Planarian Schmidtea mediterranea er en utmerket modell for å studere stilk celler og vev gjenfødelse. Denne publikasjonen beskriver en metode for å selektivt fjerne en orgel, pharynx, ved å utsette dyr til den kjemiske Natriumazid. Denne protokollen skisserer også metoder for å kartlegge pharynx gjenfødelse.
Planarians er Flatormer som er svært effektiv i fornyelse. De skylder denne evnen til et stort antall stamceller som raskt kan svare på alle typer skader. Felles skade modeller i disse dyrene fjerne store mengder vev, som skader flere organer. For å overvinne dette brede vevsskade, beskriver vi her en metode for å selektivt fjerne en enkelt organ, pharynx, i planarian Schmidtea mediterranea. Vi oppnå dette ved soaking dyr i en løsning som inneholder cytochrome oxidase hemmer Natriumazid. Kort eksponering for Natriumazid fører utelukkelse av pharynx fra dyr, som vi kaller “kjemiske amputasjon.” Kjemisk amputasjon fjerner hele pharynx og genererer et lite sår der pharynx festes til tarmen. Etter omfattende rense, generere alle amputert dyr en fullt funksjonell pharynx i ca en uke. Stamceller i resten av kroppen kjøre regenerering av nye pharynx. Her gir vi en detaljert protokoll for kjemiske amputasjon og beskrive både histologiske og atferdsmessige metoder for å vurdere vellykket amputasjon og gjenfødelse.
Fornyelse er et fenomen som oppstår i hele dyreriket, med regenerativ akselrasjonsevner oppstiller fra hele kroppen gjenfødelse i enkelte dyr til mer begrenset evner i virveldyr1. Utskifting av funksjonelle vev er en kompleks prosess og ofte innebærer samtidige restaurering av flere celletyper. For eksempel å regenerere salamander lem, osteoblasts, chondrocytes, nerveceller, muskler og epitelceller må erstattet2. Disse nygenererte celletyper må også organiseres riktig å lette nye lem funksjonen. Forstå disse komplekse prosesser krever teknikker som fokuserer på fornyelse av spesifikke celletyper og deres integrering i organer.
En av strategiene ansatt å forenkle studere regenerative svar er den målrettede ablation enten visse celletyper eller større samlinger av vev. For eksempel i sebrafisk fører uttrykk for nitroreductase i spesifikke celletyper til deres ødeleggelse etter metronidazole3,4. I Drosophila larvene, kan uttrykke pro-apoptotisk gener under vev-spesifikke arrangører selektivt ablate regioner imaginal plate5,6. Begge disse strategiene rask, men kontrollerte skade, og har blitt brukt til å analysere molekylære og cellulære mekanismer ansvarlig for gjenfødelse.
I dette manuskriptet beskriver vi en metode for å selektivt ablate et hele organ kalt pharynx i planarian Schmidtea mediterranea. Planarians er en klassisk modell av gjenfødelse, kjent for sine produktive regenerativ, der selv minutt fragmenter kan regrow hele dyr 7,8. De har et stort, heterogent befolkningen av stamceller bestående av både pluripotent celler og avstamning begrenset progenitors9,10,11. Disse cellene spredning og differensiere for å erstatte alle manglende vev, inkludert svelg, nervøs, fordøyelseskanal og excretory systemer og muskel og epitelceller9,10,12. Mens vi vet at disse stamcellene starte gjenfødelse, forstår vi ikke fullt ut molekylære mekanismer som driver dem til å erstatte alle disse forskjellige celletyper. Definerte såret metoder som framprovosere presis stamcelleforskningen reaksjoner kan bidra til å avgrense denne komplekse prosessen.
Pharynx er en stor, sylindriske tube kreves for fôring, og inneholder nerveceller, muskel, epitel og sekretoriske celler13,29. Normalt gjemt i en pose på ventral side av dyret, den strekker seg gjennom dyrets enkelt kroppen åpning ved sensing mat. For å selektivt amputere pharynx, suge vi planarians i en kjemisk kalt Natriumazid, en brukte bedøvelse i C. elegans14,15,16. Bruk i planarians ble først rapportert av Adler et al., i 201412. Planarians extrude deres pharynges minutter av eksponering for Natriumazid, og med milde agitasjon, pharynx løsner fra dyret. Vi kaller dette komplett og selektiv tapet av pharynx “kjemiske amputasjon”. En uke etter amputasjon, er en fullt funksjonell pharynx restaurerte12. Fordi pharynx kreves for fôring, kan funksjonelle gjenfødelse måles ved å overvåke fôring atferd. Nedenfor beskriver vi protokollen for kjemiske amputasjon og vurdere fornyelse av pharynx og restaurering av fôring atferd.
Denne protokollen beskriver en metode for selektiv ablasjon av pharynx bruker Natriumazid. Andre målrettede ablasjon studier i planarians har brukt endret kirurgi for å fjerne fotoreseptorer21 eller farmakologisk behandling å ablate dopaminergic neurons22. En betydelig fordel av kjemiske amputasjon over eksisterende metoder er at den ikke krever kirurgi. Stive strukturen i pharynx sammenlignet med resten av planarian kroppen forenkler fullstendig fjerning fra dyr, som er…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Alejandro Sánchez Alvarado, som støttet den første optimalisering og utvikling av denne teknikken. Arbeid i Carolyn Adlers laboratorium støttes av Cornell University oppstart midler.
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |