Summary

Chemischen Amputation und Regeneration des Rachens in die Planarian Schmidtea mediterranea

Published: March 26, 2018
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Summary

Das Planarian Schmidtea Mediterranea ist ein hervorragendes Modell für das Studium Stammzellen und Regeneration des Gewebes. Diese Publikation beschreibt eine Methode, um ein Organ, des Rachens, selektiv zu entfernen, indem man Tiere, die chemische Natriumazid. Dieses Protokoll beschreibt auch Methoden für die Überwachung des Rachens Regeneration.

Abstract

Planarien sind Plattwürmer, die äußerst effizient auf Regeneration. Sie verdanken diese Fähigkeit, eine große Anzahl von Stammzellen, die auf jeder Art von Verletzungen schnell reagieren können. Häufige Verletzungen Modelle in diesen Tieren entfernen Sie große Mengen von Gewebe, die mehrere Organe schädigt. Um dieses breite Gewebeschäden zu überwinden, beschreiben wir hier eine Methode, um gezielt ein einzelnes Organ, des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaentfernen. Dies erreichen wir durch Einweichen Tiere in eine Lösung mit der Cytochrom-Oxidase-Hemmer Natriumazid. Kurze Exposition gegenüber Natriumazid verursacht Extrusion des Rachens vom Tier, nennen wir “chemische Amputation.” Chemischen Amputation entfernt den gesamten Rachenraum und erzeugt eine kleine Wunde, wo der Pharynx in den Darm legt. Nach umfangreichen spülen, regeneriert alle Amputierte Tieren eine voll funktionsfähige Rachen in etwa einer Woche. Stammzellen in den Rest des Körpers fahren Regeneration des neuen Rachens. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum chemischen Amputation und histologische und Verhaltensstörungen Methoden zur Beurteilung der erfolgreichen Amputation und Regeneration zu beschreiben.

Introduction

Regeneration ist ein Phänomen, das im gesamten Tierreich, mit regenerativen Kapazitäten von Ganzkörper-Regeneration in bestimmten Wirbellosen bis hin zu mehr eingeschränkten Fähigkeiten in Wirbeltieren1auftritt. Ersatz von funktionellen Geweben ist ein komplexer Prozess und oft bringt die gleichzeitige Wiederherstellung mehrere Zelltypen. Zum Beispiel Salamander Gliedmaßen, Osteoblasten, Chondrozyten, Nervenzellen, Muskeln und Epithelzellen müssen sich regenerieren2ersetzt. Außerdem müssen diese neu erzeugten Zelltypen richtig organisiert werden, um die neue Funktion der Gliedmaße zu erleichtern. Das Verständnis dieser komplexen Prozesse erfordert Techniken, die auf Regeneration von bestimmten Zelltypen und ihre Integration in die Organe zu konzentrieren.

Die Strategien, die Studie der regenerativen Antworten zu vereinfachen gehört die gezielte Ablation von bestimmten Zelltypen oder größere Sammlungen von Geweben. Beispielsweise führt die Expression des Nitroreductase in bestimmten Zelltypen im Zebrafisch, zu deren Vernichtung nach Anwendung von Metronidazol3,4. In Drosophila -Larven Abtragen mit dem Ausdruck Pro-apoptotische Gene unter gewebespezifische Promotoren gezielt bestimmte Regionen des imaginalen Scheibe5,6. Beide dieser Strategien rasch, aber kontrollierten Schaden anrichten, und wurden verwendet, um die molekularen und zellulären Mechanismen für die Regeneration verantwortlich zu sezieren.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine Methode, um eine ganze Organ namens des Rachens in die Planarian Schmidtea Mediterraneaselektiv abtragen. Planarien sind ein klassisches Modell der Regeneration, bekannt für ihre fruchtbaren Regenerationsfähigkeit, wo selbst kleinste Fragmente ganze Tiere 7,8wieder nachwachsen. Sie haben eine große, heterogene Bevölkerung von Stammzellen, die aus pluripotenten Zellen und Linie beschränkt Stammväter9,10,11. Diese Zellen vermehren sich und differenzieren, um alle fehlenden Gewebe, einschließlich des Rachens, Nerven-, Verdauungs- und Ausscheidungsorgane Systeme und Muskel und Epithelzellen9,10,12zu ersetzen. Wir wissen, dass diese Stammzellen Regeneration einzuleiten, tun wir nicht vollständig verstehen Sie, die molekularen Mechanismen, die sie zu diesen verschiedenen Zelltypen ersetzen fahren. Definierte verletzte Methoden, die präzise Stammzellen Reaktionen auslösen können helfen, diesen komplexen Prozess abzugrenzen.

Der Pharynx ist eine große, zylindrische Röhre benötigt für die Fütterung und enthält Neuronen, Muskel, epithelialen und sekretorischen Zellen13,29. Normalerweise versteckt in einer Tasche an der Bauchseite des Tieres, es erstreckt sich über einzelne Körper des Tieres auf das Vorhandensein von Nahrung sensing öffnen. Um selektiv den Pharynx amputieren, genießen wir Planarien in einer chemischen genannt Natriumazid, eine häufig verwendete Anästhetikum in C. Elegans14,15,16. Seine Verwendung in Planarien wurde erstmals berichtet, von Adler Et Al., 2014-12. Innerhalb von Minuten der Exposition gegenüber Natriumazid Planarien extrudieren Sie ihre Pharynges und mit sanften Agitation des Rachens trennt das Tier. Dieser vollständige und selektiven Verlust des Rachens bezeichnen wir als “chemische Amputation”. Eine Woche nach der Amputation, ist eine voll funktionsfähige Rachen restaurierten12. Da Rachens für Fütterung erforderlich ist, kann funktionelle Regeneration gemessen werden, durch die Überwachung Fressverhalten. Im folgenden beschreiben wir das Protokoll für chemische Amputation und für die Beurteilung der Regeneration des Rachens und Wiederherstellung der Fressverhalten.

Protocol

1. Vorbereitung Aufbereitung des Wassers planaria 17 Planarien in einem 1 X Montjuïc-Salz-Lösung zu erhalten. Um Planarian Wasser vorzubereiten, stellen Sie einzelne Stammlösungen 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl und 5 M NaCl Reinstwasser. Sterilisieren Sie Filter-mit 0,2 µm Flasche-Top Filterfor anhaltender Lagerung.Hinweis: Verwenden Sie nur hochreines entionisiertem Wasser (mit einem Widerstand…

Representative Results

Exposition gegenüber Natriumazid stört die normale Beweglichkeit der Planarien, Tiere zu dehnen und Winden verursacht. Diese Bewegungen zwingen den Rachen von der ventralen Seite des Tieres entstehen, und nach ca. 6 min. in Natrium-Azid-Lösung, die weiße Spitze des Rachens zu sehen (Abbildung 1 b-linken). Ein paar Minuten später, Tiere aktiv zusammenziehen und des Rachens durch Drücken Sie ihn gewaltsam aus dem Körper vollständig zu e…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur selektiven Abtragen des Rachens mit Natriumazid. Weitere gezielte Ablation Studien in Planarien haben geänderte Chirurgie verwendet, um Photorezeptoren21 oder pharmakologische Behandlung zu dopaminergen Neuronen22abtragen zu entfernen. Ein großer Vorteil der chemischen Amputation über bestehende Methoden ist, dass es keine Operation erfordert. Die starre Struktur des Rachens verglichen mit dem Rest des Körpers Planarian erlei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten Alejandro Sánchez Alvarado, danken, die die anfänglichen Optimierung und Entwicklung dieser Technik unterstützt. Im Carolyn Adler Labor ist von Cornell University Startkapital unterstützt.

Materials

Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Fisher Chemical C79-3 Montjuïc salt solution
Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) Fisher Chemical M65-3 Montjuïc salt solution
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) Acros/VWR 41341-5000 Montjuïc salt solution
Potassium Chloride (KCl) Acros Organics/VWR 196770010 Montjuïc salt solution
Sodium Chloride (NaCl) Acros Organics/VWR 207790050 Montjuïc salt solution
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Acros Organics/VWR 123360010 Montjuïc salt solution
Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot ThermoFisher Scientific/VWR 2324-0015 Storing planaria water
Instant Ocean Sea Salt Spectrum Brands Amazon Planaria water
Gentamicin Sulfate Gemini Bio-products 400-100P Planaria water
Razor blades Electron Microscopy Sciences 71970 Mincing liver 
Disposable pastry bags-16”, 12 pack Wilton Amazon Liver aliquots
5 mL syringes BD/VWR 309647 Liver aliquots
Petri dishes-35mm/60mm Greiner Bio-One/VWR 82050-536/82050-544
Plastic containers (various sizes) Ziploc Amazon Housing planarians in static culture
Sodium Azide Sigma S2002
Transfer pipette Globe Scientific 138030
Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 Electron Microscopy Sciences  72700-D (0203-5-PO)
Triton X-100 Sigma T8787
DAPI  ThermoFisher 62247
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher S11223
Glycerol Fisher BioReagents BP229-1

References

  1. Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
  2. Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
  3. Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
  4. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
  5. Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
  6. Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
  7. Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
  8. Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
  9. Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
  10. Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
  11. van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
  12. Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
  13. Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
  14. Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
  16. Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
  17. Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
  18. Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
  19. Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
  20. Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
  21. LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
  22. Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
  23. Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
  24. Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
  25. Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
  26. Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
  27. Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
  28. Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
  29. Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
  30. Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).

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Shiroor, D. A., Bohr, T. E., Adler, C. E. Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea. J. Vis. Exp. (133), e57168, doi:10.3791/57168 (2018).

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