Summary
Este protocolo descreve uma abordagem fluida pressurizada, fisiologicamente relevante para a indução rápida e reversível de varizes nos neurônios.
Abstract
Varizes axonal são estruturas alargadas dos poços de axônios com um alto grau de heterogeneidade. Eles estão presentes não só no cérebro com doenças neurodegenerativas ou ferimentos, mas também no cérebro normal. Aqui, descrevemos um sistema recém-criada Micromecânico para rápida, confiável e reversível induzir axonal varicosidades, permitindo-na compreender os mecanismos que regem a formação de varizes e composição de proteínas heterogêneas. Este sistema representa um romance meio para avaliar os efeitos do estresse de compressão e cisalhamento em diferentes compartimentos subcellular de neurônios, diferentes de outros sistemas em vitro que concentram-se principalmente sobre o efeito de alongamento. Importante, devido as características únicas do nosso sistema, recentemente fizemos uma descoberta romance, mostrando que a aplicação do fluido pressurizado pode rapidamente e reversivelmente induzir varicosidades axonal através da ativação de um canal potencial transiente do receptor. Nosso sistema biomecânico pode ser utilizado convenientemente em combinação com perfusão de drogas, célula viva de imagem, imagem de cálcio e gravação de braçadeira do remendo. Portanto, esse método pode ser adotado para o estudo de canais de íon mechanosensitive, regulamento de transporte axonal, dinâmica do citoesqueleto axonal, sinalização de cálcio e alterações morfológicas relacionados ao traumatismo crânio-encefálico.
Introduction
Formação de varizes ou inchaço/perolização, ao longo do axônio, é uma característica proeminente de neurodegeneração observada em muitos distúrbios ou lesões do sistema nervoso central, incluindo esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e traumáticas 1,de lesão cerebral2. Apesar dos impactos fisiológicos significativos de varicosidades axonal na propagação do potencial de ação e transmissão sináptica3, como as varizes são geradas permanece desconhecida. Recentemente, usando um ensaio microbiomechanical recém-criada em neurônios hippocampal culturas de roedores, descobrimos que estímulos mecânicos podem induzir as varizes nestes neurônios com altamente intrigante características. Em primeiro lugar, a indução de varizes é rápida (< 10 s) e este processo é reversível inesperadamente. Em segundo lugar, a iniciação de varizes depende da força de pressão de sopro: quanto maior a pressão, mais rápido a iniciação. Em terceiro lugar, iniciação de varizes depende de idade neuronal. Os axônios dos neurônios jovens aparecem mais sensíveis ao estresse mecânico, comparado dos neurônios mais velhos. Em quarto lugar, a forma das varizes ao longo dos axônios dos neurônios hippocampal, enquanto as dendrites e segmentos do axônio inicial destes neurônios não exibir nenhuma mudança sob a mesma condição de sopro. Assim, nosso estudo revelou uma característica nova da polaridade neuronal. Esses achados com o sistema in vitro são fisiologicamente relevantes. Usando um modelo in vivo para leve traumatismo crânio-encefálico (mTBI), mostramos que as varizes axonal desenvolveram de forma multi focal no córtex somatossensorial dos ratos imediatamente após fechar-crânio impacto, consistente com o nosso em vitro resultados4. É importante notar que nossa coloração e da imagem latente dos ratos mTBI fornecem apenas um snap shot de alterações morfológicas neuronais, desde executar na vivo imagem de lapso de tempo da morfologia neuronal durante um impacto mecânico é ainda não é viável.
Este sistema de fluido-sopro nos permitiu não só para capturar características únicas associadas com a formação de varizes induzida por estresse mecânico, mas também para determinar o mecanismo subjacente. Ao testar diferentes soluções extracelulares, os bloqueadores e abridores de candidatos diferentes de canais de íon mechanosensitive e Eletrofisiologia celular, identificamos que o cátion potencial transiente do receptor canal membro da subfamília V 4 (TRPV4) canal permeável ao Ca2 + e at+ e ativada pelo sopro é principalmente responsável pela detecção de estresse mecânico inicial durante a formação de varizes axonal4. Isto foi confirmado ainda mais com uma abordagem de nocaute de siRNA. Tomados em conjunto, este novo sistema de ensaio, que temos desenvolvido com cultura de neurônio hippocampal, é altamente valiosa para estudar as propriedades micromecânicas de neurônios centrais, especialmente em combinação com outras técnicas.
Este sistema Micromecânico estabelecemos é único e difere dos sistemas existentes anteriormente em vários aspectos importantes. Em primeiro lugar, neste sistema, os neurônios experimentam fora-do-avião estresse mecânico nas formas de compressão e cisalhamento. Durante o impacto mecânico, processos neuronais ficar aderente à superfície da lamela e não se mexa. Isto difere de outros sistemas que envolveu principalmente flexão e alongamento no plano experimental (ou tensão), por exemplo, a deflexão de axônios empacotados como movendo sequências de caracteres de5,6 ou alongamento axônios cultivados em micropatterned canais e membranas stretchable7,8. Além disso, embora as varizes axonal podem também ser induzidas nestes ensaios como no nosso sistema de fluido-sopro, o processo nessas configurações leva muito mais tempo (a partir de 10 min para várias horas6,7,8) e aparece irreversível. Finalmente, o nosso sistema usando o sopro fluido local permite o exame das características espaciais da formação de varizes (EG., dendrites, espinhas dendríticas, soma, segmentos iniciais axonal, terminais axonal), além de suas características temporais. Usando este sistema, descobrimos vários recursos inesperados e exclusivos de formação de varizes axonal, especialmente rápido início lenta reversibilidade e polaridade do axônio-dendrito.
O sistema que discutimos neste trabalho é compatível com muitas técnicas de molecular e biologia da pilha. Por exemplo, para estudar os efeitos do estresse mecânico na morfologia neuronal e função, pode ser usada em conjunto com coculture de mielina, lapso de tempo por imagem da transferência de energia de ressonância fluorescente (FRET) e reflexão interna total da fluorescência (TIRF), imagem de cálcio e gravação de braçadeira do remendo. Neste trabalho, focalizamos os componentes do núcleo do sistema. Cultura de neurônio hippocampal, o fluido-sopro de instalação, de alta resolução de imagem de lapso de tempo para o transporte axonal e imagem de cálcio são ilustradas passo a passo abaixo.
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Protocol
Todos os métodos descritos a seguir foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Ohio State University.
1. preparação lamela
- Coloque uma ou mais caixas de lamelas de 12 mm ou 25 mm para um copo de vidro contendo 70% de ácido nítrico e incubar as lamelas à temperatura ambiente durante a noite.
Nota: Não lave as lamelas de 25 mm na mesma medida como as lamelas de 12 mm. É melhor lavá-las separadamente. - Transferir todas as lamelas para um copo de 4L preenchido com 2,5 L de DDQ2O e agitar o béquer contendo as lamelas para 1 h a 100 rpm. Use elásticos para segurar o copo durante a tremer. Repita o enxágue com 2,5 L fresco ddH2O quatro vezes.
- Lamelas de transferência limpada para um frasco seco com uma tampa de metal. Asse as lamelas em um forno a 225 ° C, durante 6 h e deixar arrefecer à temperatura ambiente.
Nota: A lamela de 25mm é propensa a quebrar. Separar as lamelas de um por um e secar ao ar e, em seguida, coza-os em um forno. - Armazene as lamelas limpas e secas em temperatura ambiente em um recipiente de plástico esterilizado até uso.
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Revesti as lamelas da seguinte forma:
- Prepare a solução de revestimento fresco num tubo de centrífuga.
- Coloque cada lamela em um poço de uma placa de 24 poços (ou 6-poços). Coloque 30 (ou 100) µ l da solução de revestimento de lamela (tabela 1) sobre uma lamela de 12 mm (ou 25 mm) e o redemoinho. Adicione 1 mL de salina tampão fosfato (PBS, grau de cultura de tecido) para o poço. Estas placas podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 ° C em PBS estéril para até uma semana.
- No dia de dissecação, remova a PBS. Secar ao ar e colocar as placas sob luz UV (30W) para 2-4 h.
Nota: A última etapa deve ser preenchida com a luz UV em uma capa de fluxo laminar de cultura de células. A porta do exaustor deve ser levantada ligeiramente para permitir o fluxo de ar para secar as lamelas.
2. dissecção, dissociação e cultura de neurônios Hippocampal do rato/rato grávido
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Dissecção e dissociação dos neurônios hippocampal para cultura
- Descongelar a solução de enzima protease (23 protease 3 mg/mL em SLDS, tabela 1) e pré-aquecer chapeamento mídia (tabela 2) a 37 ° C.
- Dissecar o hipocampo e enxágue com morte súbita, de acordo com os métodos descritos no anterior publicação14.
Nota: Quatro hipocampo fornece células suficientes para um 24-poço ou uma placa de 6. - Remover o SLDS, adicionar 2 mL de solução de enzima protease e incubar a amostra a 37 ° C, 5% de CO2 por 15 min.
- Os hipocampo explantes com 5-10 mL de meio de chapeamento de lavar duas vezes. Adicione 5 mL de chapeamento médio. Dissocia hippocampal explantes em células individuais, gerando um pequeno vórtice usando uma pipeta com uma ponta de plástico de 1 mL. Pipete acima e para baixo cerca de 40 vezes, evitando a formação de bolhas de oxigênio, até que a solução se torna opaco e sem pedaços grandes de explant permanecem.
Nota: Lembre-se de deixar alguns meios de comunicação durante as lavagens, os explantes hippocampal devem permanecer submersos no meio durante todo o processo. - Centrifugar as células a 1.125 x g, durante 3 min. remover o sobrenadante com as células submerso na mídia. Ressuspender as células em 145 mL de chapeamento de mídia. Adicione 1 mL/poço de suspensão de célula para uma placa de 24 (3 mL/bem de uma placa de 6).
Nota: 145 mL de chapeamento de mídia é usado para produzir uma suspensão de células que tem uma densidade celular baixa. Este volume permitirá o chapeamento de células em placas de 24 poços seis, oito placas 6-poços ou várias combinações de placas de 24 - ou 6-bem dependendo das experiências conduzidas. Cada poço da placa de 24 poços terá cerca de 3 x 104 células9. - Incube as celulas na mídia do chapeamento a 37 ° C, 5% de CO2 para 2-4 h, em seguida, remover todos os meios de chapeamento e substituí-lo com mídia de manutenção fresco.
- Depois de 2 dias (2 dias em vitro, 2DIV), substitua metade da mídia com 2 µM Ara-C (arabinosylcytosine) dissolvido em meios de manutenção que inibem o crescimento de células de fibroblastos, endoteliais e glial. Após expor as células de Ara-C por dois dias, troque a mídia mídia manutenção fresco.
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Transfeccao para a visualização da morfologia celular
Nota: Transfect as células com construções fluorescentes de proteína fluorescente de proteína verde fluorescente (GFP), amarelo (YFP), mCherry, etc. para iluminar a morfologia de neurônios individuais.- Dilua as construções do estoque (1 µ g / µ l) em mídia Opti-MEM (0,8 µ g da construção em 50 µ l de mídia Opti-MEM) e vortex. Prepare 1 diluição de construção para cada poço.
Nota: Necessita de uma placa de 24 0,8 µ g de construção em 50 µ l de mídia Opti-MEM. Uma placa de 6 requer 2,4 µ g de construção em mídia de Opti-MEM 150 µ l. - Reagente de Transfeccao de lipossoma-mediada diluído em mídia Opti-MEM (1,5 µ l de reagente de transfeccao em 50 µ l de mídia Opti-MEM) e vortex. Prepare 1 diluição de Transfeccao para cada poço.
Nota: Uma placa de 24 requer 1,5 µ l de reagente de transfeccao em 50 µ l de mídia Opti-MEM. Uma placa de 6 requer 4,5 µ l de reagente de Transfeccao de 150 µ l de mídia Opti-MEM. - Prepare uma mistura de 1:1 (100 µ l) de construção de reagente de mídia e transfecção Opti-Mem na mídia Opti-MEM e vortex. Incube a mistura à temperatura ambiente por 20 min.
Nota: Por bem, deve haver cerca de 100 µ l de solução contendo reagente de transfeccao, construção e mídia Opti-MEM se usando uma placa de 24 (300 µ l para a placa de 6). - Retire metade da mídia (500 µ l para placa de 24, 1,5 mL para a placa de 6) de cada poço e transferir essa mídia em um tubo limpo cônico. Mantenha este tubo na incubadora. Em seguida, adicione a mistura de 100 µ l (etapa 2.2.3) para os restantes meios de comunicação no poço. Permitir que as células incubar a 37 ° C por 20-30 min.
- Durante a incubação (etapa 2.2.4), adicione um volume de mídia manutenção fresco para a mídia no tubo cónico (etapa 2.2.4). Coloque a mistura na mesma incubadora (37 ° C e 5% CO2).
- Após a incubação, remova toda a mídia que contém a solução de transfeccao dos poços e substituí-lo com a mistura 1:1 da velha e mídia de manutenção fresco no tubo cónico (etapa 2.2.5).
Nota: Dependendo do tamanho das construções, as células podem começar expressando dentro 12 h; para construções maiores, 3-4 dias podem ser necessários antes que a expressão de pico das construções é atingida.
- Dilua as construções do estoque (1 µ g / µ l) em mídia Opti-MEM (0,8 µ g da construção em 50 µ l de mídia Opti-MEM) e vortex. Prepare 1 diluição de construção para cada poço.
3. Configurando o aparelho de pipeta sopro
Nota: Existem cinco componentes básicos para este set-up: a pipeta de vidro, o tubo, a seringa, o micromanipulador e a Reserva (Hank). Qualquer reserva que tem concentrações fisiologicamente relevantes de sal pode ser usada neste set-up.
- Puxe uma pipeta de borosilicato ter em torno de 45 µm de diâmetro abertura ponta usando um extrator de micropipeta e as especificações na tabela 3.
Nota: Se verificou que 45 µm é um tamanho adequado para o diâmetro da pipeta abertura sob condições experimentais. Pequenas variações no tamanho da abertura não deverá afectar significativamente os resultados. É importante notar que grandes partidas deste número ainda devem funcionar para a indução de varizes ajustando a altura da seringa que está vinculada a pipeta através da tubulação, mas isso exigirá recalibração do valor de pressão. - Insira a extremidade não-puxada da pipeta no tubo de borracha fina.
Nota: A parede do tubo deve ser fina e rígida para minimizar a resistência fluida, garantindo que a altura da seringa é diretamente proporcional à pressão do fluido que flui através da pipeta com resistência desprezível. A tubulação deve ser não mais do que cerca de 0,6 m de comprimento para mais minimizar a resistência. - Conecte a outra extremidade do tubo a uma seringa de plástico de 10 mL através de um conector com uma válvula capaz de vez.
Nota: A seringa de plástico precisa ser realizado a uma altura constante, mensurável para garantir uma medida exata para a suposta pressão fluindo da pipeta. Uma altura de 190 mm foi utilizada, desde que este fornece pressão mínima mas confiável induz as varizes em axônios. Outros valores de altura também podem ser utilizados se a pressão com que as células desanexar da superfície da lamela. É recomendável usar a mesma configuração em todo o experimento. - Inserir a pipeta na parte superior do parafuso do micromanipulador para segurar a pipeta no lugar. Aparafuse o parafuso coberto metal, plano, preso ao braço micromanipulador para que prende o un-puxada final da pipeta logo acima onde o tubo de borracha é anexado. Ângulo da pipeta em um ângulo de 45° com a superfície das neurônio-contendo lamelas.
Nota: O micromanipulador deve ser construído para que a pipeta pode ser realizada sem constrição o tubo de borracha. O micromanipulador deve permitir o movimento da pipeta no x, y e z direções com precisão a posição dentro do alcance das células. Um gráfico, bem como uma fotografia do aparelho é fornecido abaixo (Figura 1). - Ligar um filtro de fluorescência, abrir a abertura e certifique-se de que uma mancha fluorescente pode ser vista passando o objetivo. Usando o micromanipulador, mova a pipeta em uma posição que se alinha a ponta com a mancha fluorescente e abaixam a pipeta em uma posição acima da altura do prato de cultura celular (35 x 10 mm). Uma vez que está em posição, ligue a luz transmitida e desligar da fluorescência.
- Usando uma pinça, adicione uma lamela (com as células para cima em direção a pipeta) da placa de cultura de células para o prato de cultura de células contendo cerca de 2 mL de tampão de Hank está à temperatura ambiente.
- Coloque a placa de cultura contendo a lamela sobre o escopo.
- Usando o botão de foco fino e objectivo de X 20, centrar-se num avião com quatro voltas completas acima das células (cerca de 0,4 mm). Use o micromanipulador para posicionar a ponta da pipeta que é focado e no centro, lado esquerdo do avião como visto através do olho-peças.
Nota: Dendritos são projeções que devem estar no mesmo quadro de como o corpo da célula que eles se originam. Para induzir as varizes axonal, um deve seguir mais projecções do corpo celular para axônios medial e distais.
4. calibrar a pressão da pipeta utilizando um sistema de membrana elástica
- Aparato de pipeta sopro com os exatos mesmos parâmetros de configuração conforme descrito acima, sobre um sistema contendo uma membrana de silicone microfabricated (500 µm de diâmetro) e 50 µm de espessura e concentrar o microscópio para a superfície da membrana.
Nota: Este sistema foi projetado para medir pressão de pequenos valores e uma explicação do sistema foi publicada antes das10. Esta medida só precisa ser feito uma vez para experimentos de sopro, se a mesma configuração exata de sopro é usada. - Focar o microscópio as matrizes de micropontos (4 µm de diâmetro) e 10 µm distante, medido entre os centros. Gire a válvula e deixe o óleo flua para fora da pipeta. Examine a deflexão da membrana em resposta à pressão de fluido com um microscópio confocal.
- Utilize um modelo linear para determinar a pressão correspondente associada a deflexão da membrana.
Nota: Embora um recente estudo descobriu que uma deflexão de w =-3.143 ± 0,69 µm foi obtido para a altura de seringa de 190 mm, isso produziu uma pressão de 0,25 ± 0,06 µm/nN2 da configuração de pipeta do atual, que está dentro da faixa fisiológica e patológica, embora o altura da seringa não é o único determinante. Outros fatores influenciam o valor exato da pressão sobre os neurônios, bem como, incluindo pipeta abrindo, posicionamento (ângulo e distância) da ponta da pipeta em relação as células e nem a flexibilidade da tubulação4,10.
5. sopro para induzir as varizes
- Uma vez que a pipeta na posição, focar o microscópio um avião que contém uma região de interesse. Posicione as células e processos na metade esquerda do campo de imagem (visto por captura ao vivo da câmera) dentro da zona de sopro, enquanto a metade direita está fora da zona de sopro.
Nota: Devido à extensa consequência de axônios e dendritos dos neurônios, é improvável que todos os processos de um neurônio são dentro da mesma área de sopro. Esta é realmente uma vantagem deste sistema, que permite o exame do efeito local do sopro. Existem dois tipos de sopro que podem ser utilizados para induzir as varizes: longa duração soprar e soprar de pulso. -
De sopro
- Sopro de longa duração
- Posicione a seringa na altura, 190 mm acima da lamela contendo neurônios cultivados4. Começa o time-lapse de imagem da área de interesse com um tempo de exposição otimizada, revelando a morfologia neuronal claro. Capture pelo menos 15 quadros em um intervalo de 2 s (total de 30 s) como a linha de base. O intervalo pode ser ajustado com base na experiência. No quadro 16, abra a válvula de paragem turn-capaz da seringa e deixe o óleo flua para 75 frames (150 s). No quadro 75, desliga a válvula para que o fluxo de fluido batentes. Pare a captura de vídeo.
Nota: Isto deve induzir as varizes axonal nos neurônios 7-9 DIV dentro de 5 a 10 s, Considerando que os neurônios mais velhos demoram mais para as varizes de forma.
- Posicione a seringa na altura, 190 mm acima da lamela contendo neurônios cultivados4. Começa o time-lapse de imagem da área de interesse com um tempo de exposição otimizada, revelando a morfologia neuronal claro. Capture pelo menos 15 quadros em um intervalo de 2 s (total de 30 s) como a linha de base. O intervalo pode ser ajustado com base na experiência. No quadro 16, abra a válvula de paragem turn-capaz da seringa e deixe o óleo flua para 75 frames (150 s). No quadro 75, desliga a válvula para que o fluxo de fluido batentes. Pare a captura de vídeo.
- Sopro de pulso (duração de 2 s)
- Posicione a seringa na altura apropriada (190 mm). Começar a imagem latente de lapso de tempo e capturar pelo menos 15 quadros (30 s) em um intervalo de 2 s. No quadro 16, abra a válvula da seringa e permitir o fluxo de fluido e, em seguida, feche a válvula após 2 s. espere 5-20 s (dependendo da frequência a ser testado) antes de abrir a válvula novamente. Repeti a abertura e fechamento da válvula para criar pulsos de fluido e continuar por um período total de 150-300 s continuar lapso de tempo de imagem por 20 min para capturar a fase de recuperação.
Nota: Quando o intervalo for maior do que 10 s, os pulsos de induzem menos drasticamente as varizes. Em um intervalo de 20 s, sem as varizes podem ser induzidas pelos pulsos4. Para obter a formação de varizes confiável, consistente, recomenda-se a altura da seringa deve ser cerca de 190 mm. altura de seringa e pressão do fluido não deve ser elevado a um ponto onde as células começam a desanexação da superfície da lamela.
- Posicione a seringa na altura apropriada (190 mm). Começar a imagem latente de lapso de tempo e capturar pelo menos 15 quadros (30 s) em um intervalo de 2 s. No quadro 16, abra a válvula da seringa e permitir o fluxo de fluido e, em seguida, feche a válvula após 2 s. espere 5-20 s (dependendo da frequência a ser testado) antes de abrir a válvula novamente. Repeti a abertura e fechamento da válvula para criar pulsos de fluido e continuar por um período total de 150-300 s continuar lapso de tempo de imagem por 20 min para capturar a fase de recuperação.
- Antes de um dia de uso, limpe o set-up (pipeta, tubo e seringa) fluindo sobre 10 mL 70% etanol através da afinação. Após o etanol lavar, 10 mL de tampão de Hank (ou buffer desejado) de vazão a afinação de preparar o sistema para uso daquele dia. Depois de experiências de acabamentos para o dia, limpe a configuração como descrito anteriormente com etanol para impedir o crescimento de contaminantes durante a noite.
- Sopro de longa duração
6. métodos de cumprimentar
Nota: O ensaio de sopro pode ser combinado com uma variedade de técnicas diferentes que são discutidos na seção Introdução. Aqui, o foco é sobre as técnicas de núcleo que mais frequentemente são usadas junto com o sopro do ensaio, incluindo imagens de timelapse de fluorescência de alta resolução, imagem de cálcio e ensaios de recuperação. Estes são discutidos abaixo.
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Conduta de alta resolução de imagem fluorescente de lapso de tempo, seguindo o protocolo abaixo
- Acompanhar o movimento de proteínas fluorescente-etiquetadas dentro neurônios com 100 X lente de petróleo. Os neurônios são transfected com construção de cDNA adequada. Capturar para 150 quadros (total 300 s) com um intervalo de 2 s.
Nota: Às vezes, imagem de lapso de tempo múltiplo-cor é realizada para a circulação de mais de uma proteína fluorescente-com a tag da imagem simultaneamente. - Gere um kymograph através do software de captura de vídeo ou através do ImageJ (NIH).
Nota: A velocidade e a direção de viagem podem ser determinadas usando o kymograph. * Ser claro notar a direção encontra-se a soma da região capturada. Viagem em direção a soma é retrógrada, enquanto viajar longe o soma à ponta axonal é anterógrada. - Repeti este processo após o sopro, ou um kymograph pode ser criado usando a captura de imagens durante o ensaio de sopro.
Nota: Os efeitos de soprar no transporte axonal de mitocôndrias e proteínas sinápticas foram mostrados em um recente papel4.
- Acompanhar o movimento de proteínas fluorescente-etiquetadas dentro neurônios com 100 X lente de petróleo. Os neurônios são transfected com construção de cDNA adequada. Capturar para 150 quadros (total 300 s) com um intervalo de 2 s.
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Imagem de cálcio
- Adicionar 1 µ l (para uma placa de 24) ou 3 µ l (para uma placa de 6) de 5mm Fluo-4 AM para a cultura de mídia em um bem e incuba a 37 ° C por 30 min.
- Lave as células duas vezes com tampão de 1 mL do Hank.
Nota: Carregados neurônios emitem fluorescência verde através de um conjunto de filtro FITC. Loci denota regiões de apreciável cálcio dentro da célula. Quando combinado com sopro, pode ser visto um aumento na intensidade (aumento no nível de cálcio interno).
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Recuperação de varizes
Nota: Imediatamente após um experimento de sopro, um experimento de recuperação de 20 min pode ser efectuado.- Capturar imagens para 300 quadros (1.200 s) com um intervalo de 4 s.
Nota: Uma célula transfectada com YFP solúvel/mCherry/GFP deve mostrar um nível moderado (inferior a 50%) de recuperação, no final da sessão de imagens. Axonal recuperação depende de uma série de fatores, tais como a fase de desenvolvimento dos neurônios cultivados4. Isto também pode ser combinado com alta resolução de imagem fluorescente e a imagem latente de cálcio acima descrito.
- Capturar imagens para 300 quadros (1.200 s) com um intervalo de 4 s.
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Representative Results
Antes de soprar, axônios normalmente mostram pouca formação de varizes. Seguir fumando com nosso padrão de pressão (190 mmH2O altura), o início de axônios para desenvolver varizes de grânulo, como muitas. A formação de varizes é parcialmente reversível, conforme mostrado pelas regiões do axônio retornando ao seu estado pré-inchado após um período de recuperação de 10 min (Figura 2A-B). Após um longo período de recuperação (> 20 min), alguns axônios se recuperar completamente. Não posicionamento qualidade inferior da pipeta sopro bem como o posicionamento exato da seringa em 190 milímetros acima do palco pode gerar as varizes rapidamente. Condições ideais devem resultar na formação de varizes nos axônios dos neurônios jovens (cerca de 7 DIV) em cerca de 5 s4.
Figura 1 : Esquema e fotografia de soprar o aparelho. (A) fotografias mostrando a configuração geral do microscópio. (B) aparelhos mostrando a pipeta de vidro de sopro realizada pelo micromanipulador e ligado para o tubo de borracha. Imagens com foco em avião de neurônios hippocampal preliminares mostrando a sombra da pipeta na parte inferior direita de contraste de fase (C). (D) fora do avião de célula focada na ponta da pipeta de sopro. (E) esquema de distâncias e pressões calculadas para induzir as varizes. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Imagens representativas de formação de varizes após soprar. Imagem do (A) de 7DIV, neurônios hippocampal do GFP transfectada rato mostrando um axônio pré- e pós-soprar bem como após um período de recuperação de 10 min. (B) Kymograph de lapso de tempo por imagens do neurônio no (A). Setas vermelhas indicam as varizes que se formaram após 150 s de 190 mmH2O sopro (começando em 30 s). Barra de escala = 15 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de revestimento de lamela | |
| 780 Μ l | Estoque de ácido acético acid17 mM: 50 µ l de ácido acético em 50 mL de H2O |
| 200 Μ l | Poli-D-lisina (estoque de 0,5 mg/mL) |
| 20 Μ l | Colágeno de cauda de rato (estoque de 3 mg/mL) |
| O volume total é determinado com base no número de lamelas para ser revestido. | |
Tabela 1: solução de revestimento de lamela. Fornece a receita para preparar a solução de revestimento de lamela usada para aderir pilhas cultivadas para as lamelas.
| 1 x fatia dissecação solução (SLDS), filtrado, pH = 7,4, loja a 4 ° C | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | At2então4 |
| 30 mM | K2então4 |
| 10 mM | HEPES (ácido livre) |
| 10 mM | D-glicose |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0,00% | Vermelho de fenol (opcional) |
| Chapeamento de mídia (PM, filtrar, armazenar a 4 ° C) | |
| 439 mL | Sais do MEM Earle |
| 50 mL | FBS |
| 11,25 mL | 20% D-glicose |
| 5 mL | Piruvato de sódio (100 mM), |
| 62,5 Μ l | L-glutamina (200 mM) |
| 5 mL | Penicilina/estreptomicina (P/S, 100 x) |
| Manutenção de mídia (MM, filtrar, armazenar a 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | Suplemento de 50 x B27 |
| 1,25 mL | L-glutamina (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| Todas as soluções são esterilizadas usando um filtro com tamanho de poro de 0,2 mm. | |
Tabela 2: receitas de meios de cultura de células. Fornece as receitas para preparar a mídia utilizada no cultivo de células neurônio hippocampal primário.
| Tampão do Hank (filtro, pH = 7,4, loja a 4° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 mM | JCM |
| 1.2 mM | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-glicose |
| 20 mM | HEPES |
Tabela 3: receita do amortecedor do Hank. Fornece a receita para preparar o buffer utilizado no protocolo de sopro e durante a imagem latente da viver-pilha.
| Pipetar puxando parâmetros | |||||
| Calor | Puxe | Velocidade | Atraso | Pressão | Rampa |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
Tabela 4: Pipetar puxando parâmetros. Fornece os parâmetros para ser definido sobre o extrator de pipeta para obter uma abertura que é cerca de 45 µm de diâmetro.
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Discussion
O procedimento de ensaio este microbiomechanical é para a frente. Produzirá resultados fiáveis, se todos os seus passos são cuidadosamente realizados. Existem várias etapas-chave que, se incorrectamente executados, vão dificultar a coleta de dados bem sucedida. Os passos críticos começam a montante da aplicação real do sopro estímulo. Dissecção cuidadosa, cultivo e cuidados da cultura neurônio primário são primordiais. Se os neurônios cultivados não são saudáveis, não reagirão consistentemente, desde que eles podem ter já foi preparados para o stress. A jusante da cultura, o set-up inicial e a calibração do aparelho sopro para fornecer pressão consistente, que irá induzir as varizes, mas não irá causar o desprendimento das células da superfície da lamela, deve ser executada com paciência. Calibração precisa de afinação pode demorar 1h devido ao entupimento de pipeta, tubo ou problemas nas válvulas. É fundamental para garantir que o fluido escorre para fora da pipeta com resistência mínima antes de avançar com a colocação das células no prato e posicionar a ponta da pipeta. Que respeita às modificações para o set-up, um pode emparelhar o aparelho de sopro com perfusão, remendo de aperto e qualquer outro baseado em microscópio instrumento, na maior parte dependente do espaço físico livre nas laterais do microscópio.
Este sistema tem duas limitações intrínsecas que precisam de atenção. O set-up consistentemente pode iniciar a formação de varizes reversíveis em axônios de neurônios hippocampal cultivados através de sopro fluido para as células. No entanto, é importante notar que os valores de pressão exata para os neurônios dentro do mesmo campo de sopro não são idênticos. A pressão do líquido que as pilhas, calculado com base na medição de carga de pressão de membrana de silicone um microfabricated4,10, representa a pressão média no centro do campo de sopro. Assim, a pressão de sopro exata é o mais alto no centro do campo de sopro e a mais baixa em torno da borda do campo. Nós mostramos que a pressão força correlaciona-se com o início, o tamanho e o número de varicosidades induzida por4. Maior pressão resultou no aparecimento mais rápido, maior e mais abundantes as varizes4. Em estudos recentes, usamos uma pressão mínima (190 mmHg na ponta da pipeta sopro) que ainda confiável pode induzir as varizes na maioria dos axônios4. Sob esta condição, o aparecimento de varizes para neurônios jovens é normalmente cerca de 5 s. É importante observar que com o exato mesmo soprar o sistema, o valor do tempo de início pode variar, que não só depende do tipo neuronal, idade e compartimento subcelular, mas também pode ser influenciada pela posição do neurônio no campo de sopro. Apesar da variação da pressão de sopro recebido pelos neurônios, este sistema de ensaio ainda fornece um meio confiável para estudar efeitos mecânicos nos neurônios centrais e produz resultados experimentais altamente consistentes e reprodutíveis.
A segunda limitação do sistema é o seu problema de entupimento. Para atingir a pressão fisiologicamente relevante, a abertura da pipeta é pequena, em torno de 45 μm. No entanto, a pequena abertura tende a obstruir-se com os restos do tubo plástico e os escombros na ponta da pipeta podem claramente ser visto sob o microscópio. Isto aumenta a quantidade de tempo preparando o set-up, no caso de um entupimento de pipeta. Portanto, todas as soluções são cuidadosamente filtradas antes de ser colocado na seringa, um tubo e uma pipeta. Também é importante lavar o sistema de sopro com etanol a 70% no início e no final do dia, seguido por lavagem com buffer de filtrado do Hank. Para resolver o problema potencial de entupimento, sugerimos tentar puxar várias pipetas. É essencial para confirmar que a solução está inchada na verdade fora a pipeta através da visualização antes de iniciar os experimentos. Uma vez estabelecido um bom sistema de sopro, geralmente pode durar para o resto do dia.
Este ensaio biomecânico, combinado com a cultura do neurônio, apresenta uma oportunidade única para estudar o neurônio central mechanosensation simulando as condições fisiológicas e/ou fisiopatológicas. Este sistema nos permite examinar os efeitos de compressão e cisalhamento em neurônios. Em contrapartida, outros sistemas foram usados para examinar no plano alongamento5,6,7. A pressão média recebida pelos neurônios no centro das áreas sopro é 0,25 ± 0,06 µm/nN2 em nosso sistema4. Esta pressão exercida sobre as células é comparável com o módulo de elasticidade de neurônios hippocampal medido anteriormente utilizando a digitalização força microscopia e granel reologia, para identificar a deformação induzida opticamente13,14, bem como pressões, usadas para alterar o crescimento do axônio bordos de ataque em vitro, medido por varredura forçam microscopia (0,27 ± 0,04 µm/nN2)16. Esta pressão não exceda a pressão que pode ser gerada naturalmente por células mesenquimais em um embrião de E11, medido usando óleo tamanho celular fluorescente mecanicamente específico de2,microdroplets (1,6 ± 0,8 nN/µm)14.
Este sistema já foi utilizado com sucesso em combinação com a imagem de cálcio, remendo de aperto, microscópio eletrônico e análise celular de um crânio fechado mTBI rato modelo4. O ensaio também pode ser usado em combinação com experimentos baseados em microscópio, tais como recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP), para examinar a proteína turn-over dentro as varizes, bem como FRET para estudar se interações da proteína-proteína são alteradas durante a formação de varizes. Essencialmente, qualquer método que pode ser feito usar um microscópio e uma célula viva, set-up de imagem pode ser emparelhado com este ensaio de sopro. A versatilidade deste teste é altamente valiosa em estudar os mecanismos moleculares subjacentes vários efeitos na morfologia neuronal e funções por Micromecânico estresse.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os institutos nacionais de Saúde Animal uso orientações. Este trabalho foi financiado em parte por concessões do National Institutes of Health (R01NS093073 e R21AA024873) para C. Gu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D.
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
