Summary
We beschrijven fixatie, paraffine insluiten en dunne vectorafbeeldingsbestanden technieken voor microbiële kolonie biofilms. In bereid monsters, kunnen biofilm substructuur en verslaggever expressiepatronen worden gevisualiseerd door microscopie.
Abstract
Afdelen via het insluiten van paraffine is een grotendeels gevestigde techniek in eukaryotische systemen. Wij bieden hier een methode voor de fixatie, insluiten, en segmenteren van intact microbiële kolonie biofilms gebruik van paraffine geperfundeerd. Aan te passen deze methode voor gebruik op de kolonie biofilms, we ontwikkelde technieken voor het behoud van elk monster op het substraat van de groei en het lamineren met een agar-overlayer, en lysine toegevoegd aan de kleefpoeders oplossing. Deze optimalisaties verbeteren monster bewaring en het behoud van micromorphological functies. Monsters voorbereid op deze wijze zijn vatbaar voor dunne segmenteren en imaging door licht, fluorescentie en transmissie-elektronenmicroscopie. Wij hebben deze techniek toegepast om de kolonie biofilms van Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisen Vibrio cholerae. Het hoge niveau van detail zichtbaar in de monsters die zijn gegenereerd door deze methode, gecombineerd met verslaggever stam engineering of het gebruik van bepaalde kleurstoffen, spannende inzichten in de Fysiologie en de ontwikkeling van microbiële gemeenschappen kan bieden.
Introduction
Meeste microben hebben de capaciteit om formulier biofilms, samengehouden gemeenschappen van cellen door zelf geproduceerde matrices. Biofilms kunnen worden gekweekt in vele soorten van fysieke setups, met verschillende regimes van nutriënten en substraat bepaling. Specifieke tests voor biofilm vorming neiging om opbrengst reproduceerbare meercellige structuren, en gemeenschappelijke platforms voor fylogenetisch divers soort de Gemeenschap of de macroscopische niveau in acht worden genomen. Wanneer microben zijn gegroeid als kolonies op solide medium onder een atmosfeer, macroscopische morfologie brengt informatie over de capaciteit voor de productie van de matrix en vaak correleert met andere eigenschappen 1,2,3. De interne architectuur van microbiële kolonies bieden ook aanwijzingen met betrekking tot de biofilm-specifieke chemie en fysiologie, maar moeizaam te karakteriseren. Recente toepassingen van cryoembedding en cryosectioning technieken aan bacteriële kolonies hebben ingeschakeld beeldvorming en visualisatie van specifieke kenmerken op ongekende resolutie 4,5,6. Studies met dierlijk weefsel hebben echter aangetoond dat paraffine insluiten biedt superieure behoud van morfologie in vergelijking met cryoembedding 7 en is gebruikt voor het visualiseren van bacteriën in weefsels 8,9. Daarom hebben we een protocol voor fixatie, paraffine insluiten en dunne afdelen van microbiële kolonie biofilms ontwikkeld. Hier beschrijven we de voorbereiding van Pseudomonas aeruginosa PA14 kolonie-biofilm dunne secties 10,11, maar we hebben ook met succes deze techniek toegepast om biofilms gevormd door de bacteriën Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, en Vibrio cholerae12.
Het proces van paraffine-insluiting en dun-afdelen biofilms volgt een eenvoudige logica. Ten eerste, de biofilms zijn ingekapseld in een laagje agar morfologie behouden tijdens de verwerking. Ten tweede, de ingekapseld-biofilms zijn ondergedompeld in een hechtmiddel aan dwarslijn macromoleculen en micromorfologie behouden. Deze zijn vervolgens gedehydrateerde met alcohol, gewist met een meer niet-polair oplosmiddel en vervolgens geïnfiltreerd met vloeibare paraffine. Zodra het geïnfiltreerd, worden de monsters ingebed in de wax blokken voor het segmenteren. Secties zijn gesneden, gemonteerd op dia's en vervolgens gerehydrateerd om hen terug te keren naar een meer oorspronkelijke staat. Vanaf dit punt, kunnen zij worden gekleurd of bedekt met montage medium voor microscopische analyse.
Dit protocol produceert dunne secties van microbiële biofilms geschikt voor histologisch analyse. Kolonie biofilm substructuren worden weergegeven als dunne secties opgesteld op basis van deze methode zijn beeld door de lichte microscopie. Biofilms kunnen ook worden gekweekt op media met fluorescerende vlekken specifiek voor afzonderlijke functies of gekleurd bij de rehydratie stap, onmiddellijk voorafgaand aan de montage (stappen 9.5-9.6). Ten slotte kunnen microben worden ontworpen om te produceren van fluorescente proteïnen in een constitutief of gereglementeerde mode waardoor in situ rapportage van de cel distributie of gen expressie binnen deze Gemeenschappen. We hebben deze methoden gebruikt om te bepalen van de kolonie biofilm diepte, cel distributie, verdeling van de matrix, groeipatronen en Spatio genexpressie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de groei van Pseudomonas aeruginosa kolonie Biofilms
- Bereiding van Medium-dubbelgelaagde platen
- Bereiden van een 10 g/L trypton, 10 g/L agar (Zie Tabel van materialen) oplossing in gedeïoniseerd water.
- Autoclaaf gedurende 20 minuten afkoelen tot 50-60 ° C in een waterbad.
- 45 mL van de oplossing van de agar-trypton giet in een vierkante schotel van 100 x 100 mm (Zie Tabel van materialen) met behulp van een conische buis van 50 mL. De agar te stollen toestaan (~ 20-30 min). Giet een tweede, 15 mL laag bovenop de eerste laag. Laat 's nachts stollen, verwijderen van condensatie van eventueel door te vegen met een stofvrije tissue deksels.
- Kolonie Biofilms spotten
- Strijk de stammen van belang uit diepvries voorraden op LB agar platen13 en broeden in het donker gedurende 12-16 uur bij 37 ° C en 80-100% relatieve vochtigheid.
- Voor elke stam of repliceren, kunt een één kolonie LB 2 mL beënten en incuberen in het donker gedurende 12-16 uur bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
- Sub cultuur door verdunning van 1:100 in frisse LB en broeden in het donker gedurende 2,5-3 uur bij 37 ° C met het schudden van 250 toeren per minuut.
- Optische dichtheid met behulp van een spectrofotometer meten en aanpassen met steriele pond te bereiken een celsuspensie met een OD500 nm van ~ 0,5.
- Afhankelijk van de gewenste kolonie grootte, Pipetteer 2.5-10 µL celsuspensie op een bord van de middellange-dubbelgelaagde (bereid in stap 1.1) en laat de vlek drogen voor ~ 20 min. verlaten het deksel petri ajar in de buurt van een open vuur drogen vergemakkelijken kan.
- Incubeer plek kolonies bij 25 ° C en 80-100% relatieve vochtigheid, in het donker voor tot 4 dagen.
2. voorbereiding van de kleefpoeders oplossing
- Bereid de kleefpoeders oplossing op de dag van het oogsten van de steekproef. 37% formaldehyde (FA) in 1 x PBS om een eindconcentratie van 4% verdund FA.
Let op: FA is vluchtig en giftig. Dragen van beschermende uitrusting en werken in een goed geventileerde zuurkast. - Onmiddellijk vóór gebruik, ontbinden L-lysine hydrochloride in 4% FA (bereid in stap 2.1) bij kamertemperatuur tot een eindconcentratie van 50 mM L-lysine HCl.
3. directe toepassing van fixeerspray op de kolonie Biofilm [Optional]
Opmerking: We hebben gevonden dat biofilm morfologie best behouden blijft wanneer de topagar wordt toegevoegd vóór de fixatie. Deze stap vormt echter ook een verandering in de omgevingscondities die de genexpressie kunnen beïnvloeden. Fluorescerende verslaggever expressiepatronen moeten daarom worden geverifieerd met behulp van een afzonderlijk protocol waarin de fixatie stap wordt uitgevoerd vóór de toevoeging van de topagar, zoals hier is beschreven.
- Op de dag van fixatie, en werken in een goed geventileerde zuurkast, Pipetteer de fixeerspray bereid in stap 2 direct op het oppervlak van de agar rond de kolonie rand, zodat het bereiken van de kolonie periferie zonder het dompelen. Toepassing alleen als veel fixeerspray als nodig is om volledig omringen de kolonie, ongeveer 500 µL. laat de fixatief om te verspreiden in de kolonie en de omliggende agar.
- Zodra de fixeer volledig opgenomen in de kolonie en de omliggende media, ongeveer 20-30 min is, en resterende FA niet meer zichtbaar op de plaat is, herhaal stap 3.1. Laat deze fixatief om te verspreiden in de kolonie en de omliggende agar.
- Zodra de fixeer volledig opgenomen in de kolonie is en omliggende media Herhaal stap 3.1, ditmaal fixeerspray op het oppervlak van de kolonie direct toe te passen. Toestaan dat deze fixatief om te verspreiden in de kolonie en de omliggende agar, gaan naar stap 4 slechts immers kleefpoeders is geabsorbeerd en is niet meer zichtbaar op de plaat.
4. overlay kolonies met Agar
- Op de dag van fixatie, bereid een 10 g/L agar oplossing in gedeïoniseerd water en autoclaaf gedurende 10-20 minuten te ontbinden. Cool in een waterbad tot 50 ˚C.
- Giet voorzichtig 15 mL van de oplossing van de agar over het groeimedium en kolonie. Laat de agar een gel te vormen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten (figuur 1B).
- Gebruik een scherp scheermesje te snijden een vierkante, 3-laags chuck met de kolonie gelamineerd tussen de bovenste twee lagen. Als voorbereiding van meerdere monsters, ervoor zorgen dat elke chuck is teruggebracht tot een vergelijkbare grootte.
- Zachtjes verwijderen overtollige agar uit de kolonie-bevattende chuck.
- Te heffen de twee bovenste lagen van agar (met de kolonie) uit de buurt van de onderste laag van de chuck (Figuur 1 c), de vlakke kop van een spatel in 1 x PBS of water nat en zacht invoegen tussen de bovenste en onderste lagen. De gelaagde kolonie moet scheiden van de onderste laag. Wees voorzichtig niet te verstoren of de gelaagd kolonie buigen wanneer tillen vanuit zijn basis.
5. fixatie
- Werken in een goed geventileerde-zuurkast, onmiddellijk overdracht de gelaagd kolonie (dat wil zeggen, 2-laags chuck) in een insluiten cassette (Zie Tabel of Materials), aangeduid met een chemisch bestendige markering pen. Plaats de cassette insluiten in een glas dia mailer (zie tabel van materialen) met de fixeerspray bereid in stappen 2.1-2.2. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen gevangen in de insluiten cassette.
- Incubeer het monster in fixeerspray 's nachts in het donker bij kamertemperatuur.
6. voorbeeld Processing: Buffer Wash, uitdroging, Clearing en infiltratie
- Na overnachting fixatie, het monster twee keer in 1 x PBS voor elke 1 h te wassen. Voor de beste resultaten, automatiseren reagens homogenisering met behulp van de spin functie van een automatische weefsel-processor (zie tabel van materialen) ingesteld op een lage instelling. Als geen processor beschikbaar is, kan de verwerking handmatig worden uitgevoerd.
- Volg de buffer wassen door uitdroging door middel van een gesorteerde reeks van ethanol (EtOH) verdunningen in 1 x PBS (25%, 50%, 70%, 95%) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Dehydrateren in drie wasbeurten van 100% EtOH gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Schakel het gedehydrateerde monster in drie wast voor 100% oranje olie gebaseerde clearing agent (zie tabel van materialen) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Infiltreren het gewiste monster tweemaal met gesmolten paraffine wax (Zie Tabel of Materials), verwarmd tot 55˚C, voor elke 2 h.
7. steekproef inbedding
- Vul een wassen mal met gesmolten paraffine opgewarmd tot 55 ˚C. Gebruik een verwarmde, platte spatel snel overbrengen van de geïnfiltreerde chuck van de insluiten cassette in de wax mal, ervoor te zorgen dat de chuck parallel aan de basis van de schimmel ligt. Vermijd overmatige druk op de chuck toe te passen. Wax mallen aangepaste 3-D afgedrukt kunnen worden, of zijn commercieel verkrijgbaar (Zie Tabel van materialen).
- Toestaan was te stollen 's nachts op 4 ˚C. Gegoten in de stevige wax monsters kunnen bij 4 ˚C voor onbepaalde tijd worden bewaard.
- Zodra de wax heeft verhard, accijnzen het monster uit de mal en trim de overtollige wax van rond het monster met een scheermesje. Laat de overtollige wax die zich uitstrekt van het ene uiteinde van het monster, parallel met het deurvlak afdelen, die kan worden gebruikt om de klem in de microtoom (Zie Tabel van materialen). Ook laat een omhulsel van was, ongeveer 1 mm dik, rond het monster en glad haar gezichten.
8. segmenteren
- Verwarm een waterbad tot 42 ˚C. Klem het monster in de microtoom met het oppervlak van de kolonie georiënteerde loodrecht op de rand van het blad (Zie Tabel van materialen).
- Het monster op 50-µm intervallen inkorten tot de gewenste vliegtuig van de kolonie is bereikt, waaruit secties zullen worden verzameld.
- Snijd een lint van het gewenste aantal 10-µm dik secties gebruikend microtome ingesteld op een vectorafbeeldingsbestanden snelheid van 75-80 rpm en een hoek van de klaring van 6-10˚. Gebruik een boete-tipped verfkwast om het lint van het blad los te maken.
- Met behulp van een druppel water op het puntje van een pipet van Pasteur (bij voorkeur) of pincet, zachtjes overbrengen in het lint het waterbad. Wees voorzichtig om te voorkomen dat overlapping luchtbellen onder de sectie.
- Onmiddellijk een dia in het waterbad invoegt en plaats deze onder het lint onder een hoek van 45˚.
- Raak de smalle rand van het lint aan de dia, net onder de berijpte label. Het lint moet voldoen.
- Trek de dia uit het waterbad, aanpassen van de hoek tot loodrecht op het oppervlak van het water, en het toestaan van het lint te leggen plat tegen de dia over haar lengte. Vermijd overlapping van overtollig water onder het lint.
- Zachtjes staan de dia op een absorberende pluisvrije weefsel, wicking overtollig water uit de sectie.
- Leg de dia op een papieren handdoek en laat ze drogen bij kamertemperatuur 's nachts in het donker. Dia's kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd bij 4 ˚C in het donker.
9. warmte-vaststelling rehydratie en montage
- Verwarm een geëgaliseerd warmhoudplaat aan 45 ˚C. Verwarm de dia voor 30-60 min. De wax zal worden semi-gesmolten en plat tegen de dia.
- Voorzichtig opheffen van de dia uit de hete plaat en leg het plat op een gladde, geëgaliseerd, kamertemperatuur oppervlak, met behulp van zorg om ervoor te zorgen dat de gesmolten wax niet trekken aan weerszijden van de dia totdat de wax stolt (~ 1 min).
- Met behulp van een glas dia mailer,-wax dia's in vier wasbeurten van clearing agent voor 5 minuten elk, met behulp van een aspirator Büchner oplossing tussen de wasbeurten te verwijderen.
- De dia's drie keer wassen in 100% EtOH voor elke 1 min.
- De dia's in een gesorteerde reeks van ethanol in de omgekeerde volgorde van verwerking (95%, 70%, 50% en 25%) voor 1 min die elk gevolgd door twee 1-min wast in 1 x PBS hydrateren.
- Onmiddellijk het monteren van de secties in een medium Tris-gebufferd montage (Zie Tabel van materialen) en breng een dekglaasje aan, de invoering van luchtbellen vermijden. Toestaan montage middellange tot polymeriseren 's nachts bij kamertemperatuur.
- Zodra polymeervorm, zegel het dekglaasje aan naar de dia met behulp van duidelijke nagellak. Verzegelde dia's kunnen worden opgeslagen voor onbepaalde tijd in het donker bij 4 ˚C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode genereert biofilm dun-secties waarin verschillende morfologische kenmerken en de zones van de genexpressie door DIC, fluorescentie microscopie en TEM beeld kunnen worden. Hoewel DIC geschikt zijn met behulp van een 40 X olie onderdompeling doelstelling kan voldoende zijn om te laten zien van sommige morfologische kenmerken (figuur 2E), we hebben gevonden dat fluorescentie microscopie van stammen ontworpen om constitutively express fluorescent proteïne biedt verbeterd visualisatie van de cel distributie binnen het monster (figuur 2D). Beelden van afzonderlijke secties kunnen samen worden gestikt, voor het genereren van een dwarsdoorsnede van de hele kolonie (figuur 2B) en het leveren van context voor de lokalisatie van structurele kenmerken binnen de algehele morfologie op macroscopische niveau (Vergelijk Figuur 2A, B, en C). Morfologische kenmerken en fluorescerende signalen kunnen worden gemeten met behulp van imaging software14. Structuren binnen de biofilm of overgangen tussen de zones van de genexpressie kunnen dan worden gecorreleerd met distributies van metabolieten of chemische verlopen11 .
Dit protocol kan worden gewijzigd en aangepast op verschillende manieren. Gebruik van een stam ontworpen om uitdrukkelijke fluorescerende eiwit onder de controle van een specifieke promotor in staat stelt visualisatie van de verdeling van de genexpressie (figuur 3A). Kolonies kunnen worden gekweekt op medium met kleurstoffen, of kleurstoffen kunnen worden toegevoegd aan de post segmenteren, om vlekken van specifieke polysacchariden (cijfers 3B en C). Ten slotte kunnen monsters bereid in een gewijzigde versie van dit protocol worden onderzocht door TEM (figuur 3D) toe voor visualisatie met hogere resolutie dan die ingeschakeld door DIC of fluorescentie microscopie.
Figuur 1: Schematische voorstelling afgebeeld van setup voor kolonie groei voorafgaand aan de fixatie.
(A) kolonies worden geteeld op de top van twee lagen van agar-gestold groeimedium (boven- en onderkant) en (B) zijn vervolgens bedekt met een extra laag (overlay), die kolonie morfologie bewaart. (C) de kolonie ingeklemd tussen de overlay en de bovenste laag wordt vervolgens gescheiden van de onderste laag voor verdere verwerking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Micromorphological-functies en YFP fluorescentie in dwarsdoorsneden van paraffine-ingebedde kolonies.
Representatieve gegevens voor een Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz kolonie15 constitutively YFP uiten en geteeld voor 3 dagen op 1% trypton, 1% agar met Congo rood en Coomassie blue. (A)-bovenaanzicht, fluorescentie afbeelding toont de helft van een kolonie voorafgaand aan de fixatie. (B) dwarsdoorsnede van de hele kolonie na paraffine-insluiting. De doos gebied was beeld met een 10 X objectief (C). De doos gebied in (C) werd vervolgens beeld met een 40 X olie immersie objectief met behulp van fluorescentie (D) en DIC (E). Schaal staven 2 mm (A), 500 µm (B) en 100 µm (C-E). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Verslaggever expressie, pre- en post kleuring van biofilm functies en TEM beeldvorming van paraffine-ingebedde kolonie biofilm monsters.
(A) mexGPr-GFP verslaggever fluorescentie in een kolonie van de P. aeruginosa PA14 geteeld voor 3 dagen op 1% trypton, 1% agar. (B) fluorescentie van afhankelijke Congo rood in een kolonie van de P. synxantha gegroeid voor 5 dagen op een medium met de kleurstof. (C) fluorescentie van de Wisteria floribunda lectine vlek voor Pel polysacharide in een P. aeruginosa PA14 Δphz kolonie (gekweekt voor 2 dagen op 1% trypton, 1% agar met Congo rood en Coomassie blue), toegepast na segmenteren. (D) TEM afbeelding van een P. aeruginosa PA14 Δphz kolonie (gekweekt voor 3 dagen op 1% trypton, 1% agar met Congo rood en Coomassie blue), en verwerkt voor het segmenteren via paraffine insluiten *. Schaal staaf vertegenwoordigt 40 µm (A-B), 20 µm (C) en 5 µm (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
* Dit voorbeeld was verwerkt voor het segmenteren via paraffine-insluiting t/m stap 4 van het bovengenoemde protocol, weglaten van stappen 4.1-4.3, en vervolgens afzonderlijk verwerkt voor TEM analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Paraffine-insluiting en dun-afdelen weefselsteekproeven is een klassieke histologische techniek die toelaat beeldvorming van micro-morfologische structuren en wordt vaak gebruikt op eukaryotische weefsels, en met enig succes is vereffend met microbiële monsters8 ,9. Terwijl cryoembedding voor sterke eigendomsvoorbehoud endogene en immunefluorescentie signaal zorgt, is het insluiten van paraffine over het algemeen beter als het biedt beter behoud van morfologie16. In deze methode voor toepassing op microbiële biofilms aan te passen, we gericht op de kenmerken die uniek voor ons systeem zijn. De matrix van weefsels en cellen worden vaak samengehouden relatief krachtig, terwijl biofilms de neiging om meer delicate; We geoptimaliseerd dan ook routine fixatie en wax insluiten protocollen om te monster retentie te maximaliseren. Behoud van het monster op zijn groei substraat en bedekken de kolonie met agar onmiddellijk voorafgaand aan de fixatie ervan vergewist dat de steekproef geen verloren van de boven- of de base. Echter kan overlappen kolonies met agar dat is te warm schade aan de kolonies, dus extra zorg moet worden genomen tijdens deze stap.
Fixatie is een cruciale stap voor het behoud van de structuur door de harde uitdroging, clearing, en infiltratie stappen vereist voor het insluiten van paraffine. We vonden dat best lysine-formaldehyde-fixatie behoudt de integriteit van het monster. Oplosbare lysine, een diamine, kan reageren met aldehyden vormen gecrosslinkte polymeren en heeft voorgesteld ter versterking van de exopolymeric stof (EPS) tegen de aantasting van de mechanische17,18.
Wij hebben geconstateerd dat de achtergrond fluorescentie met opeenvolgende wast in de oranje olie gebaseerde clearing-agent, of door langdurige blootstelling, tijdens monster rehydratie (stap 9.3 dalingen). Overmatige behandeling met de clearing-agent kan echter resulteren in broos monsters die moeilijk te paragraaf19. Het eventueel aanpassen van het volume of het aantal wasbeurten aan de hoeveelheid wax aanwezig tijdens elke rehydratie. Meer achtergrond fluorescentie kan ook voortvloeien uit besmetting van het weefsel verwerking reagentia, waar de wax, die iets autofluorescent is, is geheel of gedeeltelijk mengbaar in de clearing oplosmiddel of ethanol gebruikt in deze stappen (stappen 6.1-6.4). Bovendien, we hebben gevonden dat ethanol verslaggever signaal vermindert, en het is van cruciaal belang voor het opnieuw vormen van de fluorophore in twee wasbeurten van PBS vóór montage (stap 9.5-9.6).
Deze methode staat ook voor de lokalisatie van constituerende en promotor gestuurde fluorescentie bij de resolutie van de cellen. Wij adviseren echter voorzichtigheid bij het gebruik van deze methode te interpreteren van genexpressie. De stap van de overlay geïntroduceerd in dit protocol (stap 4.2), toegepast vóór fixatie ten 50 ˚C, presenteert een aanzienlijke veranderingen in het milieu ten opzichte van de initiële groei-omstandigheden die gen-expressiepatronen kunnen beïnvloeden. Het wellicht nuttig om te controleren of expressiepatronen door fixeerspray naar de kolonie direct, onmiddellijk voorafgaand aan de overlay gieten, maar tegen een kostprijs op morfologie (een optionele stap 3.1-3.3) te passen.
Een andere factor die de interpretatie van de fluorescentie is de topografie van de sectie zelf. Verschillende regio's van de biofilm kunnen vertonen wisselend structurele integriteit en worden min of meer vatbaar voor behoud via fixatie, afhankelijk van welke, indien van toepassing, functionele groepen die componenten kunnen bijdragen aan kleefpoeders dwarsbinding zijn 20. Dientengevolge secties kunnen verliezen biomassa onevenredig van het oppervlak van de sectie wanneer het transitioning van één morfologische of metabole zone naar de andere langs de z-as van de kolonie. Dit kan worden opgelost door een intact focal segment van de sectie imaging met een confocal microscoop.
Naast het toepassen van deze techniek te stammen ontworpen om uitdrukkelijke fluorescente proteïnen, hebben we onderzocht micromorphological functies door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en in de biofilm monsters gekleurd met specifieke fluorescente kleurstoffen (figuur 3A ). Jennings et al. beschreef onlangs een kleurstof specifiek voor Pel, de grote polysaccharide geproduceerd door P. aeruginosa PA14 biofilms 21. Zoals beschreven in het protocol en vertegenwoordiger resultaten hierboven, is toepassing van deze kleurstof op secties voorziet van visualisatie van Pel distributie in PA14 kolonie biofilms op hoge resolutie (Figuur 3 c) 3. Omgekeerd, fluorescente kleurstoffen zoals Congo rood kunnen worden toegevoegd aan het groeimedium en beeld na vectorafbeeldingsbestanden (figuur 3B). De toepassing van een overlay behoudt ook kolonie biofilm morfologie en cel structuur in de gehele verwerking voor TEM (figuur 3D).
De hier beschreven geoptimaliseerde methode maakt de voorbereiding van de kolonie biofilms voor segmenteren via het insluiten van paraffine, waarin de endogene signaal en functies of complexvorm kleurstoffen kunnen worden gelokaliseerd in vivo met superieure resolutie terwijl het minimaliseren van monster verlies en het behoud van inheemse kolonie macro - en micro-morphologies. We erkennen dat aanzienlijke inspanning, tijd en reagens gebruik nodig zijn voor deze methode. Wij vinden dat deze nadelen worden tegengegaan door de mate van morfologische behoud, de resolutie van fluorescentie in situ en de inschikkelijkheid pre-en post kleuring procedures of alternatieve verwerking strategieën (zoals voorbereiding TEM) die worden geboden door deze techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de NSF carrière AWARD 1553023 en NIH/NIAID award R01AI103369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
