Summary
Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.
Abstract
Parafin katıştırma üzerinden kesit bir genel olarak kurulan ökaryotik sistemlerinde bir tekniktir. Burada biz gömme ve bozulmamış mikrobiyal koloni biyofilmler periosteum parafin balmumu kullanarak kesit fiksasyon için bir yöntem sağlayın. Bu yöntem koloni biyofilmler kullanmak için adapte, agar overlayer ile laminasyon ve her örnek, büyüme substrat olarak muhafaza geliştirilen ve lizin sabitleştirici çözümü eklendi. Bu en iyi duruma getirmeleri örnek saklama ve koruma micromorphological özellikleri geliştirmek. Bu şekilde hazırlanan numune kesit ve ışığı, floresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile düşsel ince mükellef bulunmaktadır. Bu teknik, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisve Vibrio choleraekoloni biyofilmler için başvurdum. Ayrıntı bu yöntemle oluşturulan örneklerinde görünür yüksek düzeyde muhabir gerilme ile birlikte mühendislik veya belirli boya, kullanımı heyecan verici yorumlara fizyolojisi ve mikrobiyal topluluklar gelişimi sağlayabilir.
Introduction
Çoğu mikroplar için formu biyofilmler kapasitesine sahip, hücre toplulukları birlikte kendi ürettiği matrisler tarafından düzenlenen. Biyofilmler fiziksel kurulumları, birçok türde besin ve substrat hükmün çeşitli rejimleri ile yetiştirilen olabilir. Biyofilm oluşumu için belirli deneyleri tekrarlanabilir çok hücreli yapıları verim eğilimi ve ortak mimariler topluluk veya makroskopik düzeyinde filogenetik çeşitli türler için gözlenir. Mikroplar bir atmosfer altında katı ortamdaki koloniler yetiştirilmektedir, makroskopik Morfoloji için matris üretim kapasitesi hakkında bilgi veriyor ve sık sık diğer özellikleri 1,2,3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Mikrobiyal kolonileri iç mimarisini de biyofilm özel kimya ve fizyolojisi ile ilgili ipuçları sağlayabilir ama karakterize için zor olmuştur. Cryoembedding ve cryosectioning teknikleri son uygulamaları bakteri kolonileri için görüntüleme ve görselleştirme benzeri görülmemiş çözünürlük 4,5,6' daki belirli özelliklerin etkinleştirdiniz. Ancak, çalışmalar ile hayvan doku parafin gömme cryoembedding 7 ' ye göre Morfoloji üstün koruma sağlar ve bakteri doku 8,9görselleştirmek için kullanılan göstermiştir. Bu nedenle bir protokol fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler ince kesit için geliştirdik. Burada, Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biyofilm ince kesitler 10,11hazırlanması anlatacağız ama biz de başarıyla bu teknik bakteriler tarafından kurulan biyofilmler başvuran Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ve Vibrio cholerae12.
İşlemi parafin gömme ve ince kesit biyofilmler için basit bir mantık uygulanabilir. İlk olarak, biyofilmler Morfoloji işleme sırasında korumak için agar tabakası kaplı. İkinci olarak, kaplı biyofilmler bir sabitleştirici crosslink oluştururlar sular altında ve micromorphology korumak. Bunlar, bir daha kutup solvent ile temizlenir, alkol ile sıvı kaybı ve Sıvı parafin balmumu ile sızmış. Sızmış bir kez örnekleri kesit için balmumu bloklara yerleştirilmiştir. Bölümler kesmek, slaytların üzerine monte edilmiş ve sonra onları daha yerel bir duruma döndürmek için rehydrated. Bu noktadan sonra onlar lekeli veya montaj orta mikroskobik analizlerin yapıldığı için kapalı.
Bu iletişim kuralı ince mikrobiyal biyofilmler histolojik analiz için uygun bölümlerini üretir. Bu yöntem kullanılarak hazırlanan ince bölümleri tarafından ışık mikroskobu görüntüsü zaman koloni biyofilm kümelendirilebilir görülebilir. Biyofilmler Ayrıca medya içeren floresan lekesi için bireysel özellikleri belirli yetiştirilen veya hemen önce (adım 9.5-9,6) Montaj rehidrasyon aşamada lekeli. Son olarak, mikroplar floresan proteinler hücre dağıtım veya gen ifade bu topluluklar içinde in situ raporlama sağlayan bir kurucu veya düzenlenmiş moda üretmek için tasarlanmış. Koloni biyofilm derinlik, hücre dağıtım, matris dağılım, büyüme kalıpları ve kronolojik zamanmekansal gen ekspresyonu belirlemek için bu yöntemler kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Pseudomonas aeruginosa koloni biyofilmler büyüme
- Orta-Bilayer plakaları hazırlanması
- Hazırlamak bir 10 g/L tryptone, 10 g/M agar (bakınız Tablo reçetesi) çözüm deiyonize su.
- Otoklav 20 dk. 50-60 ° c serin bir su banyosunda.
- 45 mL agar-tryptone çözeltisi bir 100 x 100 mm kare tabak içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL konik tüp kullanarak. Agar kuvvetlendirmek izin (~ 20-30 dk). İlk katman üzerinde bir ikinci, 15 mL katmanı dökün. Gecede kuvvetlendirmek izin, yoğunlaşma üzerinden kaldırılması gerekirse hav bırakmayan dokusu ile silerek kapakları.
- Koloni biyofilmler lekelenme
- Dondurucu stokları LB Ağar kaplamalar13 üzerine gelen faiz suşları çizgi ve 12-16 h 37 ° C ve 80-%100 bağıl nem, karanlıkta kuluçkaya.
- Her zorlanma veya çoğaltma için bir koloni 2 mL lb aşılamak ve 12-16 250 devir / dakikada sallayarak ile h 37 ° C'de karanlıkta kuluçkaya için kullanın.
- Taze LB ve 250 devir / dakikada sallayarak ile 2,5-3 h 37 ° C'de karanlıkta kuluçka 1: 100 sulandrarak alt kültür.
- Ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ve aşırı doz ile bir hücre süspansiyon ulaşmak için steril LB ile ayarlamak500 nm ~ 0,5.
- Üzerinde istenen kolonisi bağlı olarak boyut, damlalıklı 2.5-10 µL hücre süspansiyon (1.1 adımda hazırlanan) bir orta-bilayer plaka üzerine ve ~ 20 dk. petri kapağı açık alev yakınındaki Aralık bırakarak kurutma kolaylaştırmak için kuru için bir yer sağlar.
- Spot colonies adlı 25 ° C ve 80-%100 bağıl nem, 4 gün için karanlıkta kuluçkaya.
2. sabitleştirici çözüm hazırlanması
- Sabitleştirici çözüm örnek hasat gününde hazırlamak. 1 x PBS son konsantrasyonu % %4 37 formaldehit (FA) seyreltik SK.
Dikkat: SK geçici ve zehirli. Koruyucu ekipman giymek ve iyi havalandırılan bir duman-hood işe. - Kullanımdan hemen önce L-lizin hidroklorür % 4 olarak dağıtılması (2.1 adımda hazırlanan) FA 50 mM L-lizin HCl son bir konsantrasyon için oda sıcaklığında.
3. doğrudan sabitleştirici uygulamaya koloni biyofilm [isteğe bağlı]
Not: Biz agar bindirme fiksasyon önce eklendiğinde biyofilm Morfoloji en iyi korunmuş bulduk. Ancak, bu adımı da gen ifadesinin etkileyebilecek çevre koşullarında bir değişiklik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Floresan muhabir ifade desenleri bu nedenle burada açıklandığı gibi fiksasyon adım agar yerleşimi, toplamadan önce içinde yapılan ayrı bir iletişim kuralı kullanılarak doğrulanması gerekir.
- Fiksasyon ve iyi havalandırılan bir duman mahallede çalışma günü, koloni'nın kenar, koloni'nın çevre batış olmadan ulaşmak izin etrafında agar yüzeye doğrudan 2. adımda hazırlanan sabitleştirici pipette. Koloni için tam gerektiği kadar sabitleştirici surround olarak yaklaşık 500 µL. izin sadece koloni ve çevresindeki agar yaygın sabitleştirici uygulanır.
- Bir kez sabitleştirici koloni ve çevre medya, yaklaşık 20-30 dakika, tamamen absorbe olmuştur ve kalan SK artık plaka üzerinde görünür, 3.1 arasındaki adımları yineleyin. Bu sabitleştirici koloni ve çevresindeki agar yaygın izin.
- Sabitleştirici tamamen koloni içine emilir ve çevresindeki edildikten sonra medya 3.1, bu sefer sabitleştirici koloni yüzeyine doğrudan uygulama adımları yineleyin. Bu sabitleştirici koloni ve çevresindeki agar yaygın izin, adım 4'e sadece devam sonuçta sabitleştirici absorbe oldu ve artık plaka üzerinde görünür.
4. overlaying kolonileri Agar ile
- Fiksasyon günü, 10 g/M agar çözüm deiyonize su ve basınçlı kap çözülmeye 10-20 dakika içinde hazır olun. Bir su banyosu 50 ˚C için serin.
- Yavaşça agar çözüm 15 mL büyüme orta ve koloni üzerine dökün. Agar 5 min (şekil 1B) için oda sıcaklığında bir jel oluşturmak olanak sağlar.
- Keskin bir ustura arasında en iyi iki kat lamine koloni ile bir kare, 3 katmanlı chuck kesmek için kullanın. Birden çok örnekleri hazırlama, her chuck karşılaştırılabilir bir boyutuna kesme emin.
- Yavaşça aşırı agar koloni içeren Chuck'tan çıkarın.
- Agar (koloni içeren) iki üst kat chuck (şekil 1 c) alt tabaka uzakta kaldırmak için bir spatula 1 x PBS veya su düz kafa ıslak ve yavaşça arasında üst ve alt Katmanlar ekleyin. Lamine koloni alt katmandan ayrı olmalıdır. Deforme etmek ya da ne zaman onun tabanından kaldırarak lamine koloni viraj değil dikkatli olun.
5. fiksasyon
- Gömme bir kaset lamine kolonisi (yani, 2 katlı chuck) Aktarım hemen bir iyi havalandırılmış duman-başlık, çalışma (bakınız Tablo malzemeler), etiketli bir kimyasal dayanıklı işaretleme kalemiyle. Bir cam slayt mailler gömme kaset yerleştirin (bkz. tablo malzemelerin) 2.1-2.2 adımda hazırlanan sabitleştirici içeren. Gömme kaset içinde hapsolmuş hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.
- Oda sıcaklığında karanlık gecede sabitleştirici örnekte kuluçkaya.
6. örnek işleme: Arabellek yıkama, su kaybı, takas ve infiltrasyon
- Gecede fiksasyon sonra örnek iki kez 1 x PBS için 1 h yıkayın. En iyi sonuçlar için reaktif homojenizasyon spin kullanarak otomatikleştirmek işlevi bir otomatik doku işlemcinin düşük bir ayara ayarla (malzemelerin tabloya bakın). Hiçbir işlemcisi varsa, işleme el ile çalıştırabilirsiniz.
- 1s için her oda sıcaklığında dehidratasyon etanol (alkol) dilutions 1 x PBS (% 25, % 50, % 70, % 95) içinde kademeli bir dizi tarafından arabellek yıkama izleyin.
- % 100 üç yıkar kurutmak için 1 h her oda sıcaklığında alkol.
- % 100 portakal yağ bazlı temizleme aracının üç yıkama susuz örnekte temizleyin (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında her 1 h için.
- Temizlenen örnek iki kez ile erimiş parafin balmumu (bkz. Tablo reçetesi) sızmak ısıtmalı 2 h için 55˚C için.
7. örnek katıştırma
- Bir mum kalıp için 55 ˚C ısıtılan erimiş parafin mum ile doldurun. Bir ısıtmalı, düz spatula gömme kaset infiltre chuck chuck kalıp tabanına paralel aittir sağlanması mum kalıp içine hızlı bir şekilde aktarmak için kullanın. Chuck üzerine aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Mum kalıpları özel 3 boyutlu baskılı olabilir veya piyasada bulunan ( Tablo reçetesi' ya bak›n).
- Gecede 4 ˚C kuvvetlendirmek balmumu izin. Katı mum kalıp örnekleri 4 ˚C süresiz olarak depolanabilir.
- Bir kez balmumu katılaşmış, kalıp örnekten tüketim ve fazla balmumu bir tıraş bıçağı ile örnek etrafında döşeme. Microtome kelepçe için kullanılan örnek, kesit, uçağa paralel bir ucunu uzanan aşırı balmumu bırakın ( Tablo malzemelerigörmek). Ayrıca balmumu, yaklaşık 1 mm kalın, örnek etrafında kılıf bırakın ve onun yüzleri pürüzsüz.
8. kesit
- Bir su banyosu için 42 ˚C ısı. Örnek microtome yüzeye dik bıçak kenarına odaklı koloninin içine kelepçe ( Tablo malzemelerigörmek).
- Kadar koloni istenen boyutunda ulaştı, hangi bölümlerde toplanacak örnek 50 µm aralıklarla kırpın.
- İstenen sayıda 10 µm kalınlığında bölümü 75-80 rpm bir parça hız ve bir boşluk açısı 6-10˚ olarak ayarlanmış bir microtome kullanarak bir şerit kesin. Şerit'ten bıçak ayırmak için ince uçlu bir fırça kullanın.
- Pasteur pipet (tercih edilen) veya forseps ucunda bir damla su kullanarak, yavaşça su banyosu için transfer folyosunu. Bindirme hava kabarcıkları altında belgili tanımlık parça önlemek için dikkatli olun.
- Hemen su banyosu bir slayt ekleyin ve bir 45˚ açıyla şerit altında konumlandırın.
- Sadece buzlu etiketinin altında slayt Şerite dar kenarı dokun. Şerit i uygun olmalıdır.
- Slayt su yüzeyine dik olmak için açı ayarlayarak ve slayt uzunluğu boyunca karşı yat için şerit i sağlayan su banyosu dışarı çekin. Şerit altında aşırı su bindirme kaçının.
- Yavaşça slayt bölümünde aşırı su esneklik emici bir hav bırakmayan dokusu üzerine standı.
- Slaydı bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu ve gece karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Slaytlar, karanlıkta 4 ˚C süresiz olarak saklanır.
9. ısı sabitleme, rehidrasyon ve montaj
- Düzeltilmiş elektrikli Ocak 45 ˚C için ısı. Slayt için 30-60 dk ısı. Balmumu yarı erimiş olmak ve slayt karşı düzleştirin.
- Yavaşça sıcak plaka slayttan kaldırın ve yatıyordu kullanarak bir düz, düzeltilmiş, oda sıcaklığında yüzeye düz kulak balmumu (~ 1 dk) katılaşır kadar erimiş mum slayt, her iki tarafına çekin değil olduğunu emin olmak.
- Bir cam slayt mailler kullanarak, dört yıkar yıkar arasında çözüm kaldırmak için bir Büchner aspiratör kullanarak Aracısı 5 dk her, açıklığın slaytları de-balmumu.
- Slaytları üç kere % 100 yıkama alkol 1 dk için.
- Etanol (% 95, % 70, % 50 ve % 25) her iki 1-dak yıkar 1 x PBS ardından 1dk için işleme tersten kademeli bir dizi slayt rehydrate.
- Hemen Tris tamponlanmış montaj orta bölümlerinde mount ( Tablo malzemelerigörmek) ve hava kabarcıkları getirilmesi kaçınarak bir coverslip uygulayın. Gecede oda sıcaklığında polimerize için montaj orta izin.
- Sonra polimerli, coverslip açık oje kullanarak slayt için mühür. Kapalı slaytlar süresiz olarak 4 ˚C kararınca depolanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yöntem biyofilm ince-neyin farklı Morfolojik özellikleri ve gen ekspresyonu bölgeleri DIC, Floresans mikroskobu ve TEM tarafından yansıması bölümleri oluşturur. DIC görüntüleme 40 X yağı daldırma amacı istimal bazı Morfolojik özellikleri (şekil 2E) göstermek yeterli olabilir, biz o floresan bulduk mikroskobu yapısal ifade floresan protein Mühendisliği suşları sağlar gelişmiş hücre dağıtım örnek (şekil 2B) içinde görselleştirme. Tek tek bölümler görüntülerini birlikte tüm koloni (2B şekil) bir kesit oluşturmak için ve genel morfolojisi (Karşılaştır makroskopik düzeyde içinde yapısal özellikleri yerelleştirme için bağlam sağlamak için dikişli Şekil 2A, B ve C). Morfolojik özellikleri ve floresan sinyallerini kullanarak görüntüleme yazılımı14ölçülebilir. Yapıları biyofilm veya gen ekspresyonu bölgeleri arasında geçişler içinde sonra metabolitleri veya kimyasal degradeler11 dağıtımları ile ilişkili olabilir.
Bu iletişim kuralı değiştirilmiş ve birkaç şekilde uyarlanmış. Belirli bir organizatörü kontrol altında ifade floresan protein için tasarlanmış bir yük görselleştirme gen ekspresyonu (şekil 3A) dağılımı sağlar. Koloniler boya, içeren ortamda yetiştirilen olabilir veya boya sonrası kesit eklenebilir, belirli polisakkaritler leke (3B ve C rakamlar). Son olarak, bu iletişim kuralı değiştirilmiş bir sürümü hazır örnekleri DIC tarafından etkin daha yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin vermek için TEM (şekil 3D) veya floresan mikroskopi tarafından incelenebilir.
Resim 1: Kurulum fiksasyon önce koloni büyüme için tasvir şematik.
(A) koloniler agar katılaşmış büyüme orta (üst ve alt) iki kat üzerinde büyüdü ve o zaman koloni morfolojisi koruyan ek katmanı ile (bindirme), overlaid (B). (C) bindirme ve üst tabaka arasında gözükeceksin koloni sonra işlenmesi için alt katmana ayrılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Micromorphological özellikleri ve YFP floresan kesit parafin gömülü kolonileri içinde.
Yapısal YFP ifade bir Pseudomonas aeruginosa PA14 Δateran koloni için15 temsilcisi veri ve % 1 tryptone, %1 agar Kongo kırmızısı ve Coomassie içeren 3 gün boyunca mavi büyüdü. (A) üst-görünümü, bir koloni fiksasyon önce yarısı gösterilen floresan görüntü. (B) kesit parafin gömme sonra tüm koloninin. Kutulu alan bir 10 X objektif lens (C) görüntüsü. (C) kutulu alanda o zaman 40 X yağı daldırma objektif lens floresan (D) ve DIC (E) kullanarak yansıma. Ölçek çubukları 2 mm (A), 500 µm (B) ve 100 µm (C-E) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Gazeteci ifade, öncesi ve sonrası biyofilm özellikleri ve TEM görüntüleme parafin gömülü koloni biyofilm örnekleri boyama.
(a) mexGPr-GFP muhabir floresan 3 gün boyunca üzerinde % 1 tryptone, %1 agar yetiştirilen bir P. aeruginosa PA14 koloni. (B) ilişkili Kongo kırmızısı 5 gün için boya içeren bir ortamda yetişen bir P. synxantha koloni floresan. (C) Pel polisakkarit kesit sonra uygulanan (2 gün için % 1 tryptone, %1 agar içeren Kongo kırmızısı ve Coomassie mavi yetiştirilen) bir P. aeruginosa PA14 Δateran Colony, Wisteria floribunda lektin leke floresan. (D) TEM görüntüsü (% 1 tryptone, %1 agar Kongo kırmızısı ve Coomassie içeren 3 gün boyunca mavi büyüdü), P. aeruginosa PA14 Δateran kolonisi ve parafin katıştırma üzerinden kesit için işlenen *. Ölçek çubuğu 40 µm (A-B), 20 µm (C) ve 5 mikron (D) temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
* Bu örnek ile adım adım 4.1-4.3, atlama 4 yukarıdaki iletişim kuralı, parafin katıştırma üzerinden kesit için işlenen ve ayrı olarak işlenen TEM analiz için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Parafin gömme ve ince kesit doku örnekleri mikro morfolojik yapılarının görüntüleme sağlar ve ökaryotik dokular üzerinde yaygın olarak kullanılan ve bazı başarı ile mikrobiyal örnekleri8 için uygulanan bir tekniktir klasik histolojik ,9. Cryoembedding endojen ve immünfloresan sinyal güçlü saklamak için izin verirken, Morfoloji16daha iyi koruma sağladığından parafin katıştırma genellikle tercih edilir. Bu yöntem uygulama mikrobiyal biyofilmler için uyum içinde bizim sisteme özgü özellikleri üzerinde duruldu. Biyofilmler daha hassas olma eğilimi olsa hücre ve dokuların matris kez birlikte nispeten sağlam tutulur; Bu nedenle rutin fiksasyon ve örnek saklama en üst düzeye çıkarmak için protokolleri katıştırma balmumu optimize. Örnek üzerinde büyüme substrat Bakımı ve agar hemen önce fiksasyon ile koloni overlaying örnek üst veya temeli kayıp değil sağlar. Ancak, bu adımı sırasında ekstra dikkat edilmelidir böylece kolonileri çok sıcak agar ile overlaying koloniler, zarar verebilir.
Fiksasyon takas, sert dehidrasyon yoluyla yapısını koruyarak için kritik bir adımdır ve infiltrasyon adımlar parafin gömmek için gerekli. Bulduğumuz o lizin-formaldehit fiksasyon en iyi örnek bütünlüğünü korur. Çözünür lizin, bir diamin, aldehitler ile çapraz bağlı polimerler oluşturmak için tepki verebilir ve exopolymeric madde (EPS) mekanik bozulma17,18karşı güçlendirmek için önerilmiştir.
Arka plan Floresans örnek rehidrasyon (adım 9,3) sırasında ardışık yıkar turuncu yağ bazlı Temizleme Aracısı veya uzun süreli maruz kalma, aracılığıyla ile düşüş gözlemledik. Ancak, temizleme aracı ile aşırı tedavi bölüm19' a zor olan kırılgan örneklerinde sonuçlanabilir. Birim veya mum her rehidrasyon sırasında mevcut miktar yansıtacak şekilde yıkar sayısını ayarlamak gerekli olabilir. Artan arka plan Floresans aynı şekilde kontaminasyon reaktifler, biraz autofluorescent olan balmumu, tamamen veya kısmen takas solvent veya aşağıdaki adımları (adım kullanılan etanol karışan nerede işleme doku üzerinden ortaya çıkabilir 6.1 6.4). buna ek olarak, biz bulduk etanol muhabir sinyali azalır ve PBS iki yıkama fluorophore (adım 9.5-9,6) Montaj öncesinde yeniden oluşturmak için önemlidir.
Bu yöntem aynı zamanda kurucu ve organizatörü uygulamalı floresan hücreleri çözünürlükte yerelleştirmesini sağlar. Ancak, biz dikkat ne zaman gen ekspresyonu yorumlamak için bu yöntemi kullanarak öneriyoruz. Fiksasyon, 50 ˚C, önce uygulanan bu iletişim kuralı (Adım 4.2), ortaya çıkan bindirme adım gen ifade desenleri etkileyebilecek ilk büyüme koşullarına göre önemli bir çevresel değişimin sunar. Doğrudan kolonisi, hemen önce bindirmeyi dökme, ama bir maliyetle Morfoloji (isteğe bağlı adım 3.1-3.3) sabitleştirici uygulayarak ifade desenleri doğrulamak yararlı olabilir.
Floresans yorumu etkileyen başka bir bölümün kendisini topografya faktördür. Biyofilm farklı bölgelerinde yapısal bütünlük değişen derecelerde sergi ve az ya da yolu ile fiksasyon, bunun üzerine, bağlı olarak korunması için mükellef varsa, Fonksiyonel grupların bu bileşenlerin sabitleştirici cross-linking için katkıda edebiliyoruz 20. sonuç olarak, Bölüm biyokütle orantısız bölümü yüzeyden bir morfolojik veya metabolik bölgesinden koloni'nın z ekseni boyunca diğerine geçiş kaybedebilirsiniz. Bu bölümünün sağlam bir odak dilim confocal mikroskop düşsel tarafından ele.
Bu teknik ifade floresan protein Mühendisliği suşları için uygulamanın yanı sıra, biz micromorphological özellikleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve biyofilm örnekleri belirli floresan boyalar (şekil 3A ile lekeli inceledik ). Jennings ve ark. son zamanlarda Pel, P. aeruginosa PA14 biyofilmler 21tarafından üretilen büyük polisakkarit için boya belirli bir tarif. Yukarıdaki Protokolü ve temsilcisi sonuçları içinde açıklandığı gibi bu boya uygulama bölümlerine görselleştirme PA14 koloni biyofilmler yüksek çözünürlüklü (şekil 3 c) 3Pel dağıtım sağlar. Diğer taraftan, Kongo kırmızısı gibi floresan boyalar büyüme ortamına eklenebilir ve sonrası parça (şekil 3B) görüntüsü. Bir bindirme uygulama aynı zamanda işleme için TEM (3D şekil) boyunca koloni biyofilm morfoloji ve hücre yapısını korur.
Koloni biyofilmler hazırlanması parafin katıştırma üzerinden kesit için burada açıklanan en iyi duruma getirilmiş yöntem sağlar, neyin endojen sinyal ve özellikleri veya complexed boya olabilir vivo içinde üstün çözünürlüğü ile örnek en aza indirerek lokalize kaybı ve yerel koloni makro - ve mikro-türleri Morfoloji koruyarak. Önemli çaba, zaman ve reaktif kullanım bu yöntem için gerekli olduğunu kabul. Ancak, biz bu sakıncaları morfolojik korunması, situ Floresans çözümlenmesi ve amenability öncesi ve sonrası boyama yordamlara veya alternatif işleme stratejileri (örneğin için hazırlık derecesini tarafından karşılık hissediyorum TEM) tanınan bu tekniği ile.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NSF kariyer Ödülü 1553023 ve NIH/NIAID Ödülü R01AI103369 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
