Dit protocol beschrijft een fysiologisch relevante, hydrofoor vloeistof aanpak voor snelle en omkeerbare inductie van varicosities in de neuronen.
Axonale varicosities zijn uitgebreide structuren langs de assen van axonen met een hoge mate van heterogeniteit. Ze staan niet alleen in de hersenen met neurodegeneratieve ziekten of verwondingen, maar ook in de normale hersenen. Hier beschrijven we een nieuw opgerichte micromechanische systeem om snel, betrouwbaar en omkeerbaar axonale varicosities, waardoor ons te begrijpen van de mechanismen inzake de vorming van de varicosity en de samenstelling van de heterogene eiwit. Dit systeem vertegenwoordigt een nieuwe middelen voor de evaluatie van de effecten van de compressie en afschuiving stress op verschillende subcellular compartimenten van neuronen, anders dan andere in vitro -systemen, die zich vooral op het effect van stretching richten. Nog belangrijker is, als gevolg van de unieke kenmerken van ons systeem, wij onlangs een nieuwe ontdekking gedaan waaruit blijkt dat de toepassing van de onder druk staande vloeistof snel en omkeerbaar axonale varicosities door middel van de activering van een voorbijgaande receptor potentiële kanaal veroorzaken kan. Onze biomechanische systeem kan gemakkelijk worden gebruikt in combinatie met de drug perfusie, levende cel imaging, beeldvorming van de calcium en patch klem opname. Deze methode kan derhalve worden vastgesteld voor de studie van mechanosensitive ionenkanalen, axonale vervoer verordening axonale cytoskelet dynamiek, calcium signalering en morfologische veranderingen met traumatisch hersenletsel.
De vorming van de varicosity, of zwelling/beading, langs de axonen, is een opvallend kenmerk van neurodegeneratie waargenomen bij veel aandoeningen of verwondingen van het centrale zenuwstelsel, zoals multiple sclerose, ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, en traumatische hersenen letsel1,2. Ondanks de significante fysiologische effecten van axonale varicosities over actiepotentiaal propagatie en synaptische transmissie3is het onbekend hoe de varicosities worden gegenereerd. Onlangs, een nieuw opgerichte microbiomechanical assay op gekweekte hippocampal neuronen van knaagdieren gebruikt, we vonden dat een mechanische stimuli varicosities in deze neuronen met zeer intrigerende functies kunnen veroorzaken. Ten eerste, varicosity-inductie is snelle (< 10 s) en dit proces is onverwacht omkeerbaar. Ten tweede, de afhankelijk van de varicosity Inleiding sterkte puffend druk: hoe hoger de druk, hoe sneller de opening. Ten derde hangt varicosity initiatie in neuronale leeftijd. De axonen van jongere neuronen lijken ontvankelijker voor mechanische stress, vergeleken met die van oudere neuronen. Ten vierde, de vorm van de varicosities langs de axonen van hippocampal neuronen, terwijl de dendrites en eerste axon segmenten van deze neuronen geen verandering onder dezelfde puffende voorwaarde weergeven Onze studie bleek dus, een nieuwe functie van neuronale polariteit. Deze bevindingen met de in vitro -systeem zijn fysiologisch relevant. Met behulp van een in vivo -model voor licht traumatisch hersenletsel (mTBI), toonden we dat axonale varicosities ontwikkeld in een multi focale mode in de Somatosensorische cortex van de muizen onmiddellijk na sluiten-schedel impact, conform onze in vitro resultaten4. Het is belangrijk op te merken dat onze kleuring en beeldvorming van de mTBI muizen bieden slechts een onverwacht schot van neuronale morfologische veranderingen, sinds het uitvoeren van in vivo time-lapse beeldvorming van neuronale morfologie tijdens een mechanische impact is nog niet haalbaar.
Dit systeem van vloeistof-puffend konden we niet alleen unieke functies die zijn gekoppeld aan mechanische stress-geïnduceerde varicosity vorming, maar ook om te bepalen van het onderliggende mechanisme. Door het testen van verschillende extracellulaire oplossingen, de blokkers en openers van verschillende kandidaten van mechanosensitive ionenkanalen, en cellulaire electrofysiologie, vastgesteld wij dat de potentiële catie van voorbijgaande receptor kanaal onderfamilie V lid 4 (TRPV4) kanaal dat is luchtdoorlatend Ca2 + en nb+ en geactiveerd door puffend is voornamelijk verantwoordelijk voor het opsporen van de eerste mechanische spanning tijdens axonale varicosity formatie4. Dit wordt verder bevestigd met een knock-out-benadering van siRNA. Samen genomen, dit nieuwe systeem van de test die hebben we ontwikkeld met hippocampal neuron cultuur, is zeer waardevol voor het bestuderen van de eigenschappen van de micromechanische van centrale neuronen, vooral in combinatie met andere technieken.
Dit micromechanische systeem dat wij hebben opgebouwd is uniek en verschilt van de eerder bestaande systemen in verschillende belangrijke aspecten. Eerst, ervaar de neuronen in dit systeem, uit-van-plane mechanische stress in de vorm van compressie en afschuiving. Tijdens de botsing zijn mechanische neuronale processen blijven gehecht aan het dekglaasje aan oppervlak en niet verplaatst. Dit verschilt van andere experimentele systemen die voornamelijk buigen en strekken van in-plane (of spanning), bijvoorbeeld, de uitwijking van gebundelde axonen als tekenreeksen5,6 verplaatsen of strekken axonen geteeld op micropatterned kanalen en rekbare membranen7,8. Bovendien, hoewel axonale varicosities kunnen ook worden opgewekt deze testen zoals in ons systeem van vloeistof-puffend, het proces in deze instellingen veel langer duurt (vanaf 10 min op verschillende uren6,–7,8) en verschijnt onomkeerbaar. Ten slotte, ons systeem met behulp van lokale vloeistof puffend staat het onderzoek van de ruimtelijke kenmerken van varicosity formatie (bv., dendrites, dendritische spines, soma, axonale eerste segmenten, axonale terminals), naast de tijdelijke functies. Met behulp van dit systeem, ontdekten we verschillende onverwachte en unieke functies van axonale varicosity formatie, vooral snelle begin traag reversibele en axon-dendriet polariteit.
Het systeem dat we in dit papier bespreken is compatibel met vele technieken voor moleculaire en celbiologie. Bijvoorbeeld, om te bestuderen van de gevolgen van mechanische belasting voor neuronale morfologie en functie, kan het worden gebruikt samen met myeline coculture, time-lapse imaging van fluorescerende resonantie energieoverdracht (FRET) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF), calcium beeldvorming, en patch klem opname. In dit document richten we ons op de belangrijkste onderdelen van het systeem. Hippocampal neuron cultuur, de vloeistof-puffend setup, high-resolution time-lapse imaging voor axonale vervoer en calcium imaging worden stapsgewijze hieronder geïllustreerd.
De procedure voor deze microbiomechanical assay is ongecompliceerd. Het zal produceren betrouwbare resultaten, als alle zijn stappen zorgvuldig worden uitgevoerd. Er zijn verschillende belangrijke stappen die, als onjuist wordt uitgevoerd, succesvolle gegevensverzameling belemmeren zal. De kritische stappen beginnen stroomopwaarts van de daadwerkelijke toepassing van de puffende stimulus. Zorgvuldige dissectie, kweken en zorg van de primaire neuron cultuur staan. Als de beschaafde neuronen niet gezond zijn, zullen ze nie…
The authors have nothing to disclose.
Alle dierproeven zijn uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid dier gebruik richtsnoeren. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01NS093073 en R21AA024873) aan C. Gu.
12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
micromanipulator | Sutter Instruments | ||
NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |