विटामिन डी3 Calcitriol Periosteum
मानव वायुकोशीय Periosteum और विटामिन डी के Osteogenic गतिविधि पर Periosteum-व्युत्पन्न कोशिकाओं के प्रभाव से Mesenchymal स्टेम कोशिकाओं का अलगाव
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Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H.,… More

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

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