Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler

Published: May 4, 2018 doi: 10.3791/57166
Automatic Translation
1,2, 3, 1,4,5,6, 1,7,8
1Chang Gung University, 2Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 3California Northstate University College of Medicine, 4Department of Nephrology, Clinical Poison Center, Chang Gung Memorial Hospital, 5Kidney Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, 6Center for Tissue Engineering, Chang Gung Memorial Hospital, 7Department of Periodontics, Chang Gung Memorial Hospital, 8College of Oral Medicine, Taipei Medical University

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att undersöka de mRNA uttryck biomarkörer för periostet-derived celler (PDC) induceras av C-vitamin (vitamin C) och 1,25-dihydroxivitamin D-vitamin [1,25-(OH)2D3]. Dessutom utvärderar vi PDC: er förmåga att differentieras till osteocyter, kondrocyter och adipocyter.

Abstract

Mesenkymala stamceller (MSC) finns i en mängd olika vävnader och kan göras åtskillnad mellan in i många celltyper, däribland osteoblaster. Bland dental källorna av MSCs är periostet en lättillgänglig vävnad, som har identifierats för att innehålla MSCs i cambium lagret. Men har denna källa ännu inte allmänt studerats.

Vitamin D3 och 1,25-(OH)2D3 har visat sig stimulera i vitro differentiering av MSCs till osteoblaster. C-vitamin underlättar dessutom kollagen bildning och ben celltillväxt. Dock har ingen studie ännu undersökt effekterna av Vitamin D3 och C-Vitamin på näringsidkaravgifterna.

Här presenterar vi en metod för att isolera MSCs från human alveolär periostet och undersöka hypotesen att 1,25-(OH)2D3 kan utöva en osteoinduktiv effekt på dessa celler. Vi också undersöka förekomsten av MSCs i human alveolär periostet och bedöma stem celladhesion och spridning. För att bedöma nyckel förmågan hos vitamin C (som en kontroll) och olika koncentrationer av 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8och 10−7 M) för att ändra mRNA biomarkörer i isolerade MSCs mRNA uttryck av alkaliskt fosfatas (ALP), ben sialoprotein (BSP), core bindande faktor alfa-1 (CBFA1), kollagen-1 och osteocalcin (OCN) mäts med hjälp realtid polymeras-kedjereaktion (RT-PCR).

Introduction

Även om många relevanta tekniker har utvecklats under de senaste åren, ben återuppbyggnad fortfarande begränsad av flera begränsningar, och uppskatta omfattningen av nödvändiga återuppbyggnaden är ofta omöjligt. Hårdvävnad bröstförstoring krävs för att uppnå både estetiska och funktionella mål utöver en god långsiktig framgång. Metoder som vanligen används för sådana förfaranden inkluderar autogen och prövningar bentransplantation, xenografting och alloplastic bentransplantation. Bland de olika typerna av bentransplantat betraktas autogen bone Transplanterad läderhud de mest effektiva. Givare webbplats sjuklighet, nedsatt vaskularitet och begränsad vävnad tillgänglighet1 har dock stora nackdelar för autogena bengraft. Dessutom har prövningar bone Transplanterad läderhud och xenograft förknippats med sjukdomsspridning. För närvarande används syntetiska bone grafts allmänt för att lösa dessa problem. Dock med deras brist osteogent potential, har kliniska resultat varierat mycket. Material såsom cellulosa är associerade med volym fluktuation, infektion och en brist på styrka.

Ben augmentation med vävnadsteknik har genererat betydande intresse. Den här tekniken används mesenkymala stamceller (MSC) ursprungligen för att främja osteoblast differentiering, som transplanteras sedan till platsen för att uppnå ben reparation förlust av benmassa. Detta förfarande används för närvarande i cellterapi. Att uppnå benrekonstruktion genom att extrahera en begränsad mängd vävnad är enklare och mindre invasiva jämfört med andra metoder.

MSCs potentiella roll som ett verktyg för cellbaserade terapier syftar till dental regenerering är ett framväxande intresse bland olika forskargrupper. Studier har bekräftat att MSCs kan skiljas från följande typer av vävnad: benmärg, fett, synovial membran, pericyt, trabekulärt ben, mänskliga navelsträngen och dental vävnader2,3. Vanliga källor av MSCs omfattar benmärg, fettvävnad och dental vävnader. Fördelarna med dental stamceller jämfört med MSCs härrör från fettvävnad och benmärg, och är lätt tillgänglighet och mindre sjuklighet efter skörd. Jämfört med embryonala stamceller, MSCs härrör från dentala vävnad visas nonimmunogenic och är inte associerade med komplexa etiska betänkligheter3.

I 2006, International Society for cellulära terapi rekommenderas använda följande standarder för att identifiera MSCs: först MSCs måste kunna fästa till plast. MSCs måste andra vara positiv för ytantigener CD105, CD73 och CD90 och negativa på markörer för monocyter, makrofager och B-celler förutom hematopoetiska antigener CD45 och CD344. Som ett sista kriterium, MSCs måste kunna differentieras till följande tre typer av celler under standart villkorar av in vitro- differentiering: osteoblaster, adipocyter och kondrocyter4. Hittills har sex typer av mänskliga dental stamceller isoleras och karakteriseras. Den första typen isolerades från mänskliga massa vävnad och kallas postnatal tandpulpan stamceller5. Därefter tre ytterligare typer av dentala MSCs har varit isolerade och kännetecknas: stamceller från exfolierad mjölktänder6, den parodontala ligament7och den apikala papilla8. Mer nyligen, dentala follikeln-derived9, gingival vävnad-derived10, dental knopp stam cells(DBSCs)11och Periapikal cysta MSCs (hPCy-MSCs)12 har också identifierats.

Friedenstein var först att definiera MSCs13. MSCs uppvisar en hög spridning potentiella och kan manipuleras för att skilja innan att transplanterade, vilket tyder på att de är perfekta kandidater för regenerativ förfaranden10.

Även om de flesta studier har använt benmärg som en källa för stamceller, periostet-derived celler (PDC) har också nyligen använt14. Periostet är mer lättillgängligt än är benmärgen. Därför, den här tekniken använder vi alveolära periostet att eliminera behovet av ytterligare snitt under operation och minska postsurgical morbiditet hos patienter. Periostet är den bindväv som bildar den yttre beklädnaden av långa ben och består av två distinkta lager: yttre fibrösa lagret består av fibroblaster, kollagen och elastiska fibrer15, och det inre cell-rika cambium lagret i direkt kontakt med benytan. Cambium lagret innehåller en blandad cell befolkningen, framför allt fibroblaster16, osteoblaster17, pericyter18och en kritisk subpopulation som identifierats som MSCs19,20,21. De flesta studier har rapporterat att PDC är jämförbara, om inte överlägsen, benmärg-derived stamceller (bMSCs) i ben läkning och förnyelse22,23,24. Periostet är lättillgängligt och uppvisar utmärkta regenerativ effektivitet. Några studier har dock fokuserat på periostet25,26,27.

Angående ben reparation innebär nuvarande klinisk praxis transplantation av periost stamceller förstärks inom stödjande ställningar. Nyligen genomförda studier har fokuserat på förvärva stamceller i defekta regioner och sysselsätter stamceller för vävnad förnyelse20. Tandläkare också förutse framtida tillämpning av parodontala ben förnyelse i parodontala behandlingar och tandimplantat. Angående webbplatsen givare, periostet kan enkelt skördas av allmän tandläkare. Detta jämför positivt mot märgen stromaceller, eftersom periostet kan nås under rutinmässiga oral kirurgi. Syftet med denna studie är således att upprätta ett protokoll för skörd PDC och bedöma de morfologi, fastsättning, livskraft och spridning av mänskliga periostet stamceller.

Vitamin D metaboliter påverka i vivo bentäthet dynamiska equilibriumen. En studie rapporterade att den 24R,25-(OH)2D3 aktiva formen av D-Vitamin är nödvändigt för osteoblastiska differentiering av mänskliga MSCs (hMSCs)28. Ben homeostas och reparation regleras av ett nätverk av Vitamin D3 metaboliter, som 1,25-(OH)2D3 (kalcitriol) är den mest biologiskt aktiva och relevanta i regleringen av benhälsa. Vitamin D3 är viktigt för förkalkning29. I en studie med 2-d gamla Kunming vita möss, visade de embryoid organen i möss att C-Vitamin och D-vitamin effektivt främjas differentiering av ESC-derived osteoblaster30. Bland dess andra biologiska aktiviteter stimulerar 1,25-(OH)2D3 i vitro differentiering av hMSCs till osteoblaster, som kan övervakas baserad på ökningen i alkaliskt fosfatas (ALP) enzymaktivitet eller OCN gen uttryck.

Få studier har upptäckt ett dos-responsförhållande kombinerade behandlingar med C-Vitamin och 1,25-(OH)2D3 i mänskliga PDC med särskilt fokus på ben vävnadsteknik. Därför i denna studie undersöker vi de optimala koncentrationerna för enkel eller kombinerad behandling av 1,25-(OH)2D3 och Vitamin C för att inducera osteogent differentiering av mänskliga PDC. Målet med detta protokoll är att bestämma om en cell befolkningen isolerade från dental alveolära periostet innehåller celler med en MSC fenotyp och huruvida dessa celler kan utvidgas i kultur (in vitro-) och differentierade för att bilda den önska vävnaden . Dessutom utvärderar vi PDC: er förmåga att differentieras till osteocyter, kondrocyter och adipocyter. Den andra delen av studien utvärderar effekterna av Vitamin C och 10−10, 10−9, 10−8och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 på osteogent aktiviteten av PDC. Huvudsyftet med denna studie är att bedöma funktioner C-Vitamin och 1,25-(OH)2D3 under osteoblastiska differentiering av PDC: er av ALP aktivitet och pro-osteogent gener, t ex ALP, kollagen-1, OCN, BSP och CBFA1. Dessutom avgör denna studie optimal osteoinduktiv för mänskliga PDC: er baserat på dessa fynd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studieprotokollet godkändes av den institutionella i styrelsen av Chang Gung Memorial Hospital. Alla deltagare som skriftligt informerat samtycke.

1. vävnad förberedelse

  1. Skörda periost vävnader från patienter under tandkirurgi (figur 1). Efter lock reflektion under lokalbedövning, ta en bit av periostet vävnad från alveolära benet använder en periosteal separator31.
  2. Efter skörden förvaras periost vävnader brödskivorna cirka 5 mm × 2 mm i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) med 300 U/mL penicillin och 300 mg/mL streptomycin. Överföra vävnader till laboratoriet inom 24 h.
  3. Finhacka de alveolära periost vävnad fragment med skalpeller tills väl malet och upprätthålla proverna i passagen 0 medium (bestående av 300 U/mL penicillin och 300 mg/mL streptomycin, α-MEM och 5% fetalt bovint serum [FBS]) odlade i en inkubator vid 37 ° C med fuktad luft (5% koldioxid). I inkubatorn, förbereda en vatten bassäng att behålla fuktigheten.
  4. Ändra mediet efter 3 dagar och två gånger per vecka därefter.
  5. När cellerna har nått subconfluence (80%), släpp de vidhäftande cellerna med 200 µL av 0,25% trypsin i inkubatorn (37 ° C) för 3 min och sedan använda 4,5 mL medium för att avsluta reaktionen.
  6. Platta celler igen i färska passage 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 enheter/mL av penicillin och 100 μg/mL streptomycin). Plattan är 5 × 103 celler (som räknas av en hemocytometer).
  7. Utför varje efterföljande passagen efter cellerna uppnå 80% sammanflödet31.
    Obs: I början, medium blir orange röd. Efter ungefär tre dagar, bör medellång färg ändra till en gulaktig nyans. Dubblera tiden av cellerna är ungefär 30 – 40 h, som behöver 7 dagar för 3 – 5 generationer.
  8. Kultur de isolerade PDC i α-MEM kompletteras med 10% FBS, 100 U/mL penicillin och 100 mg/mL streptomycin i en inkubator (37 ° C, 5% CO2).
  9. Observera celltillväxt dagligen och ersätta odlingsmedium två gånger per vecka. Använda tredje till femte generationens celler för alla ytterligare experiment.

2. flödescytometri

  1. Skörden 1 × 106 celler genom trypsin matsmältning:
    1. Tillsätt 200 µL av 0,25% trypsin. Efter 3 min, Använd 4,5 mL odlingsmedium som innehåller FBS att avsluta reaktionen av trypsin och samlar in genom centrifugering (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).
    2. Tvätta cell pellets tre gånger med 1 x DPBS. Att resuspendera cellerna i 200 µL 1 x permeabilisering buffert. Räkna cellerna med en hemocytometer.
  2. Undersöka de uttryckta ytmarkörer uttryckt av PDC-flow flödescytometri (fluorescens-aktiverad cell sortering)32. Använda monoklonala antikroppar (MAb) mot CD19 (fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (fykoerytrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) och HLA-DR (FITC)32.
    1. Lägg till antikropparna i prover och kultur i mörker vid 4 ° C i 30 min.
    2. Tvätta cellerna med 1 x DPBS tre gånger.
    3. Fixa de celler som använder 2% formaldehyd och fortsätt med flöde flödescytometri analys32.

3. cell fastsättning och livskraft med osteogent, adipogena och Chondrogenic differentiering

Inducerar differentiering i cellerna i osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar av odlingsskålar periost cellerna i alla tre passager på sex-väl plattor med viss differentiering media.

  1. För osteogent differentiering, odla cellerna i α-MEM med en täthet av 5000 celler per brunn på sex-väl kultur plattor.
    1. På att uppnå 80% sammanflödet, odla cellerna i media innehållande α-MEM, 5% FBS, β-glycerofosfat (10 mM), 10−7 M dexametason (0.1 mM), och 5 mL askorbinsyra (100 uM). Kultur den negativa kontrollen i media bestående av α-MEM och 5% FBS.
    2. Ändra media två gånger per vecka.
    3. Efter 4 veckor, bedöma potentialen av cellerna differentieras till en osteogent härstamning genom färgning cellerna med en von Kossa-analys, som skiljer förekomsten av förkalkade inlåning i en kultur33.
      1. Lägga till 10% formalin för fastställande. Inom 30 min, tillsätt 5% silvernitrat och behandla under ultraviolett (UV) ljus för 1 h i rumstemperatur.
      2. Lägg till 5% Na2så4 fyra gånger, så 3 min för varje reaktion. Slutligen, tvätta cellerna två gånger med destillerat vatten.
        Obs: Von Kossa färgning är en nederbörd reaktion där silverjoner och fosfat reagerar i närvaro av sura material; Denna färgning teknik är inte specifika för kalcium. I denna studie, när de undersökta cellerna behandlades med silvernitratlösning, kalcium — som minskas med starkt UV-ljus — ersattes av silver, som blev synliga som metalliskt silver.
  2. För adipogena differentiering, odla cellerna med en täthet av 5000 celler per brunn på sex-väl kultur plattor innehållande α-MEM.
    1. På att uppnå 80% sammanflödet, odla cellerna i media innehållande α-MEM, 5% FBS, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicillin, 10−6 M dexametason (1 mM), insulin (5 mg/mL) och indometacin (60 mM).
    2. Kultur den negativa kontrollen i media bestående av α-MEM och 5% FBS.
    3. Efter 6 – 9 veckor, använda olja röd O för att färga cellerna och markera lipid droppar, så sätt fastställa förekomsten av adipogena differentiering33:
      1. Lägga till 10% formalin för fastställande. Inom 30 min, färga cellerna med 0,5% olja röd O i rumstemperatur i 10 min och tvätta sedan cellerna tre gånger med 60% isopropanol för 3 min varje gång; Slutligen, tvätta cellerna med destillerat vatten.
        Obs: Olja röd O är ett lysochrome (fettlösliga) diazo färgämne används för färgning av neutrala lipider, primärt triacylglycerol, lipoprotein och kolesterol estrar. Färgämnet löser sig i lipid droppar i cellen, roterande lipid droppar rött.
  3. För chondrocyte differentiering, odla celler på sex-väl kultur plattor med varje brunn innehållande 5000 celler.
    1. Lägga till en differentiering medium innehållande α-MEM, 5% FBS, 10−7 M dexametason (0.1 mM), natrium pyruvat (100 µg/mL), insulin-transferrin-selen-A (1 × ITS), omvandla tillväxt factor-β (10 ng/mL) och 5 mL askorbinsyra (100 µM).
    2. Kultur den negativa kontrollen i media bestående av α-MEM och 5% FBS.
    3. Efter 4 – 5 veckor, använda Alcian blå färgning för att markera de sura polysackarider, såsom glykosaminoglykaner eller vissa typer av mucopolysaccharides, i brosket av cellerna för att fastställa förekomsten av chondrocyte differentiering33.
      1. Lägga till 10% formalin för fastställande. Inom 30 min, tillsätt 3% ättiksyra och 2 min för reaktionen. Därefter tvätta med destillerat vatten tre gånger, tillsätt 1% Alcian blue 8GX inkuberas i 30 min och tvätta sedan med destillerat vatten. Slutligen tillsätt 3% ättiksyra och tvätt för 3 min och tvätta sedan med destillerat vatten till slut.
        Obs: De delar av cellen som specifikt fläckar av denna färg blir blå till blå-gröna efter färgning och kallas ”alcianophilic”.

4. effekter av 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) på Osteogenesis

  1. Dela upp P3 till P5 PDC i sex grupper och kultur på 6-väl plattor med olika kultur media:
  2. negativa gruppen (α-MEM och 5% FBS);
  3. Vitamin C-gruppen (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerofosfat och 10−7 M dexametason + 100 uM Vitamin C);
  4. och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupp (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerofosfat, och 10−7 M dexametason + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).
  5. Tillsätt 2 mL av medium till en inkubator (37 ° C) i varje brunn och ändra mediet två gånger varje vecka.

5. omvänd Transkription/kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion

  1. Efter 7 d osteoblast differentiering, isolera den total-RNA på is med hjälp av en kommersiell reagens (se Tabell för material):
    1. Tillsätt 1 mL isolering reagensmedel till varje brunn. Tillsätt 200 µL av bromochloropropane och lämna i 10 min att generera skiktad RNA, och sedan Centrifugera vid 10 000 rpm i 15 minuter vid 4 ° C.
    2. Efter centrifugering, tillsätt 500 µL 2-propanol i 500 µL av supernatanten innehållande RNA. Fällningen RNA på isen och låta 15 min för reaktionen.
    3. Efter ingreppet, Centrifugera vid 12.000 rpm för 15 minuter vid 4 ° C, varefter RNA ligger på botten av röret. Därefter ta bort supernatanten med 1 mL 75% alkohol för att tvätta och centrifugera vid 7500 rpm i 8 min i 4 ° C.
    4. Avlägsna supernatanten och använder en vakuum koncentrator för att producera RNA från botten av vätskan. Återhämta sig med vatten.
  2. Omvänd transkribera RNA (1 μg) med hjälp av aviär myeloblastosis virus omvänt transkriptas. Ange polymeras-kedjereaktion (PCR) för att köra vid 25 ° C under 10 minuter följt av 50 ° C för 60 min och sedan 85 ° C i 5 minuter innan du slutligen att upprätthålla vid 4 ° C.
  3. Syntetisera första-strand kompletterande DNA (cDNA). Utföra kvantitativ PCR (qPCR) använder 5 μl av 1:10 utspädd cDNA. Genomföra kvantitativ RT-PCR (qRT-PCR) använda primers för ALP, BSP, OCN, CBFA1 och kollagen-1.
    Obs: För att undvika DNA kontaminering av signalerna, framåt och bakåt sekvenser av varje grundfärg utformades på olika exoner.
  4. Utföra qPCR med hjälp av en kommersiell PCR-Master Mix (se Tabell för material) i enlighet med tillverkarens anvisningar. Ange termocykel vid 50 ° C för 2 min följt av 95 ° C i 10 min och sedan 40 cykler varje vid 95 ° C under 15 s följt av 60 ° C för 60 s.
    Obs: SYBR protokollet kräver också en smälta kurva etapp, som drivs på 95 ° C under 15 s, 60 ° C för 60 s, och sedan 95 ° C under 15 s.
  5. Normalisera cykel tröskelvärdena för ALP, BSP, CBFA1, kollagen-1 och OCN som städning genen GAPDH. 34
  6. Primer par listas i Tabell för material.

6. alkaliskt fosfatasaktiviteten

  1. Bedöma ALP enzymaktiviteten av cellerna med hjälp av de tidigare beskrivna tekniken35, som omvandlar p- nitrofenylfosfat fosfat till p- nitrofenol; p- nitrofenylfosfat fosfat är ett fosfatas substrat som blir gul när defosforyleras av ALP, som bestäms av en 405-nm våglängd. Normalisera totalen p- nitrofenol bildas utifrån det totala proteinet som bestäms av Bradford analysen.
  2. Jämföra ALP verksamhet kontroll (α-MEM, 5% FBS), Vitamin C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerofosfat, 10−7 M dexametason + 100 uM Vitamin C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerofosfat, och 10−7 M dexametason + 10−8 M 1,25-(OH)2D3), och C-Vitamin + 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerofosfat, 10−7 M dexametason + 100 uM Vitamin C +1,25-(OH)2D3) grupper efter 1, 2, 3 och 4 vecka av kultur.
  3. Utföra en protein extraktionsmetod på isen:
    1. Skrapa cellerna från 6-väl plattorna och tillsätt 50 μl lyseringsbuffert. Därefter placera cellerna på isen för 30 min att förstöra celler och gratis proteinet.
    2. Efter 30 min, Centrifugera vid 13000 rpm vid 4 ° C i 15 min. Efter centrifugering, extrahera supernatanten för lagring och använda.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För alla kvantitativa analyser presenteras uppgifterna som medelvärde ± standardavvikelse (SD). Alla statistiska analyser genomfördes med Student's t-test. Totalt erhölls 34 prover med en deltagare medelålder på 48,1 ± 12,3 y. elva av dessa prover erhölls från manliga patienter och 23 från kvinnliga patienter. Tjugo-åtta prover erhölls från Regionkommittén molar och sex från de främre regionerna. 26 erhölls från överkäken och 8 från underkäken. Genomsnittlig varaktighet mellan tandvård och kulturen var 0,5 ± 0,1 h. Av de 34 undersökta proverna gav 20 framgångsrikt MSC kolonier, med en framgångsrik isolering 58,8%. Inga signifikanta skillnader observerades i någon av parametrarna mellan den framgångsrikt och de misslyckat isolerade PDC (medelålder: 48,8 ± 13,0 vs. 47,1 ± 11,5 y, sex: 7 män [35] % vs. 4 män [28,6%], läge: 15 från molar regioner [75%] vs 13 [92,9%], och 15 från överkäken [75%] vs. 11 [78,6%], respektive).

Cell isolering och morfologi: osteogent, chondrogenic, och adipogena differentiering

Från dagar 1-9, bildade PDC kolonier och sfäriska kluster. De flesta celler uppvisade en spindel utseende och var homogen under ett faskontrastmikroskop (figur 2). Efter 14 d kultur visades i cellmorfologi spolformad som observerats under faskontrastmikroskop. Efter de första generationens cellerna, cellerna längre växte i kluster men uppvisade utbredd och enhetlig spridning.

MSCs var spolformad med oregelbundna processer och fastsatt ordentligt till kultur skålen efter 1-3 d i primärkulturen (figur 2a). Den ursprungliga kulturen uppvisade små, runda och spolformad celler under ett optiskt mikroskop. De odlade cellerna uppvisade en homogen, fibroblast-liknande spindeln form från första passage (figur 2a). Differentiering studien visade att PDC kunde vara subpassaged och differentierade i vitro i osteoblaster (figur 2b), kondrocyter (figur 2 c) och adipocyter (figur 2d).

I slutet av osteogent differentiering anges von Kossa färgning förekomsten av kalkavlagringar och osteogent differentiering (figur 2b). Dessa resultat visade starkt att stamceller bland periost cellpopulationer, besitter potential att differentieras till Osteogena celler.

Att bedöma produktion av proteoglykaner, Alcian blå fläck användes som en indikator för att bestämma förekomsten av chondrocyte differentiering (figur 2 c). Cellerna differentieras framgångsrikt efter kondrocyter. Dessa resultat föreslog att stamceller bland periost cellpopulationer, ha potential att differentieras till chondrogenic celler.

Cellerna odlades i det tidigare nämnda särskilda mediet att utlösa adipogena differentiering. Efter 8 veckor, olja röd O användes för att upptäcka förekomsten av intracellulära lipider. Följande färgning, intracellulära mikroskopiska fett droppar observerades i fem differentierade prover (figur 2d).

Flödesanalys flödescytometrisk ytan markör uttryck för PDC

En flöde flödescytometrisk analys utfördes för att bekräfta uttrycket av mesenkymala ytan markör på ytan av celler. MSC markörer CD73, CD90, STRO-1 och CD44 var starkt positiv i PDC, medan hematopoetiska lineage markörer CD19, CD34, CD45 och HLA-DR var negativa.

Effekter av olika Vitamin D 3 koncentrationer på osteogenesis

Även om resultaten bekräftas de positiva effekterna av 1,25-(OH)2D3 (kalcitriol) på osteogent aktivitet, observerades statistiskt signifikanta skillnader endast bland vissa vik ändringar i mRNA uttryck av den osteogent enzymer. Denna analys skulle ha varit partisk genom de höga värdena för SD, som kan hänföras till de enskilda avvikelserna bland värdarna.

Messenger-RNA uttryck av alkaliskt fosfatas

Fold ändringarna i mRNA uttryck av ALP efter 1 vecka av kultur var 7,43 (SD = 3,96) gruppen Vitamin C och 7.15 (SD = 4,88), 9.30 (SD = 5,63), 12,92 (SD = 7,95), och 6,60 (SD = 6.33) i 10−10, 10−9, 10−8 , och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, respektive (figur 4a). De mRNA-uttrycksnivåerna för ALP i C-Vitamin, 10−8 M 1,25-(OH)2D3och 10−9 M 1,25-(OH)2D3 grupper var signifikant högre (p < 0,05) än de i de andra grupperna, vilket indikerar ökad ALP mRNA uttryck i dessa grupper. Kontrollen var inställd på värdet 1. Den följande fold ökningen i ALP mRNA uttryck observerades i denna studie: 7.43-fold i C-Vitamin gruppen. 9.30-Fold i 10−9 M 1,25-(OH)2D3 gruppen. och 12.92-fold i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 .

Även en större vik förändring i ALP mRNA uttryck observerades i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , inga statistiskt signifikanta skillnader observerades angående dessa uttryck nivåer mellan denna grupp och negativa och Vitamin C grupper (p = 0,20 och p = 0,52, respektive).

ALP är en stark indikator för att bestämma den tidiga osteogent differentieringen av celler. ALP också fungerar som en ectoenzyme för degraderingen av oorganisk pyrofosfat och släpper fosfat under mineralisering36. De PDC: er behandlas med Vitamin C och 10−8 och 10−9 M 1,25-(OH)2D3 uppvisade signifikanta skillnader jämfört med de från de andra grupperna (figur 4a).

Messenger-RNA uttryck för ben sialoprotein

Fold ändringarna i mRNA uttryck av BSP efter 1 vecka av kultur var 3,21 (SD = 1,20) och 4.18 (SD = 2,55), 10,34 (SD = 10,31), 24.91 (SD = 23.44), och 5.24 (SD = 3.54) i Vitamin C och 10−10, 10−9, 10−8 , och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, respektive (figur 4b). BSP mRNA uttryck var högre i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , men med ingen statistisk signifikans jämfört med motsvarande uttryck i de andra grupperna.

BSP mRNA uttryck i Vitamin C och 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupper var signifikant högre (p < 0,05) än i de andra grupperna, som visar att C-Vitamin och 10−10 M 1,25-(OH) 2 D3 främjas BSP uttryck. Kontrollen var inställd på värdet 1. C-Vitamin och de 10−10 M 1,25-(OH)2D3 grupperna uppvisade en 3,21 - och 4.18 - faldig ökning i BSP mRNA uttryck, respektive. 10−9 M och 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper uppvisade högre BSP mRNA uttryck än gjorde de andra grupperna. 10−9 och 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper uppvisade en 10.34 - och 24.91 - faldig ökning i BSP mRNA uttryck, respektive, men denna ökning var inte statistiskt signifikant (p) > 0,05). En möjlig förklaring är att stamcellerna inte var alla från samma deltagare. Således, potentiella skillnader kan ha ökat SD och följaktligen påverkas av statistiska resultat.

Messenger-RNA uttryck för CBFA1

Fold ändringarna i CBFA1 mRNA uttryck efter 1 vecka av kultur var 0,96 (SD = 0,10) och 0.90 (SD = 0,26), 1,01 (SD = 0,25), 1,31 (SD = 0,32), och 1.12 (SD = 0,35) i C-Vitamin och de 10−10, 10−9, 10−8 , och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, respektive (figur 4 c). 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen uppvisade högre CBFA1 mRNA uttryck. Några markanta förändringar observerades i de CBFA1 mRNA genuttryck i behandlingsgrupperna eller i kontrollgruppen. Dessutom observerades ingen signifikant ökning i uttryck av mRNA markörer efter tillsats av C-Vitamin eller 1,25-(OH)2D3. Dessutom observerades inga signifikanta tvärpolitiska skillnader.

Messenger-RNA uttryck för kollagen-1

Fold ändringarna i mRNA uttryck för kollagen-1 efter 1 vecka av kultur var 0,98 (SD = 0,17) och 0,85 (SD = 0,16), 1,05 (SD = 0,16), 1,52 (SD = 0,36), och 1,01 (SD = 0,33) i Vitamin C och 10−10, 10−9, 10−8 , och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, respektive (figur 4 d). Kollagen-1 mRNA uttryck var högre i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , men med inga statistiskt signifikanta skillnader jämfört med motsvarande uttryck i de andra grupperna.

10−8 M 1,25-(OH)2D3 kontroll grupperna och uppvisade statistiskt signifikanta skillnader i deras resultat (p < 0,05). Kontrollen var inställd på värdet 1. En 1.52-fold ökning av kollagen-1 mRNA uttryck observerades. De 10−10 M 1,25-(OH)2D3 och de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupperna uppvisade signifikanta skillnader i deras resultat (p < 0,05).

Messenger-RNA uttryck för osteocalcin

Fold ändringarna i OCN mRNA uttryck efter 1 vecka av kultur var 0,60 (SD = 0,1) och 0,78 (SD = 0,18), 1,13 (SD = 0,55), 2.59 (SD = 1,59), och 1.61 (SD = 0,73) i C-Vitamin och de 10−10, 10−9, 10−8 , och 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper, respektive (figur 4e). OCN mRNA uttryck var högre i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 , men med inga statistiskt signifikanta skillnader jämfört med motsvarande uttryck i de andra grupperna.

Ingen signifikant ökning observerades i uttrycken av OCN mRNA markörer efter tillsats av C-Vitamin eller 1,25-(OH)2D3. OCN mRNA uttryck minskade dock efter C-Vitamin behandling. Kontrollen var inställd på värdet 1. De basala OCN uttryck uppvisade en signifikant 0.6-fold minskning (p < 0,05) under osteoblastiska differentiering. OCN mRNA uttryck var signifikant högre (p < 0,001) i celler odlade i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 än i motsvarande uttryck i de andra grupperna, som ställde ut en genomsnittlig gånger öka av 2,59. dessa resultat var dock inte statistiskt signifikant (p > 0,05). En möjlig förklaring är att stamcellerna inte var alla från samma deltagare; Således, potentiella skillnader kan ha ökat SD och följaktligen påverkas av statistiska resultat.

ALP aktivitet assay

En tidigare studie visat att 1,25-(OH)2D3 är mest effektiv vid en koncentration på 10−8 M; Därför användes 10−8 M i testgruppen för att jämföra den osteogent förmåga 1,25-(OH)2D3 med de negativa, C-Vitamin och C-Vitamin + 1,25-(OH)2D3 grupper. Osteogena förmågan uttrycktes av aktiviteten ALP. Efter 1 vecka av kultur (figur 5a), vik ändringarna i ALP aktivitet var 1,00 (SD = 0,00), 1.92 (SD = 0,89), 3.77 (SD = 1,66), och 1,46 (SD = 0,49) i negativa, C, D, och C + D, respektive. Bland alla grupper, observerades endast statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna D och negativ (p = 0,03; Figur 5a). Efter 2 veckor av kultur, vik ändringarna i ALP aktivitet (Figur 5b) var 1,00 (SD = 0,00), 2.32 (SD = 1,68), 4.98 (SD = 3.02), och 4,86 (SD = 2,73) i negativa, C, D, och C + D, respektive. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades i någon av grupperna. Efter 3 veckor av kultur, vik ändringarna i ALP aktivitet (bild 5 c) var 1,00 (SD = 0,00), 2,93 (SD = 2.15), 5.76 (SD = 3,60), och 5,61 (SD = 3,88) i negativa, C, D, och C + D, respektive. Igen, inga statistiskt signifikanta skillnader observerades i någon av grupperna (bild 5 c). Efter 4 veckor av kultur, vik ändringarna i ALP aktivitet (figur 5 d) var 1,00 (SD = 0,00), 2,83 (SD = 1,97), 3,79 (SD = 0,77), och 4,24 (SD = 2,87) i negativa, C, D, och C + D, respektive. Här, grupperna D och negativa uppvisade statistiskt signifikanta skillnader (p = 0,00; Figur 5 d).

I vecka 1, endast 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen uppvisade signifikanta skillnader jämfört med kontrollgruppen (p = 0,03). I vecka 2, de 10−8 M 1,25-(OH)2D3 och C-Vitamin grupper uppvisade signifikanta skillnader jämfört med kontrollgruppen (p = 0.0498). I vecka 3 uppvisade ingen av grupperna signifikanta skillnader jämfört med kontrollgruppen. I vecka 4 uppvisade 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen signifikanta skillnader jämfört med kontrollgruppen. Detta anges att 10−8 M 1,25-(OH)2D3 främjas ALP aktivitet.

I korthet ökade 10−8 M 1,25-(OH)2D3 gruppen uppvisade ALP och kollagen-1 mRNA uttryck; C-Vitamin gruppen uppvisade avsevärt förbättrad ALP och BSP mRNA uttryck; och 10−9 M 1,25-(OH)2D3 gruppen uppvisade avsevärt förbättrad ALP mRNA uttryck. I vecka 1 observerades ökad ALP aktivitet i grupperna C-Vitamin och 1,25-(OH)2D3 men med inga statistiskt signifikanta skillnader jämfört med motsvarande uttryck nivåer i de andra grupperna. Från vecka 2 till 4 uppvisade både C-Vitamin och 1,25-(OH)2D3 grupper liknande resultat. Dessa resultat kunde därför inte tydligt belysa de synergistiska effekterna av C-Vitamin och 1,25-(OH)2D3 på osteogent differentiering av celler (ALP aktivitet).

Figure 1
Figur 1: Human alveolär periostet. Periost vävnader skördades under tandkirurgi. Asterisken anger placeringen av alveolära periostet.

Figure 2
Figur 2: differentiering studie. MSCs var spolformad med oregelbundna processer och ordentligt fastsatt till kultur skålen efter 1-3 d i primärkulturen (A; asterisk anger platsen för de mesenkymala stamcellen). Villkor i vitro kultur, MSCs var subpassaged och differentieras efter osteoblaster (B, svart asterisken indikerar området målat av von Kossa), kondrocyter (C, blå asterisken indikerar området färgas av Alcian blå), och adipocyter (D, rosa asterisken indikerar området färgas av olja röd O). Figur 2 återanvänds från Biomedical Research International, volym 2016, artikel ID 352956125. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: flödescytometri. Ytmarkörer som uttryckts av MSCs var CD73 (65,2%), CD90 (75,6%), STRO-1 (65,2%) och CD44 (88,1%) men inte CD45 (1,34%), CD34 (1,61%), CD19 (2.18%), eller HLA-DR (2,20%). ”%” i figuren betecknar ett positivt förhållande. Kontrollgruppen (α-MEM och 5% FBS) representeras av den röda linjen. Den experimentella gruppen representeras av den blå linjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: mRNA uttryck. mRNA uttryck av osteoblast differentiering för vecka 1. (A) ALP (B) BSP, (C) CBFA1, (D) COL-jag, och (E) OCN. p < 0,05 är *, p < 0,01 är **, p < 0,001 är ***. MRNA fold förändringen är kontra kontroll (α-MEM och 5% FBS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: alkaliskt fosfatasaktiviteten. Alkaliskt fosfatas aktivitet haltbestämning av osteoblast differentiering för (A) vecka 1, (B) vecka 2, (C) vecka 3 och (D) vecka 4. p < 0,05 är *, p < 0,01 är **, p < 0,001 är ***. Vik är kontra kontroll (α-MEM, 5% FBS). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En nyligen utvecklad terapeutisk modalitet, nämligen Vävnadsrekonstruktion medför MSCs har många fördelar. MSCs, som är närvarande i flera vävnadstyper, är multipotenta celler som kan differentieras till en mängd funktionella mesodermala vävnad celler37 och andra celler som osteoblaster.

Periostet fungerar som en nisch för stamceller och som en rik vaskulatur leverans för benet den omsluter38. I vår studie, av de 34 undersökta proverna, gav 20 framgångsrikt MSC kolonier, med en framgångsrik isolering 58,8%. MSCs härrör från periostet valdes i denna studie baserad på deras spridning och osteogent differentiering förmågor. Spridning var av periost cellerna mycket högre än för den märg stromaceller22. Angående periostet osteogent förmåga, Ousual24 hävdade att osteogent förmågan av periostet-derived stamceller (PMSCs) var sämre än det av BMSCs. Yoshimura intygas dock att PMSCs osteogent förmåga utklassade i BMSCs39. Hayashi et al. visat periost vuxen MSCs som perfekta kandidater för bone tissue regeneration24. Dessutom anses periost vuxen MSCs användbart i förkorta perioden cell kultur, vilket minskar både kostnaden och risken för kontaminering22. Enligt uppgift, åldrande påverkar också mitogena aktiviteten av osteoprogenitor celler40. En studie rapporterade 1,25-(OH)2D3 inducerade en högre grad av stimulering av in vitro- osteoblast differentiering i hMSCs från yngre deltagarna (65 år < y)41. Den aktuella studien inneburit att användningen av periost celler från unga vuxna (65 år < y). Ytterligare studier krävs för att jämföra bone regeneration förmåga periost celler mellan gamla och unga-givare.

I denna studie isolerades en cell befolkningen baserat på dess plast-anhängare egenskap, som beskrivs av Friedenstein et al. 13. the PDC skördas här följs till cell kultur plast. Esenchymal markörer (CD 73, CD-90, STRO-1 och CD 44) av dessa primära kulturer celler ytantigener uppvisade betydande uttryck. Dessutom var hematopoetiska markörer (CD 45, CD 34, CD 19 och HLA-DR) frånvarande, vilket indikerar att de odlade cellerna av mesenkymala ursprung. Osteogena, chondrogenic och adipogena differentiering av PDC kan induceras med viss differentiering medier, som beskrivs i andra studier som utvärderar produktproverna gingival vävnad och benmärg42. Resultaten från föreliggande studie överensstämmer med minimal standarder för fenotypisk och funktionella definitionen av mänskliga MSCs accepteras av den internationella föreningen för cellterapi4. I den aktuella studien, var av MSCs från mänskliga periostet isolerade och expanderade, som avslöjade egenskaper liknande dem vanligtvis beskrivs av BMSCs.

Studier har föreslagit att dexametason, askorbat och β-glycerofosfat orsaka BMSCs genomgå osteogent differentiering43. En annan studie visade att 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) i kombination med askorbinsyra främjas stamcells differentiering44. Dexametason, askorbat och β-glycerofosfat lades därför i denna studie att främja stamcellers differentiering. De mönster som observerades var liknande i alla tre patienten cellprover. I denna studie identifierades framgångsrikt MSCs från alveolära periostet med en isolering på 58,8%. Inga statistiskt signifikanta skillnader observerades i framgång med avseende på ålder, kön och plats.

Den nuvarande experimentell studien undersöktes två ämnen, nämligen 1,25-(OH)2D3 och C-vitamin, som båda kan stimulera osteogent differentieringen av stamceller. En 2008 studie45 anges att 1,25-(OH)2D3 är avgörande för benmetabolism och kalciumhomeostas och påverkar hjärt-kärlsystemet genom mekanismer ännu ska förstås fullt. I en annan tidigare studie46stimuleras 1,25-(OH)2D3 i vitro differentiering av mänskliga MSCs till osteoblaster. 1,25-(OH)2D3 förmåga att inducera odifferentierade BMSCs differentieras till osteoblast-liknande celler in vitro- har visats i flera studier för att undersöka olika system46. Vissa studier har också visat att, när de läggs till kulturer osteoblast-liknande celler, 1,25-(OH)2D3 hämmar cellulär proliferation men ökar uttrycket av osteoblastiska markörer såsom ALP, osteopontin, OCN och matrix Gla protein47,48. En tidigare studie rapporterade att 1,25-(OH)2D3 normalt hämmar cellulär proliferation och inducerar osteoblast differentiering49. En in vitro- studie genomfördes på murina celler anges att 1,25-(OH)2D3 kan främja de tidiga stadierna av osteoblastogenesis9. Dessutom föreslog en annan in vitro- studie att,2D3 till både tidiga och sena MSCs,1,25-(OH) kan stimulera osteogent differentiering markörer, inklusive ALP, osteopontin, BSP och OCN43.

Båda OCN — anses ansvarig för kontroll av matris syntesen — och kollagen 1A1 — det mest förekommande proteinet matrix — är avgörande sura ben matrix proteiner som spelar avgörande roller i matris syntesen. Dessutom är de karakteristiska mogen matrix-bilda osteoblaster. 50 en tidigare studie rapporterade att 1,25-(OH)2D3 behandling stimuleras ökad kollagen 1A1 uttryck men inte CBFA1 eller ALP gen uttryck34. Bedömningar av genernas osteoblastiska differentiering har avslöjat att 1,25-(OH)2D3 behandling ökat uttryck av OCN51,52,53. I vår studie visade resultaten att 1,25-(OH)2D3 utövar positiva effekter på osteogent aktivitet. Jämfört med andra grupper, visat 10−8 M 1,25-(OH)2D3 ökat mRNA-uttryck av ALP, BSP, CBFA1, OCN och Kol1. Bland dessa nådde resultat för ALP och Kol1 statistisk signifikans. Således erhölls optimala förhållanden när du använder 10−8 M 1,25-(OH)2D3. mRNA-uttryck av BSP i 10−10 M 1,25-(OH)2D3 gruppen ökade signifikant (p < 0,05). Dock observerades inga statistiskt signifikanta skillnader i Vik förändringar i de mRNA-uttryck av CBFA1 och OCN. När du granskar mRNA genuttrycket, anges resultaten av experimentet i vitro osteogent differentiering. Baserat på dessa fynd, den osteogenesis som observerats i negationen, Vitamin C och 10−10, 10−9, 10−7 M 1,25-(OH)2D3 grupper var svagare än i 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupp. Dessa resultat ledde till spekulationer om att 1,25-(OH)2D3 primtal PDC: er av upregulating matrix proteiner krävs för mineralisering (kollagen 1A1).

En tidigare studie rapporterade OCN som ett favoritmål för 1,25-(OH)2D3, som ökat markant OCN uttryck52. OCN nedfall kan ses som en markör för osteogent differentiering av PDC. Dessutom har OCN uttryck utvärderats som en sena osteogent markör54. OCN är en pålitlig markör för ben bildandet och osteogenesis55. OCN uttryck är därför generellt relaterat till mineralisering kapaciteterna av celler. OCN är en känslig biomarkör för mogna osteoblaster. En in vitro- osteogent jämförelse observerades markant förhöjda OCN mRNA uttryck i gruppen3 10−8 M 1,25-(OH)2D.

En studie visade att ALP aktivitet var hämmas genom att omvandla tillväxtfaktor beta (0,1-10 ng/mL) och främjas med 1,25-(OH)2D3 (50 nM)46. Dessa resultat innebär att 10−8 M 1,25-(OH)2D3 främjar stem cell mognad och ben utveckling. ALP aktivitet vid de optimala observerade koncentrationerna av 10−8 M 1,25-(OH)2D3 jämfördes med på motsvarande koncentrationer av Vitamin C. PDC uttryckt ALP aktivitet. Dessutom tillägg av 1,25-(OH)2D3 ökade aktiviteten ALP och främjas osteoblastiska differentieringen i PDC. I alla tre inställningar, C-Vitamin, 10−8 M 1,25-(OH)2D3, och C-Vitamin + 10−8 M 1,25-(OH)2D ökad3 ALP aktivitet på veckor 1 (figur 4a), 2 (figur 4b), 3 ( Figur 4 c), och 4 (figur 4 d) med flera gånger jämfört med den negativa kontrollgruppen. Veckor 1 och 4: ALP aktiviteten ökat betydligt i gruppen 10−8 M 1,25-(OH)2D3 . I vecka 2, ALP aktivitet ökat markant i Vitamin C och 10−8 M 1,25-(OH)2D3 grupper.

Genom en jämförande studie av olika mänskliga MSCs på passage 3, Sakaguchi et al. 56 hittade att BMSCs och PMSCs äger liknande osteogent förmågor. Perioden cell kultur kan därför sannolikt förkortas med hjälp av periost celler, vilket i sin tur skulle minska kostnaden och förorening risken. Användning av tidig-passage hMSCs undviker senescent effekterna av expansion i kulturen. Ousual och Yoshimura används MSCs på passage 3 och subkultiveras för 2 veckor enligt osteogent differentiering villkor35. Passagetiden bör därför övervägas när man jämför olika cell källor cellulär verksamhet. I denna studie användes tredje generationens PDC eftersom stamcellerna senare generationer av PDC osteogent potential är lägre än för stamcellerna av tredje generationens PDC.

När odlade i humant serum medium, kan periostet stamceller inte bara bibehålla sin form, men kan också bifoga, upprätthålla verksamhet och uppnå celltillväxt. Sammanfattningsvis, mänskliga PDC baserat på dessa resultat, och besitter förmågan att överleva, föröka sig och differentiera i osteogent härstamning i in vitro-som är avgörande vid bedömningen av effekten i vivo. Periostet är rik på MSCs och är därför lämplig för vävnadsteknik. Periostet erhålls från gingiva utgör färre komplikationer. Alveolära benet anses därför en idealisk givare webbplats. Resultaten visade tydligt möjligheten att på motsvarande sätt isolera MSCs från periostet och uppnå deras differentiering till osteoblaster, kondrocyter och adipocyter. I denna studie jämfördes effekterna av C-Vitamin på PDC osteogent potential med de av 1,25-(OH)2D3 vid olika koncentrationer. Den mest effektiva koncentrationen var 10−8 M 1,25-(OH)2D3. 10−8 M 1,25-(OH)2D3 behandlingen under hela kultur var en effektiv och ekonomisk metod för att inducera osteogent differentiering i PDC. Sammanfattningsvis, främja både C-Vitamin och 1,25-(OH)2D3 osteogent differentiering av PDC. Dock uppvisade dessa inga betydande synergieffekter i ALP aktivitetsresultat. Med tanke på den lilla urvalet krävs ytterligare prover för vidare utvärdering. Således, PDC odlade osteogent villkor kan vara användbart för ben vävnadsteknik och erbjuder fördelen av högre cellulär proliferation.

Kritiska steg i detta protokoll omfatta steg 1.2 och 1.3 (startar culturing proceduren inom 24 timmar efter skörd och korrekt underhåll därefter). Kontaminering av vävnad måste undvikas och användning av aseptisk teknik är obligatorisk. En begränsning i detta protokoll är att jämfört med sourcing stamceller från benmärg eller fettvävnad, sourcing stamceller från dentala vävnad är begränsad när det gäller det låga antalet celler som kan erhållas genom denna teknik.

Identifiering och karakterisering av periost stamceller kan ge värdefull information om de funktioner och regenerativ potential av denna vävnad samt dess tillämplighet i regenerativ terapi. Ett optimalt tillstånd erhölls med 10−8 M 1,25-(OH)2D3. Behandling av PDC med 10−8 M 1,25-(OH)2D3 främjar därför, Osteogena differentiering. Framtida studier bör undersöka i vivo programmet 10−8 M 1,25-(OH)2D3 för effektiv och ekonomisk bone tissue engineering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Studieprotokollet godkändes av den institutionella Review Board för klinisk forskning av Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C, 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B och 103-4223C). Denna studie stöddes av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 och NMRPG3C0151). Detta manuskript redigerades av Wallace akademiska redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA Gibco 25200-056
2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt Sigma 49752
35-mm culture dishes Corning 430165
3-isobutyl-1-methylxanthine Sigma I5879
6  well plate Corning 3516
Alkaline phosphatase ABI Hs01029144_m1
Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit BioVision K412-500
avian myeloblastosis virus reverse transcriptase Roche 10109118001
CD146 BD 561013
CD19 BD 560994
CD34 BD 560942
CD44 BD 561858
CD45 BD 561088
CD73 BD 561014
CD90 BD 561974
Cell banker1 ZEAOAQ 11888
core binding factor alpha-1 ABI Hs00231692_m1
dexamethasone Sigma D4902
DPBS Gibco 14190250
FBS Gibco 26140-079
GAPDH ABI Hs99999905_m1
HLA-DR BD 562008
indomethacin Sigma I7378
insulin sigma 91077C
insulin–transferrin–selenium-A Sigma I1884
MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) Life 4346907
MicroAmp optical adhesive film Life 4311971
Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification HyClone SH30265.02
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Permeabilization buffer eBioscience 00-8333-56
Sodium pyruvate Gibco 11360070
STRO-1 BioLegend 340103
SYBER Green PCR Master Mix AppliedBiosystems 4309155
TaqMan Master Mix Life 4304437
transforming growth factor-β Sigma T7039 
Trizol reagent (for RNA isolation) Life 15596018
β-glycerophosphate Sigma G9422
collagen-1 Invitrogen forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3
reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'
OCN Invitrogen forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3'
reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'
BSP Invitrogen forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3'
reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'
Commercial ALP primers
Commercial CBFA1 primers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kao, R. T., Murakami, S., Beirne, O. R. The Use of Biologic Mediators and Tissue Engineering in Dentistry. Periodontol. 50, 127-153 (2000).
  2. Rosenbaum, A. J., Grande, D. A., Dines, J. S. The Use of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Engineering: A Global Assessment. Organogenesis. 4, 23-27 (2008).
  3. Yen, T. H., Wright, N. A., Poulsom, R. Bone Marrow Stem Cells: From Development to Therapy. Horizons in Medicine. Franklyn, J. 16, Royal College of Physicians of London. London, UK. 249-257 (2004).
  4. Dominici, M., et al. Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  5. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal Human Dental Pulp Stem Cells (DPSCs). In Vitro and In Vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13625-13630 (2000).
  6. Miura, M., et al. Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 5807-5812 (2003).
  7. Seo, B. M., et al. Investigation of Multipotent Postnatal Stem Cells from Human Periodontal Ligament. Lancet. 364, 149-155 (2004).
  8. Sonoyama, W., et al. Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLOS ONE. 1, e79 (2006).
  9. Morsczeck, C., et al. Isolation of Precursor Cells (PCs) from Human Dental Follicle of Wisdom Teeth. Matrix Biol. 24, 155-165 (2005).
  10. Mitrano, T. I., et al. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81, 917-925 (2010).
  11. Di Benedetto, A., Brunetti, G., Posa, F., Ballini, A., et al. Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Dental Bud: Role of Integrins and Cadherins. Stem Cell Res. 15, 618-628 (2015).
  12. Marrelli, M., Paduano, F., Tatullo, M. Cells Isolated from Human Periapical Cysts Express Mesenchymal Stem Cell-like Properties. Int J Biol Sci. 9 (10), Published online Nov 16 1070-1078 (2013).
  13. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in Transplants of Bone Marrow Cells. J Embryol Exp Morphol. 16, 381-390 (1966).
  14. Perka, C., Schultz, O., Spitzer, R. S., Lindenhayn, K., Burmester, G. R., Sittinger, M. Segmental Bone Repair by Tissue-Engineered Periosteal Cell Transplants with Bioresorbable Fleece and Fabrin Scaffolds in Rabbits. Biomaterials. 21, 1145-1153 (2000).
  15. Taylor, J. F. The Periosteum and Bone Growth. Hall, B. K. , CRC Press. Boca Raton. Bone Growth VI (1992).
  16. Squier, C., Ghoneim, S., Kremenak, C. Ultrastructure of the Periosteum from Membrane Bone. J Anat. 171, 233-239 (1990).
  17. Aubin, J., Triffitt, J. Mesenchymal Stem Cells and Osteoblast Differentiation. Principles of Bone Biology. Bilezikian, J., Raisz, L. G., Rodan, G. A. , Academic Press. San Diego. 59-81 (2002).
  18. Diaz-Flores, L., Gutierrez, R., Lopez-Alonso, A., Gonzalez, R., Varela, H. Pericytes as a Supplementary Source of Osteoblasts in Periosteal Osteogenesis. Clin Orthop Relat Res. 275, 280-286 (1992).
  19. Lim, S. M., Choi, Y. S., Shin, H. C., Lee, C. W., Kim, S. L., Kim, D. I. Isolation of Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Using Immunophenotypes for Chondrogenesis. Biotechnol Lett. 27, 607-611 (2005).
  20. Stich, S., et al. Human Periosteum-Derived Progenitor Cells Express Distinct Chemokine Receptors and Migrate Upon Stimulation with CCL2, CCL25, CXCL8, CXCL12, and CXCL13. Eur J Cell Biol. 87, 365-376 (2008).
  21. Choi, Y. S., et al. Multipotency and Growth Characteristic of Periosteum-Derived Progenitor Cells for Chondrogenic, Osteogenic, And Adipogenic Differentiation. Biotechnol Lett. 30, 593-601 (2008).
  22. Agata, H., et al. Effective Bone Engineering with Periosteum-Derived Cells. J Dent Res. 86, 79-83 (2007).
  23. Ribeiro, F. V., et al. Periosteum-Derived Cells as an Alternative to Bone Marrow Cells for Bone Tissue Engineering Around Dental Implants. A Histomorphometric Study in Beagle Dogs. J Periodontol. 81, 907-916 (2010).
  24. Hayashi, O., et al. Comparison of Osteogenic Ability of Rat Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Periosteum and Adipose Tissue. Calcif Tissue Int. 82, 238-247 (2008).
  25. Hong, H. H., Hong, A., Yen, T. H., Wang, Y. L. Potential Osteoinductive Effects of Calcitriol onthe m-RNA of Mesenchymal Stem Cells Derived from Human Alveolar Periosteum. BioMed Res Int. , Article ID 3529561 (2016).
  26. Knothe, U. R., Dolejs, S., Miller, R. M., Knothe Tate, M. L. Effects of Mechanical Loading Patterns, Bone Graft, and Proximity to Periosteum on Bone Defect Healing. J Biomech. 43, 2728-2737 (2010).
  27. McBride, S. H., Dolejs, S., Brianza, S., Knothe, U. R., Knothe Tate, M. L. Net Change in Periosteal Strain During Stance Shift Loading After Surgery Correlates to Rapid de novo Bone Generation in Critically Sized Defects. Ann Biomed Eng. 39, 1570-1581 (2011).
  28. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28 (5), 644-658 (2014).
  29. Mostafa, N. Z., et al. Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells Cultured with Dexamethasone, Vitamin D3, Basic Fibroblast Growth Factor, and Bone Morphogenetic Protein-2. Connect Tissue Res. 53 (2), 117-131 (2012).
  30. Sun, Y., Yang, X., Li, F., Dou, Z. Study on Differentiation of Embryonic Stem Cells into Osteoblast in vitro Inducing by 1,25(OH)2VD3. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22 (9), 1117-1120 (2008).
  31. Ishii, M., Koike, C., Igarashi, A., et al. Molecular Markers Distinguish Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells from Fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 332, 297-303 (2005).
  32. Maund, S. L., Barclay, W. W., Hover, L. D., et al. Interleukin-1α Mediates the Antiproliferative Effects of 1,25-Dihydroxyvitamin D3 in Prostate Progenitor/Stem Cells. Cancer Res. 71, 5276-5286 (2011).
  33. Mitrano, T. I., Grob, M. S., Carrión, F., Nova-Lamperti, E., Luz, P. A., Fierro, F. S., Quintero, A., Chaparro, A., Sanz, A. Culture and Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Gingival Tissue. J Periodontol. 81 (6), 917-925 (2010).
  34. Curtis, K. M., Aenlle, K. K., Roos, B. A., Howard, G. A. 24R,25-Dihydroxyvitamin D3 Promotes the Osteoblastic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. Mol Endocrinol. 28, 644-658 (2014).
  35. Ippolito, G., Schiller, P. C., Ricordi, C., Roos, B. A., Howard, G. A. Age Related Osteogenic Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. J Bone Miner Res. 14, 1115-1122 (1999).
  36. D'Stucki, U., et al. Temporal and Local Appearance of Alkaline Phosphatase Activity in Early Stages of Guided Bone Regeneration. A Descriptive Histochemical Study in Humans. Clin Oral Implants Res. 12, 121-127 (2001).
  37. Caplan, A. I., Bruder, S. P. Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular medicine in the 21st century. Trends Mol Med. 7, 259-264 (2001).
  38. Knothe Tate, M. L., Falls, T., McBride, S. H., Atit, R., Knothe, U. R. Mechanical Modulation of Osteochondroprogenitor Cell Fate. Int J Biochem Cell Biol. 40, 2720-2738 (2008).
  39. Yoshimura, H., Muneta, T., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H., Sekiya, I. Comparison of Rat Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow, Synovium, Periosteum, Adipose Tissue, and Muscle. Cell Tissue Res. 327, 449-462 (2007).
  40. Tanaka, H., Ogasa, H., Barnes, J., Liang, C. T. Actions of bFGF on Mitogenic Activity and Lineage Expression in Rat Osteoprogenitor Cells: Effect of Age. Mol Cell Endocrinol. 150, 1-10 (1999).
  41. Zhou, S., et al. Clinical characteristics influence in vitro action of 1,25-dihydroxyvitamin D(3) in human marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 27 (9), 1992-2000 (1992).
  42. Pittenger, M. F., et al. Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science. 284, 143-147 (1999).
  43. Jørgensen, N. R., Henriksen, Z., Sorensen, O. H., Civitelli, R. Dexamethasone, BMP-2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 69, 219-226 (2004).
  44. Khanna-Jain, R., et al. Vitamin D(3) Metabolites Induce Osteogenic Differentiation in Human Dental Pulp and Human Dental Follicle Cells. J Steroid BiochemMol Biol. 122 (3), 133-141 (2010).
  45. Lee, J. H., O'Keefe, J. H., Bell, D., Hensrud, D. D., Holick, M. F. Vitamin D Deficiency an Important, Common, and Easily Treatable Cardiovascular Risk Factor? J Am Coll Cardiol. 52, 1949-1956 (2008).
  46. Liu, P., Oyajobi, B. O., Russell, R. G., Scutt, A. Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and 1,25(OH)(2) vitamin D(3) In vitro. Calcif Tissue Int. 65 (2), 173-180 (1999).
  47. Beresford, J. N., Gallagher, J. A., Russell, R. G. G. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 and Human Bone-Derived Cells In Vitro: Effects on Alkaline Phosphatase, Type I Collagen and Proliferation. Endocrinology. 119, 1776-1785 (1986).
  48. Price, P. A., Baukol, S. A. 1,25-Dihydroxyvitamin D3 Increases Synthesis of the Vitamin K-Dependent Bone Protein by Osteosarcoma Cells. J Biol Chem. 255, 11660-11663 (1986).
  49. Kawase, T., Oguro, A. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Synergistically Augments 1, 25-Dihydroxyvitamin D3-Induced Monocytic Differentiation in Murine Bone Marrow Cell Cultures. Horm Metab Res. 36, 445-452 (2004).
  50. Fujisawa, R., Tamura, M. Acidic Bone Matrix Proteins and Their Roles in Calcification. Front Biosci. (Landmark Ed). 17, 1891-1903 (2012).
  51. van Driel, M., et al. Evidence that Both 1α,25 Dihydroxyvitamin D3 and 24-Hydroxylated D3 Enhance HuMan Osteoblast Differentiation and Mineralization. J Cell Biochem. 99, 922-935 (2006).
  52. Atkins, G. J., et al. Metabolism of Vitamin D3 in Human Osteoblasts: Evidence for Autocrine and Paracrine Activities of 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D3. Bone. 40, 1517-1528 (2007).
  53. Kerner, S. A., Scott, R. A., Pike, J. W. Sequence Elements in the Human Osteocalcin Gene Confer Basal Activation and Inducible Response to Hormonal Vitamin D3. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4455-4459 (1989).
  54. Viereck, V., et al. Differential Regulation of Cbfa1/Runx2 and Osteocalcin Gene Expression by Vitamin-D3, Dexamethasone, and Local Growth Factors in Primary Human Osteoblasts. J Cell Biochem. 86, 348-356 (2002).
  55. Shi, X., et al. In-vitro osteogenesis of synovium stem cells induced by controlled release of bisphosphate additives from microspherical mesoporous silica composite. Biomaterials. 30, 3996-4005 (2009).
  56. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of Human Stem Cells Derived from Various Mesenchymal Tissues: Superiority of Synovium as a Cell Source. Arthritis Rheum. 52, 2521-2529 (2005).

Tags

Bioteknik fråga 135 alveolära periostet mesenkymala stamceller 1,25-(OH)2D3 Vitamin D3 kalcitriol periostet
Isolering av mesenkymala stamceller från mänskliga alveolära periostet och effekter av D-Vitamin på osteogent aktivitet av periostet-derived celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H.,… More

Wang, Y. L., Hong, A., Yen, T. H., Hong, H. H. Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells. J. Vis. Exp. (135), e57166, doi:10.3791/57166 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter