Summary
Descriviamo la fissazione, inclusione in paraffina e sottili tecniche di sezionamento per colonie microbiche biofilm. In campioni preparati, modelli di espressione di sottostruttura e reporter di biofilm possono essere visualizzati da microscopia.
Abstract
Sezionamento tramite inclusione in paraffina è una tecnica ampiamente consolidata in sistemi eucariotici. Qui forniamo un metodo per la fissazione, l'incorporamento e sezionamento dei biofilm intatto di colonie microbiche utilizzando irrorato di cera di paraffina. Per adattare questo metodo per l'utilizzo su biofilm di Colonia, abbiamo sviluppato le tecniche per mantenere ciascun campione il suo substrato di crescita e di esso di laminazione con un strato di agar e aggiunto alla soluzione fissante lisina. Queste ottimizzazioni migliorano la conservazione del campione e mantenimento delle caratteristiche di micromorphological. Campioni preparati in questo modo sono favorevoli a sottile di sezionamento e di imaging da microscopia elettronica di trasmissione, fluorescenza e della luce. Abbiamo applicato questa tecnica a Colonia biofilm di Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilise Vibrio cholerae. L'elevato livello di dettaglio visibile in campioni generati da questo metodo, combinato con ceppo reporter ingegneria o l'uso di coloranti specifici, può fornire spunti interessanti sulla fisiologia e sullo sviluppo delle comunità microbiche.
Introduction
Maggior parte dei microbi hanno la capacità di forma biofilm, comunità di cellule tenute insieme da matrici autoprodotti. I biofilm possono essere coltivati in molti tipi di configurazioni fisiche, con vari regimi di fornitura di nutrienti e substrato. Test specifici per la formazione di biofilm tendono a produrre strutture multicellulari riproducibile e architetture comuni sono osservate per specie filogeneticamente diversificata a livello macroscopico o comunità. Quando i microbi vengono coltivati come colonie su terreno solido sotto atmosfera, morfologia macroscopica trasmette informazioni sulla capacità per la produzione della matrice e spesso correla con altri tratti 1,2,3. L'architettura interna di colonie microbiche possa anche fornire indizi riguardo specifici del biofilm chimica e fisiologia, ma è stato difficile da caratterizzare. Recenti applicazioni delle tecniche di crioinclusione e cryosectioning di colonie batteriche hanno permesso la formazione immagine e la visualizzazione di specifiche caratteristiche a risoluzione senza precedenti 4,5,6. Tuttavia, studi con tessuto animale hanno dimostrato che inclusione in paraffina fornisce superiore conservazione della morfologia rispetto a crioinclusione 7 e viene utilizzato per visualizzare i batteri in tessuti 8,9. Abbiamo pertanto sviluppato un protocollo per la fissazione, inclusione in paraffina e sezionamento sottile di colonie microbiche biofilm. Qui, descriviamo la preparazione di Pseudomonas aeruginosa PA14 Colonia-biofilm sezioni sottili 10,11, ma abbiamo applicato con successo anche questa tecnica a biofilm formato dai batteri Synxantha Pseudomonas, Bacillus subtilis, e Vibrio cholerae12.
Il processo di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento biofilm segue una logica semplice. In primo luogo, il biofilm sono racchiusi in uno strato di agar per preservare la morfologia durante l'elaborazione. In secondo luogo, il biofilm racchiusi sono sommerse in un fissativo di crosslink macromolecole e preservare micromorfologia. Questi sono poi disidratati con alcool, ha eliminati con un solvente non polare più e quindi infiltrati con cera di paraffina liquida. Una volta infiltrato, i campioni sono incorporati in mattoncini di cera per il sezionamento. Sezioni sono tagliati, montate su slitte e poi reidratati al fine di riportarli a uno stato più nativo. Da questo punto, possono essere macchiati o coperto in mezzo di montaggio per l'analisi al microscopio.
Questo protocollo produce sezioni sottili di biofilm microbici adatto per l'analisi istologica. Sottostrutture di biofilm di Colonia sono visibili quando sezioni sottili preparati utilizzando questo metodo sono immaginate da microscopia chiara. Biofilm possono essere anche coltivati sulle macchie fluorescenti contenenti supporti specifici per le singole funzionalità o macchiati nella fase di reidratazione, immediatamente prima del montaggio (passaggi 9.5-9.6). Infine, i microbi possono essere progettati per produrre proteine fluorescenti in modo costitutivo o regolamentato, permettendo in caso di segnalazione in situ di espressione di gene o distribuzione delle cellule all'interno di queste comunità. Abbiamo usato questi metodi per determinare la profondità di biofilm di Colonia, distribuzione delle cellule, distribuzione della tabella, modelli di crescita ed espressione genica spatiotemporal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. crescita di Pseudomonas aeruginosa Colonia biofilm
- Preparazione delle piastre Medium-Bilayer
- Preparare un tryptone di 10 g/L, agar 10 g/L (Vedi Tabella materiali) soluzione in acqua deionizzata.
- Autoclave per raffreddare a 50-60 ° C per 20 min. in un bagno d'acqua.
- Versare 45 mL della soluzione di agar-tryptone in un piatto quadrato 100 x 100 mm (Vedi Tabella materiali) utilizzando una provetta conica da 50 mL. Consentire l'agar solidificare (~ 20-30 min). Versare un secondo strato sopra strato prima 15 mL. Lasciare solidificare durante la notte, rimozione di condensazione da coperchi se necessario strofinando con un panno privo di lanugine.
- Spotting Colonia biofilm
- Inoculare i ceppi di interesse dalle scorte di congelatore sul LB agar piastre13 ed incubare al buio per 12-16 h a 37 ° C e 80-100% di umidità relativa.
- Per ogni ceppo o replicate, è possibile utilizzare una singola Colonia per inoculare 2 mL di LB e incubare al buio per 12-16 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
- Sub-cultura diluendo 1: 100 in LB fresco e incubare al buio per 2.5-3 h a 37 ° C con agitazione a 250 giri/min.
- Misurare la densità ottica utilizzando uno spettrofotometro e regolare con LB sterile per ottenere una sospensione di cellule con un OD500 nm ~ 0,5.
- A seconda della Colonia desiderata taglia, dispensare 2.5-10 µ l di sospensione cellulare su un piatto di mezzo-doppio strato (preparato al punto 1.1) e consentire il posto ad asciugare per ~ 20 minuti lasciando il coperchio petri socchiusa vicino a fiamme può facilitare asciugarsi.
- Incubare il campione colonie a 25 ° C e 80-100% di umidità relativa, al buio fino a 4 giorni.
2. preparazione della soluzione fissante
- Preparare la soluzione fissante il giorno della raccolta del campione. Diluire il 37% di formaldeide (FA) in PBS 1X a una concentrazione finale del 4% FA.
Attenzione: FA è volatile e tossico. Indossare indumenti protettivi e lavorare in una cappa ben ventilata. - Immediatamente prima dell'uso, sciogliere L-lisina cloridrato in 4% FA (preparata al punto 2.1) a temperatura ambiente per una concentrazione finale di 50 millimetri L-Lisina HCl.
3. diretta applicazione di fissativo per il Biofilm di Colonia [opzionale]
Nota: Abbiamo trovato che la morfologia di biofilm è meglio conservato quando agar molle viene aggiunto prima della fissazione. Tuttavia, questo passaggio costituisce anche un cambiamento delle condizioni ambientali che potrebbero influenzare l'espressione genica. Modelli di espressione di reporter fluorescente dovrebbero quindi essere verificati utilizzando un protocollo separato in cui il punto di fissazione è effettuato prima dell'aggiunta della sovrapposizione agar, come descritto qui.
- Il giorno della fissazione e lavorando in una cappa ben ventilata, dispensare il fissativo preparato al punto 2 direttamente alla superficie dell'agar intorno a bordo della Colonia, permettendo così di raggiungere la periferia della Colonia senza sommergendola. Applicare solo come molto fissativo come è necessario completamente circondano la Colonia, circa 500 µ l. consentire il fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante.
- Una volta che il fissativo è stato completamente assorbito nella Colonia e mezzo circostante, circa 20-30 min, e FA residua non è più visibile sulla piastra, ripetere il punto 3.1. Permettere questo fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante.
- Una volta che il fissativo è stata completamente assorbito nella Colonia e mezzo circostante ripetizione passaggio 3.1, questa volta l'applicazione fissativo alla superficie della Colonia direttamente. Permettere questo fissativo diffondere in Colonia e l'agar circostante, procedere al passaggio 4 solo dopo tutto fissativo è stata assorbita e non è più visibile sulla piastra.
4. overlaying colonie con Agar
- Il giorno della fissazione, preparare un 10 g/L soluzione agar in acqua deionizzata e autoclave per 10-20 minuti sciogliere. Raffreddare a bagnomaria a 50 ˚ c.
- Delicatamente versare 15 mL della soluzione di agar sopra la coltura e la Colonia. Consentire l'agar formare un gel a temperatura ambiente per 5 min (Figura 1B).
- Usare una lama di rasoio affilata per tagliare un mandrino quadrato, 3 strati con la Colonia laminata tra i due strati superiori. Se preparare campioni multipli, assicurarsi che ciascun mandrino è tagliato a dimensioni comparabili.
- Rimuovere delicatamente l'eccesso agar dal mandrino Colonia-contenente.
- Per estrarre i due strati superiori dell'agar (contenente la Colonia) dallo strato inferiore del mandrino (Figura 1), bagnare la testa piatta di una spatola in 1X PBS o acqua e inserire delicatamente tra gli strati superiore ed inferiore. La colonia di laminato deve separare dallo strato inferiore. Fare attenzione a non distorcere o piegare la Colonia laminata quando solleva dalla sua base.
5. fissazione
- Lavorando in una cappa ben ventilata, trasferire immediatamente la Colonia laminata (cioè, chuck 2 strati) in una cassetta incasso (Vedi Tabella materiali), etichettati con un pennarello resistente alle sostanze chimiche. Inserire la cassetta di incorporamento in un mailer di diapositive di vetro (Vedi tabella materiali) contenente il fissativo preparato nei passaggi 2.1-2.2. Assicurarsi che non ci sono nessun bolle d'aria intrappolate all'interno della cassetta incasso.
- Incubare il campione nel fissativo pernottamento in al buio a temperatura ambiente.
6. campione di elaborazione: Tampone di lavaggio, disidratazione, schiarimento e infiltrazione
- Dopo la fissazione durante la notte, lavare il campione due volte in PBS 1X per 1h ciascuna. Per risultati ottimali, automatizzare omogeneizzazione di reagente utilizzando lo spin funzione di un processatore automatico (Vedi tabella materiali) impostata su un'impostazione bassa. Se nessun processore è disponibile, il trattamento può essere eseguito manualmente.
- Seguire il tampone di lavaggio da disidratazione attraverso una serie graduata di diluizioni di etanolo (EtOH) in PBS 1X (25%, 50%, 70%, 95%) per 1 h a temperatura ambiente.
- Disidratare in tre lavaggi del 100% EtOH per 1 h a temperatura ambiente.
- Deselezionare il campione disidratato in tre lavaggi dell'agente arancione a base di olio schiarimento 100% (Vedi tabella materiali) per 1 h a temperatura ambiente.
- Si infiltra nell'esempio cancellato due volte con paraffina fusa cera (Vedi Tabella materiali), riscaldato a 55 ° c, per 2 h ogni.
7. campione incorporamento
- Riempire uno stampo di cera con cera di paraffina fusa riscaldata a 55 ˚ c. Utilizzare una spatola riscaldata, piatta per trasferire rapidamente il mandrino infiltrato dalla cassetta incasso nello stampo di cera, garantendo che il mandrino si riposa parallela alla base dello stampo. Evitare di applicare una pressione eccessiva sul mandrino. Stampi di cera possono essere personalizzati 3D stampato, o sono disponibili in commercio (vedere Tabella materiali).
- Consentire la cera di solidificare durante la notte a 4 ˚ c. Modellato in cera solida campioni possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ˚ c.
- Una volta che la cera si è solidificato, asportare il campione dallo stampo e tagliare la cera in eccesso da intorno al campione con una lama di rasoio. Lasciare la cera in eccesso che si estende da un'estremità del campione, parallelo al piano di taglio, che può essere utilizzato per il bloccaggio nel microtomo (Vedi Tabella materiali). Anche lasciare una guaina di cera, di circa 1 mm di spessore, intorno al campione e lisciare le sue facce.
8. sezionamento
- Riscaldare a bagnomaria a 42 ° c. Fissare il campione nel microtomo con la superficie della Colonia orientata perpendicolarmente al bordo della lama (Vedi Tabella materiali).
- Sgrossare il campione a intervalli di 50 µm fino a quando è stato raggiunto il piano desiderato della Colonia, da cui sezioni saranno raccolti.
- Tagliare un nastro del numero desiderato di sezioni spesse 10-µm utilizzando un microtomo impostato una velocità di taglio di 75-80 giri/min e un angolo di spoglia inferiore di 6-10 ˚. Utilizzare un pennello a punta fine per staccare il nastro dalla lama.
- Utilizzando una goccia d'acqua sulla punta di una pipetta di Pasteur (preferito) o il forcipe, trasferire delicatamente il nastro nel bagnomaria. Fare attenzione a evitare bolle d'aria intrappolamento nella sezione.
- Immediatamente inserire una diapositiva nel bagno di acqua e posizionarla sotto la barra multifunzione a un angolo di 45 ˚.
- Toccare il bordo stretto del nastro per la diapositiva, appena sotto l'etichetta smerigliato. Il nastro deve aderire.
- Tirare la diapositiva dal bagno di acqua, regolazione dell'angolo di diventare perpendicolare alla superficie dell'acqua e consentendo la barra multifunzione per laici piatto contro lo scivolo lungo la sua lunghezza. Evitare di intrappolare l'acqua in eccesso sotto la barra multifunzione.
- Si levano in piedi delicatamente il vetrino su un panno privo di lanugine assorbente, traspirante acqua in eccesso dalla sezione.
- Porre il vetrino su un tovagliolo di carta e lasciare asciugare a temperatura ambiente durante la notte nel buio. Diapositive possono essere conservati a tempo indeterminato a 4 ° c al buio.
9. calore-fissaggio, reidratazione e montaggio
- Scaldare una piastra calda livellata a 45 ˚ c. Scaldare il vetrino per 30-60 min. La cera diventerà semi-fusa e appiattire contro la diapositiva.
- Delicatamente sollevare il vetrino dalla piastra scaldante e adagiarlo piatto su una superficie liscia, livellato, temperatura ambiente, facendo attenzione ad assicurare che la cera fusa non tirare su entrambi i lati della diapositiva, fino a quando la cera si solidifica (~ 1 min).
- Utilizzando un mailer di diapositive di vetro, de-cera diapositive in quattro lavaggi di compensazione agente per 5 minuti ciascuno, utilizzando un aspiratore di Büchner per rimuovere la soluzione tra i lavaggi.
- Lavare i vetrini tre volte in 100% EtOH per 1 min ciascuna.
- Reidratare le diapositive in una serie graduata di etanolo in ordine inverso di elaborazione (95%, 70%, 50% e 25%) per 1 min che ciascuna seguita da due 1-min lavaggi in PBS 1X.
- Montare immediatamente le sezioni in un mezzo di montaggio tamponata (Vedi Tabella materiali) e applicare un vetrino coprioggetti, evitando l'introduzione di bolle d'aria. Consentire il mezzo di montaggio a polimerizzare durante la notte a temperatura ambiente.
- Una volta polimerizzato, sigillare il coprioggetto alla diapositiva utilizzando smalto trasparente. Sigillato vetrini possono essere conservati a tempo indeterminato al buio a 4 ° c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo metodo genera sottili sezioni di biofilm in cui le caratteristiche morfologiche distinte e zone di espressione genica possono essere ripreso da DIC, microscopia a fluorescenza e TEM. Mentre imaging DIC utilizzando un 40 X obiettivo a immersione in olio può essere sufficiente a mostrare alcune caratteristiche morfologiche (Figura 2E), abbiamo trovato quello fluorescenza microscopia di ceppi ingegnerizzati per proteina costitutivamente espresso fluorescente fornisce funzionalità migliorata visualizzazione della distribuzione delle cellule all'interno del campione (Figura 2D). Immagini delle singole sezioni possono essere cuciti insieme per generare una sezione trasversale dell'intera Colonia (Figura 2B) e per fornire un contesto per la localizzazione delle caratteristiche strutturali all'interno la morfologia complessiva a livello macroscopico (confronta Figura 2A, B e C). Le caratteristiche morfologiche e segnali fluorescenti possono essere misurati mediante imaging software14. Strutture all'interno del biofilm o transizioni tra zone di espressione genica possono quindi essere correlate con distribuzioni di metaboliti o gradienti chimici11 .
Questo protocollo può essere modificato e adattato in diversi modi. Uso di un ceppo progettato per proteina espressa fluorescente sotto il controllo di un promotore specifico permette la visualizzazione della distribuzione di espressione genica (Figura 3A). Colonie possono essere coltivate su terreno contenente coloranti, o possono essere aggiunti coloranti post-sezionamento, per macchiare le specifiche polisaccaridi (figure 3B e C). Infine, campioni preparati in una versione modificata di questo protocollo possono essere esaminati dalla TEM (Figura 3D) per consentire la visualizzazione a risoluzione più elevata di quella attivata da DIC o microscopia a fluorescenza.
Figura 1: Schema raffigurante l'installazione per la crescita di Colonia prima della fissazione.
(A) colonie sono coltivate in cima a due strati di agar solidificato crescita medio (superiore e inferiore) e (B) sono quindi sovrapposti con un ulteriore strato (sovrapposizione), che conserva la morfologia di Colonia. (C) la Colonia inserita tra la sovrapposizione e strato superiore viene poi separata dallo strato inferiore per l'ulteriore elaborazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratteristiche Micromorphological e fluorescenza YFP in sezioni trasversali delle colonie di paraffina.
Dati rappresentativi per Pseudomonas aeruginosa PA14 Δphz Colonia15 costitutivamente esprimere YFP e cresciuto per 3 giorni su tryptone di 1%, 1% agar contenente rosso Congo e Coomassie blu. (A) vista dall'alto, immagine di fluorescenza che mostra la metà di una colonia prima della fissazione. (B) sezione trasversale dell'intera colonia dopo inclusione in paraffina. L'area circoscritta era imaged con un obiettivo obiettivo 10x (C). L'area circoscritta in (C) quindi era imaged con un 40 X obiettivo obiettivo ad immersione mediante fluorescenza (D) e DIC (E). Barre della scala rappresentano 2 mm (A), 500 µm (B) e 100 µm (C-E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Espressione di Reporter, pre- e post-colorazione di biofilm caratteristiche e formazione immagine TEM di campioni di biofilm di colonie di paraffina.
(A) mexGPr-GFP reporter in fluorescenza una colonia di p. aeruginosa PA14 coltivata per 3 giorni su tryptone di 1%, 1% agar. (B) fluorescenza di colore rosso di Congo associato in una colonia di p. synxantha coltivata per 5 giorni in un mezzo contenente il colorante. (C) fluorescenza della macchia lectina Wisteria floribunda per Pel polisaccaride in una p. aeruginosa PA14 Δphz Colonia (coltivata per 2 giorni su tryptone di 1%, 1% agar contenente rosso Congo e Coomassie blu), applicata dopo il sezionamento. (D) immagine TEM di una colonia diphz Δ di p. aeruginosa PA14 (coltivata per 3 giorni su tryptone di 1%, 1% agar contenente rosso Congo e Coomassie blu) e trattati per il sezionamento tramite inclusione in paraffina *. Barra della scala rappresenta 40 µm (A-B), 20 µm (C) e 5 µm (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
* In questo esempio è stato elaborato per il sezionamento tramite inclusione in paraffina attraverso passaggio 4 del protocollo, omettendo passi 4.1-4.3 e poi elaborato separatamente per analisi TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Campioni di tessuto di inclusione in paraffina e sottile-sezionamento è una tecnica istologica classica che permette l'imaging delle strutture micro-morfologica e viene comunemente utilizzata sui tessuti negli eucarioti è stata applicata con successo ai campioni microbici8 ,9. Mentre crioinclusione consente una forte ritenzione del segnale endogeno ed immunofluorescente, inclusione in paraffina è generalmente preferibile in quanto fornisce migliore conservazione della morfologia16. Adattare questo metodo per l'applicazione di biofilm microbici, ci siamo concentrati sulle caratteristiche che sono uniche al nostro sistema. Le cellule e la matrice dei tessuti sono spesso tenuti insieme relativamente robusto, mentre i biofilm tendono ad essere più delicato; Abbiamo pertanto ottimizzato routine fissazione e cera incorporamento protocolli per ottimizzare la conservazione del campione. Mantenere il campione sul suo substrato di crescita e sovrapponendo la Colonia con agar immediatamente prima della fissazione assicura che il campione non è perso dall'alto o la base. Tuttavia, sovrapponendo colonie con agar che è troppo caldo può danneggiare le colonie, quindi dovrebbe prestare particolare attenzione durante questo passaggio.
La fissazione è un passo fondamentale per la struttura attraverso la disidratazione dura, di compensazione, di ritegno e infiltrazione passaggi necessari per l'inclusione in paraffina. Abbiamo trovato che quella fissazione di lisina-formaldeide migliore preserva l'integrità del campione. Lisina solubile, una diammina, può reagire con aldeidi per formare polimeri reticolati ed è stato proposto di rafforzare exopolymeric sostanza (EPS) contro degradazione meccanica17,18.
Abbiamo osservato che fluorescenza di fondo diminuisce con lavaggi successivi nell'agente di schiarimento arancione a base di olio, o in caso di esposizione prolungata, durante la reidratazione del campione (punto 9.3). Sovra-trattamento con l'agente di compensazione può, tuttavia, provocare campioni fragili che sono difficili da sezione19. Può essere necessario regolare il volume o il numero di lavaggi per riflettere la quantità di cera presente durante ogni reidratazione. Fluorescenza di fondo aumentato similarmente possa derivare da contaminazione del tessuto dove la cera, che è leggermente autofluorescent, è completamente o parzialmente miscibile nel solvente di schiarimento o etanolo utilizzato in questa procedura (procedura di elaborazione reagenti, 6.1-6.4). Inoltre, abbiamo trovato etanolo diminuisce segnale reporter, che è fondamentale per ricostituire il fluoroforo in due lavaggi di PBS prima del montaggio (passo 9.5-9.6).
Questo metodo permette anche per la localizzazione di fluorescenza costitutiva e promotore-driven alla risoluzione delle cellule. Tuttavia, si consiglia cautela quando si utilizza questo metodo per interpretare l'espressione genica. Il passo di sovrapposizione introdotto in questo protocollo (punto 4.2), applicato prima della fissazione a 50 ˚ c, presenta un notevole cambiamento ambientale relativa alle condizioni di crescita iniziale che possono influenzare l'espressione genica. Può essere utile verificare i modelli di espressione mediante l'applicazione di fissativo alla Colonia direttamente, immediatamente prima di versare la sovrapposizione, ma ad un costo alla morfologia (passaggio facoltativo 3.1-3.3).
Un altro fattore che influenza l'interpretazione della fluorescenza è la topografia della sezione stessa. Diverse regioni del biofilm possono presentano vari gradi di integrità strutturale ed essere più o meno favorevole alla conservazione tramite la fissazione, dipendendo da quale, eventuali gruppi funzionali tali componenti sono in grado di contribuire al cross-linking fissativo 20. di conseguenza, sezioni potrebbero perdere biomassa sproporzionatamente dalla superficie sezione durante la transizione da una zona morfologica o metabolica a altra lungo l'asse z della Colonia. Questo può essere affrontato da una fetta di focale intatto della sezione di imaging con un microscopio confocale.
Oltre ad applicare questa tecnica a ceppi ingegnerizzati per proteine fluorescenti express, abbiamo esaminato micromorphological caratteristiche di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e nei biofilm campioni colorati con coloranti fluorescenti specifici (Figura 3A ). Jennings et al recentemente descritto un colorante specifico per Pel, il polisaccaride importante prodotto da p. aeruginosa PA14 biofilm 21. Come descritto nei risultati del protocollo e rappresentante sopra, applicazione di questo colorante alle sezioni permette una visualizzazione della distribuzione Pel in biofilm Colonia PA14 ad alta risoluzione (Figura 3) 3. Al contrario, le tinture fluorescenti come il Congo rosso possono essere aggiunto al medium della crescita ed imaged post-taglio (Figura 3B). L'applicazione di un overlay conserva anche Colonia biofilm morfologia cellulare struttura e durante tutta l'elaborazione per TEM (Figura 3D).
Il metodo ottimizzato qui descritto consente la preparazione di biofilm di Colonia per il sezionamento tramite inclusione in paraffina, in cui segnale endogeno e caratteristiche o complessati coloranti possono essere localizzate in vivo con risoluzione superiore, riducendo al minimo del campione perdita e preservare nativo Colonia macro - e micro-morfologie. Riconosciamo che uso notevole di fatica, tempo e reagente sono necessari per questo metodo. Tuttavia, riteniamo che questi inconvenienti sono controbilanciati dal grado di conservazione morfologica, la risoluzione di in situ di fluorescenza e la disponibilità di procedure pre- e post-colorazione o strategie di trattamento alternativo (come preparazione per TEM) offerto da questa tecnica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NSF carriera premio 1553023 e premio NIH/NIAID R01AI103369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 3/4" Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | Purchased from univeristy biostores |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Buchner Aspirator (Vacuum) Flask | Pyrex | 5340 | Purchased from univeristy biostores |
| Chemically-resistant Marking Pen | VWR | 103051-182 | Manufacturer: Leica |
| Clear Fingernail Polish | ******** | ******** | Store bought |
| Congo Red Indicator Grade | VWR | AAAB24310-14 | Manufacturer: Alfa Aesar |
| Coomassie Blue | VWR | EM-3340 | Manufacturer: EMD Millipore |
| TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI) | Fisher Scientific | 50 247 04 | Manufacturer: Electron Microscopy Sciences |
| Embedding Mold | ******** | ******** | 3D printed in-house |
| Embedding Mold (commercial) | Electron Microscopy Sciences | 70182 | |
| Ethanol 200P | Decon Labs, Inc. | 2701 | Purchased from univeristy biostores |
| Fine-tipped Brush | ******** | ******** | Store bought, paint brush |
| Glass Coverslips 60x22mm | Fisher Scientific | 12-519-21C | |
| Glass Rehydration Mailer | Ted Pella | 21043 | 20 slide mailer |
| Histoclear-II, orange oil-based clearing agent | Fisher Scientific | 50 899 90150 | Manufacturer: National Diagnostics |
| Histosette, Embedding Casette | Fisher Scientific | 15 182 701A | |
| L-lysine hydrochloride | Fisher Scientific | BP386 100 | |
| Low Profile Microtome Blades | Fisher Scientific | 22 210 048 | Manufacturer: Sturkey |
| Micropipette | VWR | 89080-004 | Promo-pack |
| Micropipette Tips | See comments section | See comments section | p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486) |
| Microtome | Fisher Scientific | 905200U/00016050 | Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050 |
| Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin) | Ricca Chemical | RSOF0010-500A | |
| Paraplast Xtra (paraffin wax) | VWR | 15159-486 | Manufacturer: McCormick Scientific |
| Petri Dishes Square 100x100x15mm | Laboratory Disposable Products | D210-16 | |
| Potassium chloride | EMD Chemicals | PX1405-1 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P380-500 | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | Purchased from univeristy biostores |
| Slide Warmer | Fisher Scientific | NC0865259 | NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D |
| Sodium chloride | VWR | 0241-1KG | Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Sodium phosphate | VWR | BDH9296.500 | ,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house |
| Suprafrost Histology Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| Tissue Flotation Water Bath | Fisher Scientific | NC0815797 | Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B |
| Automatic Tissue Processor | Fisher Scientific | 813160U/Q#00009061 | Model: STP120 Tissue Processor |
| Tryptone | Teknova | T9012 | |
| Yeast extract | Teknova | Y9010 |
References
- Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development. J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).
- Friedman, L., Kolter, R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).
- Okegbe, C., et al. Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm. MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).
- Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).
- McGlinn, E., Mansfield, J. H. Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections. Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).
- James, G., Hunt, A. M. A. Imaging Biofilms in Tissue Specimens. Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).
- Madsen, J. S., et al. Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models. Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).
- Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence. bioRxiv. , 171538 (2017).
- Fong, J. C., et al. Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms. Elife. 6, (2017).
- Bertani, G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria. Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).
- Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section? Protoplasma. , (2017).
- Priester, J. H., et al. Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy. J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).
- Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets. J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).
- Blackburn, M. R. Examination of normal and abnormal placentation in the mouse. Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).
- Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes. J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).
- Jennings, L. K., et al. Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).
