Summary
Wir beschreiben, Fixierung, Paraffin einbetten und dünne Stationspunkte Techniken für mikrobielle Kolonie Biofilmen. In vorbereiteten Proben können Biofilm Unterkonstruktion und Reporter Expressionsmuster von Mikroskopie visualisiert werden.
Abstract
Über Paraffin einbetten-Schnitt ist eine weitgehend etablierte Methode in eukaryontischen Systemen. Hier bieten wir eine Methode zur Fixierung, einbetten und intakte mikrobielle Kolonie Biofilme mit perfundierten Paraffin-Wachs-Schnitt. Um diese Methode für den Einsatz auf Kolonie Biofilme anzupassen, wir entwickelten Techniken für die Pflege jedes Sample auf seine Wachstumssubstrat und mit einer Agar-Overlayer Laminieren und Lysin Fixativ Projektmappe hinzugefügt. Diese Optimierungen verbessern Probe Aufbewahrung und Erhaltung der mikromorphologischer Funktionen. Proben, die auf diese Weise zubereitet sind dünn schneiden und Bildgebung durch Licht, Fluoreszenz, und Transmissionselektronenmikroskopie zugänglich. Wir haben diese Technik auf Kolonie Biofilmen von Pseudomonas Aeruginosa, Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilisund Vibrio Choleraeangewandt. Das hohe Niveau der Details sichtbar in Proben von dieser Methode generiert kombiniert mit Reporter Stamm Engineering oder die Verwendung von bestimmten Farbstoffen, bieten spannende Einblicke in die Physiologie und Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften.
Introduction
Die meisten Mikroben haben die Fähigkeit, Form Biofilme, zusammengehalten Gemeinschaften von Zellen durch selbst erstellte Matrizen. Biofilme können in vielen Arten von physischen Setups mit verschiedenen Regimen Nährstoff- und Substrat Bestimmung angebaut werden. Spezifischen Assays für die Biofilmbildung tendenziell reproduzierbare vielzellige Strukturen ergeben, und gemeinsame Architekturen für phylogenetisch Artenvielfalt auf der makroskopischen Ebene oder Gemeinschaft eingehalten werden. Wenn Mikroben als Kolonien auf festem Medium unter Atmosphäre gewachsen sind, makroskopische Morphologie vermittelt Informationen über die Kapazität für die Produktion von Matrix und oft korreliert mit anderen Eigenschaften 1,2,3. Die interne Architektur der mikrobiellen Kolonien liefern auch Hinweise auf Biofilm-spezifische Chemie und Physiologie, aber schwer zu charakterisieren. Aktuelle Anwendungen von Cryoembedding und Kryoschneiden Techniken zu Bakterienkolonien ermöglichten Bildgebung und Visualisierung von Besonderheiten in noch nie da gewesenen Auflösung 4,5,6. Studien mit tierischem Gewebe haben jedoch gezeigt, dass Paraffin einbetten bietet hervorragende Erhaltung der Morphologie im Vergleich zu Cryoembedding 7 und verwendet wurde, um Bakterien im Gewebe 8,9zu visualisieren. Deshalb haben wir ein Protokoll zur Fixierung, Paraffin einbetten und dünn schneiden von mikrobiellen Kolonie Biofilmen entwickelt. Hier beschreiben wir die Vorbereitung von Pseudomonas Aeruginosa PA14 Kolonie-Biofilm Dünnschliffe 10,11, aber wir haben diese Technik Biofilme bilden die Bakterien auch erfolgreich angewendet Pseudomonas Synxantha, Bacillus Subtilis, und Vibrio Cholerae12.
Der Prozess von Paraffin einbetten und dünn schneiden Biofilmen folgt einer einfachen Logik. Erstens sind die Biofilme in einer Schicht von Agar, Morphologie während der Verarbeitung zu bewahren umhüllt. Zweitens die eingehüllte Biofilme sind eingetaucht in ein Fixiermittel, Crosslink Makromoleküle und Mikromorphologie bewahren. Diese sind dann mit Alkohol dehydriert, mit einem nicht-polaren Lösungsmittel gelöscht und dann mit flüssigem Paraffin Wachs infiltriert. Sobald infiltriert, sind die Proben eingebettet in Wachs Blöcke für schneiden. Abschnitte sind geschnitten, montiert auf Folien und dann rehydriert um mehr nativen Zustand zurücksenden. Ab diesem Zeitpunkt können sie gebeizt oder in Eindeckmedium für die mikroskopische Analyse abgedeckt.
Dieses Protokoll produziert Dünnschliffe von mikrobiellen Biofilmen für histologische Analyse geeignet. Kolonie Biofilm Unterkonstruktionen sind sichtbar, wenn Dünnschliffe vorbereitet, mit dieser Methode durch Lichtmikroskopie abgebildet werden. Biofilme können auch auf Medien mit fluoreszierenden Flecken angebaut werden spezifisch für einzelne Features oder gebeizt Rehydratation Schritt unmittelbar vor der Montage (Schritte 9.5 9.6). Zu guter Letzt können Mikroben entwickelt werden, um fluoreszierende Proteine in einer konstitutiven oder regulierten Mode ermöglicht Berichten in Situ Zelle Verteilung oder Gen-Ausdrucks innerhalb dieser Gemeinschaften zu produzieren. Wir haben diese Methoden verwendet, um Kolonie Biofilm Tiefe, Zelle Verteilung Matrix Verteilung, Wachstumsmuster und raumzeitlichen Genexpression zu bestimmen.
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Protocol
1. Wachstum von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Kolonie
- Vorbereitung der Medium-Bilayer Platten
- Bereiten Sie eine Tryptone von 10 g/L, 10 g/L Agar (siehe Tabelle der Materialien) Lösung in entionisiertem Wasser.
- Autoklaven für 20 min. Abkühlen auf 50-60 ° C in einem Wasserbad.
- 45 mL der Agar-Tryptone-Lösung in ein 100 x 100 mm quadratische Schale gießen (siehe Tabelle der Materialien) mit einem 50 mL konische Rohr. Ermöglichen das Agar zu festigen (~ 20-30 min). Gießen Sie eine zweite, 15 mL Schicht auf die erste Schicht. Über Nacht erstarren lassen, Deckel entfernen Kondenswasser aus ggf. durch mit einem fusselfreien Tuch abwischen.
- Spotting Kolonie Biofilme
- Streifen Sie die Stämme von Interesse aus den Beständen der Gefrierschrank auf LB-Agar-Platten-13 und inkubieren Sie im Dunkeln für 12-16 h bei 37 ° C und 80-100 % Relative Luftfeuchtigkeit.
- Können Sie für jede Sorte oder replizieren eine einzelne Kolonie impfen 2 mL LB und im Dunkeln für 12-16 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min inkubieren.
- Sub-Kultur durch eine Verdünnung von 1: 100 in frisches LB und im Dunkeln für 2,5-3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 u/min Inkubation.
- Optische Dichte mit einem Spektralphotometer messen und justieren Sie mit sterilen LB eine Zellsuspension mit einer OD zu erreichen500 nm von ~ 0,5.
- Abhängig von der gewünschten Kolonie Größe, Pipettieren 2,5-10 µL Zellsuspension auf einem Medium-Bilayer Teller (vorbereitet in Schritt 1.1) und erlauben Ort trocknen für ~ 20 min. verlassen die Petri-Deckel einen Spalt offen, in der Nähe einer offenen Flamme trocknen erleichtern können.
- Inkubieren Sie vor Ort Kolonien bei 25 ° C und 80-100 % Relative Luftfeuchtigkeit, im Dunkeln für bis zu 4 Tage.
2. Zubereitung der Fixativ
- Bereiten Sie die Fixativ Lösung am Tag der Ernte Probe. Verdünnen Sie 37 % Formaldehyd (FA) mit 1 X PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 % FA.
Achtung: FA ist flüchtig und giftig. Schutzausrüstung tragen und arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug. - Unmittelbar vor der Anwendung, L-Lysin-Hydrochlorid in 4 % auflösen FA (vorbereitet in Schritt 2.1) bei Raumtemperatur, eine Endkonzentration von 50 mM L-Lysin HCl.
3. direkte Anwendung Fixativ auf der Kolonie Biofilm [Optional]
Hinweis: Wir haben festgestellt, dass Biofilm Morphologie ist am besten erhalten, wenn das Agar-Overlay vor Fixierung hinzugefügt wird. Allerdings ist dieser Schritt auch eine Änderung der Umweltbedingungen, die Genexpression beeinflussen könnten. Fluoreszierende Reporter Expressionsmuster sollte daher überprüft werden, mit einem besonderen Protokoll, in dem die Fixierung Schritt vor der Zugabe der Overlay-Agar, durchgeführt wird, wie hier beschrieben.
- Am Tag der Aufzeichnung, und arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug pipette das Fixiermittel vorbereitet in Schritt 2 direkt auf die Agar-Oberfläche um die Kolonie Rand, so dass es zu der Kolonie Peripherie zu erreichen, ohne eintauchen. Gelten Sie nur wie viel Fixiermittel wie voll ist erforderlich, um die Kolonie umgeben, ca. 500 µL. ermöglichen das Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten.
- Sobald das Fixiermittel vollständig absorbiert in die Kolonie und umgebenden Medien, ca. 20-30 min wurde, und passives FA nicht mehr sichtbar auf dem Teller ist, wiederholen Sie Schritt 3.1. Lassen Sie das Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten.
- Sobald das Fixiermittel vollständig absorbiert in die Kolonie wurde und umgebende Medien wiederholen Sie Schritt 3.1, diesmal direkt die Oberfläche der Kolonie Fixiermittel zuweisen. Diese Fixiermittel in der Kolonie und den umliegenden Agar verbreiten lassen, weiter zu Schritt 4 nur nachdem alle Fixativ wurde aufgenommen und ist nicht mehr sichtbar auf dem Teller.
4. überstehende Kolonien mit Agar
- Am Tag der Fixierung bereiten Sie ein 10 g/L Agar Lösung in entionisiertem Wasser und Autoklaven für 10-20 Minuten zu lösen. In einem Wasserbad auf 50 ° c abkühlen.
- Übergießen Sie 15 mL der Lösung Agar sanft das Wachstumsmedium und Kolonie. Ermöglichen der Agar, ein Gel bei Raumtemperatur für 5 min (Abbildung 1 b) zu bilden.
- Verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, schneiden Sie ein Quadrat, 3-lagig Futter mit der Kolonie zwischen den oberen beiden Schichten laminiert. Wenn mehrere Proben vorbereiten, sicherzustellen Sie, dass jedes Futter auf eine vergleichbare Größe geschnitten wird.
- Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Agar aus der Kolonie-haltigen Futter.
- Um die beiden oberen Schichten des Nährbodens (mit der Kolonie) Weg von der Unterschicht des Futters (Abbildung 1) zu heben, den flachen Kopf einer Spachtel in 1 x PBS oder Wasser nass und sanft zwischen den oberen und unteren Schichten einfügen. Die laminierte Kolonie sollte die Unterschicht trennen. Achten Sie darauf, nicht zu verfälschen oder die laminierte Kolonie zu biegen, wenn es von seinem Sockel heben.
5. Fixierung
- Arbeiten in einem gut gelüfteten Abzug sofort die laminierte Kolonie (d. h. 2-lagige Chuck) in einer Einbettung Kassette übertragen (siehe Tabelle der Materialien), gekennzeichnet mit einem chemikalienbeständigen Markierstift. Legen Sie die einbettende Kassette in ein Glas-Folie-Mailer (siehe Tabelle der Materialien), enthält das Fixiermittel in Schritte 2.1-2.2 vorbereitet. Stellen Sie sicher, es gibt keine Luftblasen in der einbettenden Kassette gefangen.
- Inkubieren Sie die Probe im Fixiermittel über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur.
6. Probenverarbeitung: Puffer waschen, Austrocknung, Clearing und Infiltration
- Waschen Sie nach der Übernachtung Fixierung die Probe zweimal mit 1 X PBS-Puffer für 1 h. Die besten Ergebnisse zu automatisieren Reagenz Homogenisierung mit dem Spin Funktion eines automatischen Gewebe-Prozessors (siehe Tabelle der Materialien) auf einer niedrigen Einstellung eingestellt. Wenn kein Prozessor verfügbar ist, kann die Verarbeitung manuell ausgeführt werden.
- Folgen Sie das Puffer waschen durch Wasserentzug durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (EtOH) Verdünnungen mit 1 X PBS-Puffer (25 %, 50 %, 70 %, 95 %) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Entwässern in drei wäscht von 100 % EtOH für 1 h bei Raumtemperatur.
- Deutlich dehydrierte Probe in drei wäscht von 100 % orange Öl basierenden Clearing Agent (siehe Tabelle der Materialien) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Infiltrieren die geräumte Stichprobe zweimal mit geschmolzenem Paraffin Wachs (siehe Tabelle der Materialien), beheizt bis 55˚C, 2 h.
7. Probe einbetten
- Füllen Sie ein Wachs Schimmel mit flüssigem Paraffin Wachs auf 55 ° c erhitzt. Mit einem Spatel beheizten, flache schnell übertragen das eingedrungene Futter aus der Einbettung Kassette in die Wachs-Form, um sicherzustellen, dass das Futter Parallel zur Grundfläche des Schimmels liegt. Vermeiden Sie übermäßigen Druck auf das Spannfutter. Wachs Formen können benutzerdefinierte 3-d gedruckt werden oder sind im Handel erhältlich (siehe Tabelle der Materialien).
- Lassen Sie Wachs, über Nacht bei 4 ° c erstarren. Proben in feste Wachs geformt können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° c gelagert werden.
- Sobald das Wachs erstarrt ist, Verbrauchsteuern Sie die Probe aus der Form und schneiden Sie überschüssiges Wachs aus um die Probe mit einer Rasierklinge. Überschüssiges Wachs erstreckt sich von einem Ende der Probe, parallel zur Ebene der Schnitt, die verwendet werden, um es in das Mikrotom Klemme zu verlassen (siehe Tabelle der Materialien). Auch eine Hülle aus Wachs, ca. 1 mm dick, um die Probe verlassen und seine Flächen zu glätten.
8. Schneiden
- Erhitzen Sie ein Wasserbad auf 42 ° c. Klemmen Sie die Probe in das Mikrotom mit der Oberfläche der Kolonie senkrecht orientiert sich an den Rand des Blattes (siehe Tabelle der Materialien).
- Schneiden Sie die Probe in Intervallen von 50 µm, bis die gewünschte Ebene der Kolonie erreicht worden ist, aus denen Abschnitte erfasst werden.
- Schneiden Sie eine Band von die gewünschte Anzahl von 10 µm dicke Abschnitte mit einem Mikrotom legen Sie auf einer speziellen Geschwindigkeit von 75-80 u/min und einen Freiwinkel von 6-10˚. Verwenden Sie einen feinen Spitzen Pinsel, um das Band von der Klinge zu lösen.
- Übertragen Sie das Band mit einem Tropfen Wasser an der Spitze einer Pasteurpipette (bevorzugt) oder Zange, sanft auf das Wasserbad werden. Achten Sie darauf, um Trapping Luftblasen unter dem Abschnitt zu vermeiden.
- Sofort fügen Sie eine Folie in das Wasserbad und positionieren Sie es unterhalb des Menübands in einem Winkel von 45°.
- Tippen Sie auf den schmalen Rand der Multifunktionsleiste auf die Folie, knapp unterhalb der mattierten Label. Das Band sollte halten.
- Ziehen Sie die Folie aus dem Wasserbad, Einstellung des Winkels, senkrecht zur Oberfläche des Wassers zu werden, und ermöglicht das Band flach gegen die Folie entlang seiner Länge liegen. Zu vermeiden, überfüllen überschüssiges Wasser unterhalb der Multifunktionsleiste.
- Stehen Sie vorsichtig die Folie auf eine saugfähige fusselfreien Tuch, wicking überschüssiges Wasser aus dem Abschnitt.
- Legen Sie die Folie auf einem Papiertuch und bei Raumtemperatur über Nacht im Dunkeln trocknen lassen. Folien können auf unbestimmte Zeit bei 4 ° c im Dunkeln aufbewahrt werden.
9. Hitze-Befestigung, Rehydratation und Montage
- Erhitzen Sie eine flache Heizplatte auf 45 ° c. Erhitzen Sie die Folie für 30-60 min. Das Wachs wird halb geschmolzen werden und gegen die Folie glätten.
- Heben Sie die Folie von der heißen Platte und legen Sie ihn flach auf eine glatte, flache, Raumtemperatur-Oberfläche mit darauf achten, dass das geschmolzene Wachs ziehen nicht auf beiden Seiten der Folie, bis das Wachs erstarrt (~ 1 min).
- De-Wachs mit einem Glas-Folie-Mailer, Folien in vier Waschungen von clearing Agent für jeweils 5 min über eine Absauganlage Büchner Lösung zwischen den Waschgängen entfernen.
- Waschen Sie die Folien dreimal in 100 % EtOH für 1 min.
- Aktivieren Sie die Folien in einer abgestuften Reihe von Ethanol in der umgekehrten Reihenfolge der Bearbeitung (95 %, 70 %, 50 % und 25 %) für 1 min, jeweils gefolgt von zwei 1-min-Waschungen mit 1 X PBS-Puffer.
- Sofort die Abschnitte in ein Tris gepufferte Eindeckmedium montieren (siehe Tabelle der Materialien) und wenden Sie ein Deckglas, die Einführung von Luftblasen zu vermeiden. Eindeckmedium über Nacht bei Raumtemperatur polymerisieren zu ermöglichen.
- Sobald polymerisiert, versiegeln Sie das Deckglas auf der Folie mit klaren Nagellack. Versiegelte Folien können auf unbestimmte Zeit im Dunkeln bei 4 ° c gespeichert werden.
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Representative Results
Diese Methode generiert Biofilm dünn-Abschnitte wobei morphologische Merkmale und Zonen der Genexpression durch DIC, Fluoreszenz-Mikroskopie und TEM abgebildet werden können. Während DIC Bildgebung mit einem 40 X Öl Immersion Ziel darzutun, einige morphologische Merkmale (Abb. 2E) sein kann, wir haben festgestellt, dass Fluoreszenz Mikroskopie Stämme entwickelt, um konstitutiv express fluoreszierendes Protein liefert verbesserte Visualisierung der Zelle Verteilung innerhalb der Stichprobe (Abb. 2D). Bilder der einzelnen Abschnitte können zusammen genäht, um einen Querschnitt durch die gesamte Kolonie (Abbildung 2 b) zu generieren und Kontext für die Lokalisierung der strukturellen Merkmale innerhalb der allgemeinen Morphologie auf der makroskopischen Ebene (Vergleiche bereitstellen Abbildung 2A, B, und C). Morphologische Merkmale und fluoreszierende Signale können imaging Software14gemessen werden. Strukturen innerhalb des Biofilms oder Übergänge zwischen den Zonen der gen-Expression können dann mit Ausschüttungen von Metaboliten oder chemischen Gradienten11 korreliert werden.
Dieses Protokoll kann geändert und in mehrfacher Hinsicht angepasst werden. Verwendung eines Stammes entwickelt, um ausdrückliche fluoreszierenden Proteins unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors ermöglicht die Visualisierung der Verteilung der Genexpression (Abb. 3A). Kolonien können auf Farbstoffe,-haltigem Medium angebaut werden oder Farbstoffe zugesetzt werden, nach dem Schneiden, um spezifischen Polysaccharide Fleck (Abb. 3 b und C). Zu guter Letzt können Proben vorbereitet in eine modifizierte Version dieses Protokolls durch TEM (Abbildung 3D) ermöglicht Visualisierung mit höherer Auflösung als die durch DIC aktiviert oder Fluoreszenz-Mikroskopie untersucht werden.
Abbildung 1: Schematische Darstellung Setup für Koloniewachstum vor der Fixierung.
(A) Kolonien wachsen auf zwei Schichten von erstarrtem Agar Wachstumsmedium (oben und unten) und (B) werden dann mit einer zusätzlichen Schicht (Overlay), die Kolonie Morphologie bewahrt überlagert. (C) die Kolonie zwischen dem Overlay und oberste Schicht ist dann von der Unterschicht zur Weiterverarbeitung getrennt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Mikromorphologischer Features und YFP Fluoreszenz in Querschnitten von Paraffin-eingebetteten Kolonien.
Repräsentative Daten für Pseudomonas Aeruginosa PA14 ΔPhz Kolonie15 YFP konstitutiv zum Ausdruck zu bringen und für 3 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar mit Kongo-rot und Coomassie Blau angebaut. (A) Draufsicht, Fluoreszenzbild zeigt die Hälfte einer Kolonie vor der Fixierung. (B) Querschnitt der gesamten Kolonie nach dem Paraffin einbetten. Die Box Bereich wurde mit einem 10 X-Objektiv (C) abgebildet. Die Box Bereich (c) wurde dann mit einem 40 X Objektiv Öl eintauchen, mit Fluoreszenz (D) und DIC (E) abgebildet. Maßstabsleisten stehen 2 mm (A), 500 µm (B) und 100 µm (C-E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Reporter Ausdruck, Pre- und Post-Färbung der Biofilm-Features und TEM Bildgebung von Paraffin-eingebetteten Kolonie Biofilm Proben.
(A) MexGPr-GFP Reporter-Fluoreszenz in einer p. Aeruginosa PA14 Kolonie für 3 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar gewachsen. (B) Fluoreszenz des gebundenen Kongo-rot in einer p. Synxantha -Kolonie für 5 Tage auf den Farbstoff-haltigem Medium gewachsen. (C) Fluoreszenz der Wisteria Floribunda Lektin Fleck für Pel Polysaccharid in einer p. Aeruginosa PA14 ΔPhz Kolonie (gewachsen für 2 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar mit Kongo-rot und Coomassie Blau), nach dem Schnitt. (D) TEM Bild von p. Aeruginosa PA14 ΔPhz Kolonie (gewachsen für 3 Tage auf 1 % Tryptone, 1 % Agar mit Kongo-rot und Coomassie Blau), für Schnitt über Paraffin einbetten und verarbeitet *. Maßstabsleiste repräsentiert 40 µm (A-B), 20 µm (C) und 5 µm (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
* In diesem Beispiel wurde für Schnitt über Paraffin einbetten bis Schritt 4 des genannten Protokolls weglassen Schritte 4.1-4.3, verarbeitet und dann separat verarbeitet für TEM-Analysen.
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Discussion
Einbetten von Paraffin und dünn schneiden Gewebeproben ist eine klassische histologische Technik, die ermöglicht die Abbildung von Mikro-morphologische Strukturen und wird häufig auf eukaryotischen Geweben verwendet und mit einigem Erfolg auf mikrobielle Proben8 angewendet wurde ,9. Während Cryoembedding für die starke Bindung des endogenen und immunofluorescent Signals ermöglicht, ist Paraffin einbetten generell vorzuziehen, da sie besseren Schutz der Morphologie16bietet. Bei der Anpassung dieser Methode für die Anwendung auf mikrobielle Biofilme, konzentrierten wir uns auf Eigenschaften, die einzigartig für unser System. Die Zellen und Matrix des Gewebes sind oft relativ robust zusammengehalten während Biofilme sind in der Regel empfindlicher; Wir haben daher Routine Fixierung und Wachs einbetten Protokolle zur Maximierung der Probe Aufbewahrung optimiert. Aufrechterhaltung der Probe auf seine Wachstumssubstrat und überlagern die Kolonie mit Agar unmittelbar vor der Fixierung sorgt dafür, dass die Probe nicht von oben oder von der Basis verloren geht. Jedoch schadet überlagern Kolonien mit Agar, das zu heiß ist die Kolonien also bei diesem Schritt darauf geachtet werden sollte.
Die Fixierung ist ein entscheidender Schritt für die Beibehaltung der Struktur durch die rauen Dehydrierung, clearing, und Infiltration Schritte erforderlich für das Paraffin einbetten. Wir fanden, dass Lysin-Formaldehyd-Fixierung am besten bewahrt die Integrität der Probe. Lösliche Lysin, einem Diamin reagiert mit Aldehyden, vernetzte Polymere zu bilden und Stärkung der Exopolymeric Substanz (EPS) gegen mechanische Abbau17,18vorgeschlagen wurde.
Wir haben beobachtet, dass Hintergrundfluoreszenz mit aufeinander folgenden Waschungen im orange Öl basierenden Clearing Agent oder über längere Zeit, während der Probe Rehydratation (Schritt 9.3) abnimmt. Über-Behandlung mit dem Clearing Agent führt jedoch zu spröde Proben, die schwer zu Abschnitt19. Es kann erforderlich sein, das Volumen oder Anzahl der Waschgänge entsprechend der Menge des Wachses während jeder Rehydratation anzupassen sein. Erhöhte Hintergrundfluoreszenz kann ebenso ergeben sich aus Verunreinigungen des Gewebes verarbeitet Reagenzien, wo das Wachs, das etwas Autofluorescent ist, ganz oder teilweise mischbar in der Lichtung Lösungsmittel oder Ethanol in diese Schritte (Schritte verwendet 6.1-6.4). Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Ethanol Reporter Signal vermindert, und es kritisch ist zu der Fluorophor in zwei Waschungen von PBS vor der Montage (Schritt 9.5 9.6).
Diese Methode ermöglicht auch die Lokalisierung der konstitutiven und Projektträger-gesteuerte Fluoreszenz bei der Auflösung von Zellen. Jedoch raten wir zur Vorsicht bei Verwendung dieser Methode Genexpression zu interpretieren. Der Overlay-Schritt eingeführt, die in diesem Protokoll (Schritt 4.2), angewandte vor Fixierung bei 50 ° c, stellt eine erhebliche Veränderungen der Umwelt im Vergleich zu den ursprünglichen Wachstumsbedingungen, die gen-Expression-Muster beeinflussen können. Es möglicherweise nützlich, um Expressionsmuster überprüfen indem Fixiermittel in die Kolonie direkt, unmittelbar vor dem Gießen der Überlagerung, aber zu einem Preis auf Morphologie (optionaler Schritt 3.1-3.3).
Ein weiterer Einflussfaktor für die Interpretation der Fluoreszenz ist die Topographie des Abschnitts selbst. Verschiedenen Regionen des Biofilms weisen unterschiedliche Grade der strukturellen Integrität und werden mehr oder weniger offen für Erhaltung über Fixierung, je nach dem, können gegebenenfalls funktionelle Gruppen diese Komponenten sind in der Lage beitragen zur Fixativ Vernetzung 20. Infolgedessen Abschnitte verlieren Biomasse überproportional von der Sektion Oberfläche beim Übergang von einer morphologischen oder metabolische Zone zur anderen entlang der Kolonie z-Achse. Dies kann durch Bildgebung eine intakte fokale Scheibe des Abschnitts mit einem confocal Mikroskop behoben werden.
Neben der Anwendung dieser Technik zu Klängen entwickelt, um ausdrückliche fluoreszierende Proteine, haben wir mikromorphologischer Funktionen von Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) und im Biofilm Proben befleckt mit bestimmten Fluoreszenzfarbstoffen (Abbildung 3A geprüft ). Jennings Et Al. beschrieben vor kurzem einen bestimmten Farbstoff für Pel, die großen Polysaccharid von p. Aeruginosa PA14 Biofilme 21produziert. Wie im obigen Protokoll und Vertreter Ergebnisse beschrieben, ermöglicht die Anwendung von dieser Farbstoff Abschnitte zur Visualisierung der Pel-Verteilung in PA14 Kolonie Biofilmen in hoher Auflösung (Abbildung 3) 3. Umgekehrt, fluoreszierende Farbstoffe wie Kongo-rot zugesetzt werden, um das Wachstumsmedium und Post-Stationspunkte (Abb. 3 b) abgebildet. Die Anwendung einer Überlagerung schont Kolonie Biofilm Morphologie und Zelle Struktur in der gesamten Verarbeitung für TEM (Abbildung 3D).
Die hier beschriebene optimierte Methode ermöglicht die Vorbereitung der Kolonie Biofilmen auf Schnitt über Paraffin einbetten, wobei endogene Signal und Features oder komplexiert Farbstoffe sein kann lokalisiert in Vivo mit hervorragender Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung der Probe Verlust und Erhalt native Kolonie Makro und Mikro-Morphologien. Wir anerkennen, dass erhebliche Mühe, Zeit und Reagenz Verwendung für diese Methode erforderlich. Wir denken jedoch, dass diese Nachteile durch den Grad der morphologischen Erhaltung, die Auflösung der Fluoreszenz in Situ und Hilfsbereitschaft, Pre- und Post-befleckenden Verfahren oder alternative Verarbeitungsstrategien (z. B. Vorbereitung begegnet sind TEM) durch diese Technik gewährte.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NSF-Karriere-AWARD-1553023 und NIH/NIAID Award R01AI103369 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
