Summary
פרוטוקול זה מתאר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בלחץ נוזלים גישה עבור אינדוקציה מהיר ולא הפיכה של varicosities בנוירונים.
Abstract
Varicosities עצב הם המבנים מוגדלות לאורך המוטות של אקסונים עם רמה גבוהה של הטרוגניות. הם נמצאים לא רק את המוח עם מחלות ניווניות או פציעות, אלא גם במוח רגיל. כאן נתאר מערכת micromechanical החדש שהוקם לזירוז במהירות, באופן אמין ו הפיכה varicosities עצב, ומאפשר לנו להבין את המנגנונים השולטים היווצרות דליות והרכב החלבון הטרוגנית. מערכת זו מייצגת אמצעים חדשניים כדי להעריך את ההשפעות של הלחץ הטיה של דחיסה על תאים subcellular שונים של נוירונים, שונה ממערכות אחרות במבחנה המתמקדים בעיקר ההשפעה של מתיחות. חשוב, בשל התכונות הייחודי של המערכת שלנו, לאחרונה גילינו דבר הרומן מציג כי היישום של נוזל בלחץ יכול במהירות, הפיכה לגרום varicosities עצב דרך ההפעלה של ערוץ פוטנציאלי קולטן ארעי. מערכת biomechanical שלנו יכול להיות מנוצל בנוחות בשילוב עם התרופה זלוף, הדמיה תא חי, סידן ההדמיה וה תיקון קלאמפ הקלטה. לכן, בשיטה זו יכול להיות מאומץ ללמוד mechanosensitive יון ערוצי תחבורה עצב רגולציה, שלד התא עצב dynamics, סידן איתות, פגיעה מוחית הקשורים טראומטי שינויים מורפולוגיים.
Introduction
היווצרות דליות, או נפיחות/פלאיירים, לאורך אקסונים, הוא מאפיין בולט של הקשורים ניוון מוחיים נצפו הפרעות רבות או פציעה של מערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת נפוצה, אלצהיימר, פרקינסון, וטראומטית פגיעה במוח1,2. למרות ההשפעות פיזיולוגיות משמעותיות של varicosities עצב על הפצת פוטנציאל הפעולה, הסינאפסית3, איך נוצרים את varicosities נותר עלום. לאחרונה, שימוש assay microbiomechanical החדש שהוקם על נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית של מכרסמים, מצאנו כי גירוי מכני יכול לגרום varicosities של הנוירונים הללו עם מאוד מסקרן תכונות. ראשית, דליות אינדוקציה היא מהירה (< 10 s) תהליך זה הוא הפיך באופן בלתי צפוי. שנית, דליות חניכה תלוי בכח הנעוצה לחץ: הלחץ גבוה יותר, מהר יותר הקבלה. שלישית, דליות חניכה תלוי גיל עצביים. האקסונים של נוירונים הצעירים מופיעים קשובים יותר מכאניים, בהשוואה לאלו של נוירונים בוגרים. רביעית, הצורה varicosities לאורך האקסונים של נוירונים בהיפוקמפוס, בעוד דנדריטים של האקסון הראשונית מקטעים של נוירונים אלה מציגים ללא שינוי בתנאי והמתנשף אותו. לפיכך, המחקר שלנו גילה תכונה הרומן של קוטביות עצביים. ממצאים אלה עם מערכת במבחנה הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. באמצעות מודל ויוו עבור פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI), הראינו כי עצב varicosities התפתח בצורה רב נקודתית בקליפת המגע של העכברים מיד לאחר הפגיעה סגור-הגולגולת, עקבי עם שלנו במבחנה תוצאות4. חשוב לציין כי שלנו מוכתמים, הדמיה של העכברים mTBI מספקים רק זריקה הצמד של שינויים מורפולוגיים עצביים, מאז ביצוע ויוו הדמיה בצילום מואץ של מורפולוגיה העצבית במהלך השפעה מכני הוא עדיין לא ריאלי.
מערכת זו נשיפת-נוזל מותר לנו לא רק ללכידת תכונות ייחודיות המשויכים היווצרות דליות מפגינות מכני, אלא גם כדי לקבוע את מנגנון המשמש כבסיס. על ידי בדיקות שונות פתרונות חוץ-תאית, חוסמי ראשית של מועמדים שונים של תעלות יונים mechanosensitive, אלקטרופיזיולוגיה הסלולר, זיהינו כי הקטיון פוטנציאליים קולטן ארעי ערוץ תת V חבר 4 (TRPV4) ערוץ זה הוא חדיר2 + Ca, Na+ ומופעל על-ידי נשיפת אחראי בעיקר על גילוי ראשוני מכאניים במהלך היווצרות דליות עצב4. זה אושר עוד יותר בגישה נוקאאוט siRNA. . יחדיו, מערכת חדשה זו assay שפיתחנו עם התרבות נוירון בהיפוקמפוס, הוא חשוב מאוד ללמוד את המאפיינים micromechanical של הנוירונים מרכזי, במיוחד בשילוב עם טכניקות אחרות.
מערכת זו micromechanical הקמנו הוא ייחודי, שונה מערכות קיימות קודם לכן בכמה היבטים עיקריים. ראשית, מערכת זו, הנוירונים לחוות out-של-plane מכאניים בצורות של הטיה של דחיסה. במהלך ההשפעה מכני, תהליכים עצביים יישארו מצורפים השטח coverslip, אל תזוז. הדבר שונה מאופן אחרים ניסיוני מערכות מעורבים בעיקר כיפוף ומתיחות בתוך המטוס (או מתח), למשל, אפשרות סטיה של אקסונים ארוזות כמו העברת מחרוזות5,6 או מתיחה אקסונים גדל על micropatterned ערוצים וממברנות מתיחה7,8. יתר על כן, למרות varicosities עצב יכולה להיגרם גם על אלה מבחני כמו במערכת שלנו נשיפת-נוזל, תהליך הגדרות אלה לוקח הרבה יותר זמן (מ- 10 דקות עד מספר שעות6,7,8) ומופיע בלתי הפיך. בסופו של דבר, המערכת שלנו באמצעות נשיפת נוזלים מקומיים מאפשרת הבחינה של התכונות המרחבי של היווצרות דליות (למשל., דנדריטים, הדנדריטים, סומה, עצב מקטעי הראשונית, מסופי עצב), מלבד התכונות הזמנית שלו. באמצעות מערכת זו, גילינו מספר בלתי צפויים וייחודיים תכונות היווצרות דליות עצב, במיוחד התפרצות מהירה, איטית הפיכות ו האקסון-דנדריט קוטביות.
המערכת שנדון בו הנייר הזה הוא תואם עם טכניקות רבות של מולקולרית ותא ביולוגיה. למשל, כדי לחקור את ההשפעות של לחץ מכני על מורפולוגיה העצבית ותפקוד, זה יכול לשמש יחד עם מיאלין coculture, זמן לשגות הדמיה של העברת אנרגיה תהודה פלורסנט (סריג), קרינה פלואורסצנטית גמורה (TIRF), הדמיית סידן, תיקון קלאמפ הקלטה. בנייר זה, אנו מתמקדים מרכיבי הליבה של המערכת. נוירון בהיפוקמפוס תרבות, ההתקנה נשיפת-נוזל, ברזולוציה גבוהה בצילום מואץ דימות להעברה עצב ו סידן הדמיה מומחשים מפורטות להלן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות להלן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מדינת אוהיו.
1. Coverslip הכנה
- במקום אחד או יותר קופסאות coverslips 12 מ"מ או 25 מ מ לתוך גביע זכוכית המכיל 70% חומצה חנקתית, דגירה על coverslips בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
הערה: אנחנו לא שוטפים את coverslips 25 מ מ במיכל אותו כמו coverslips 12 מ מ. עדיף לרחוץ אותם בנפרד. - העברת כל coverslips לתוך גביע 4 L מלא עם 2.5 L של ddH2O ומנערים את הספל המכיל את coverslips עבור h 1 100 סל"ד. השתמש גומיות להחזיק את. הספל במהלך רועדת. חזור על רינס עם טרי 2.5 L ddH2O ארבע פעמים.
- העברה coverslips נקי בקבוקון יבש עם כיסוי מתכת. אופים את coverslips בתנור ב 225 מעלות צלזיוס במשך 6-אייץ ' ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת החדר.
הערה: coverslip 25 מ מ הוא נוטה שבירה. להפריד אחד coverslips, אוויר יבש, לאחר מכן לאפות אותם בתנור. - לאחסן את coverslips מיובשים וניקו בטמפרטורת החדר במיכל פלסטיק סטיריליים עד השימוש.
-
המעיל על coverslips כדלקמן:
- מכינים ציפוי טריים הפתרון ב שפופרת צנטרפוגה.
- למקם את כל coverslip אחד טוב של צלחת 24-טוב (או 6-טוב). מקום 30 (או 100) µL של פתרון ציפוי coverslip (טבלה 1) עלו על 12 מ מ (או 25 מ מ) coverslip מערבולת. להוסיף 1 מ"ל תמיסת סטרילית באגירה פוספט (PBS, תרביות רקמה כיתה) הבאר. הצלחות האלה יכול להיות שימוש באופן מיידי או המאוחסנים ב 4 ° C ב- PBS סטרילי במשך שבוע.
- ביום של דיסקציה, הסר את PBS. מילה נהדרת ולמקם את הצלחות אור UV (30W) עבור 2-4 h.
הערה: השלב האחרון צריך להסתיים עם אור UV על בשכונה זרימה שכבתית התרבות תאים. הדלת של מכסה המנוע צריך יבוטל מעט כדי לאפשר זרימת אוויר לייבוש על coverslips.
2. ניתוח, דיסוציאציה והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מן העכבר בהריון/עכברוש
-
דיסקציה של דיסוציאציה של נוירונים בהיפוקמפוס לתרבות
- הפשרת פתרון אנזים פרוטאז (3 מ"ג/מ"ל פרוטאז 23 בעריסה. כשלקס, טבלה 1), לחמם ציפוי מדיה (טבלה 2) ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לנתח ההיפוקמפוס ולשטוף עם עריסה. כשלקס, לפי השיטות המתוארות הפרסום הקודם14.
הערה: ארבע hippocampi מספקים מספיק תאים 24-טוב או לוח 6-טוב אחד. - הסר עריסה. כשלקס, להוסיף 2 מ"ל של פתרון אנזים פרוטאז, דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 15 דקות.
- לשטוף את explants ההיפוקמפוס עם 5-10 מ של ציפוי בינוני פעמיים. הוסף 5 מ של ציפוי בינוני. מביצועם explants בהיפוקמפוס לתוך תאים בודדים על-ידי יצירת מערבולת קטנה באמצעות פיפטה עם טיפ פלסטיק 1-mL. פיפטה למעלה ולמטה בערך 40 פעם, הימנעות היווצרות בועות החמצן, עד הפתרון הופך מעוננים ולהישאר אין חתיכות גדולות של explant.
הערה: זכור להשאיר כמה כלי תקשורת במהלך שוטף, explants בהיפוקמפוס צריך להישאר המשוקע במדיום במהלך כל התהליך. - Centrifuge התאים-1,125 g x עבור 3 דק. הסר תגובת שיקוע עם תאי שקוע בתקשורת. Resuspend התאים מ"ל של ציפוי מדיה. להוסיף 1 mL/טוב של התליה תא צלחת 24-טוב (3 מ ל/טוב כדי צלחת 6-טוב).
הערה: מ"ל של ציפוי מדיה משמש לייצור השעיה תא בעל צפיפות נמוכה התא. אמצעי אחסון זה יאפשר את ציפוי של תאים שש צלחות 24-ובכן, שמונה. ובכן 6 צלחות או שילובים שונים של לוחות 24 או 6-ובכן בהתאם הניסויים להתנהל. כל טוב של צלחת 24-טוב יהיה בערך 3 x 10-4 -תאים-9. - דגירה התאים בתקשורת ציפוי ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 עבור 2-4 h, ולאחר מכן להסיר את כל המדיה ציפוי ולהחליף אותו עם תחזוקה טריים מדיה.
- לאחר יומיים (2 ימים במבחנה, 2DIV), להחליף חצי של התקשורת עם 2 מיקרומטר Ara-C (arabinosylcytosine) מומס מדיה תחזוקה אשר מעכב צמיחת fibroblasts, אנדותל ותאי גליה. לאחר חשיפת לתאים Ara-C במשך יומיים, להחליף את המדיה מדיה תחזוקה טריים.
-
תקנים עבור הפריט החזותי של מורפולוגיה תא
הערה: Transfect את התאים עם פלורסנט בונה חלבון פלואורסצנטי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), צהוב (YFP), mCherry, וכדומה , כדי להאיר את המורפולוגיה של נוירונים בודדים.- לדלל את המבנים של המניות (µg 1/µL) לתוך מערבולת Opti-מ מדיה (0.8 µg של הבונה ב- 50 µL של התקשורת Opti-מ). להכין 1 דילול לבנות עבור כל טוב.
הערה: צלחת 24-ובכן מחייבת 0.8 µg של הבונה בשנת 50 µL של Opti-מ מדיה. צלחת 6-טוב דורש µg 2.4 של הבונה בתקשורת Opti-מ 150 µL. - לדלל מגיב בתיווך ליפוזום תרביות תאים לתוך מערבולת מדיה Opti-מ (1.5 µL מהתרכובת תרביות תאים ב- 50 µL של התקשורת Opti-מ). להכין 1 דילול תרביות תאים עבור כל טוב.
הערה: צלחת 24-ובכן דורשת µL 1.5 של תרביות תאים ריאגנט ב- 50 µL של Opti-מ מדיה. צלחת 6-טוב דורש µL 4.5 של תרביות תאים ריאגנט ב 150 µL של Opti-מ מדיה. - להכין תערובת 1:1 (100 µL) של הבונה של ריאגנט מדיה, תרביות תאים Opti-מ מדיה Opti-מ ו מערבולת. דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
הערה: לכל טוב, צריך להיות כ- 100 µL של פתרון המכילים לבנות, תרביות תאים ריאגנט ומדיה Opti-מ אם באמצעות צלחת 24-טוב (300 µL לצלחת 6-טוב). - הסר חצי של אמצעי התקשורת (500 µL לצלחת 24-ובכן, mL 1.5 לצלחת. ובכן 6) מכל קידוח, העברת מדיה זו לתוך צינור נקי חרוט. לשמור על הצינורית הזאת בחממה. לאחר מכן להוסיף את התערובת 100 µL (שלב 2.2.3) התקשורת שנותרו בתוך הבאר. מאפשרים לתאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
- במהלך הדגירה (שלב 2.2.4), להוסיף אמצעי אחסון אחד של תחזוקה טריים מדיה לתקשורת בצינור חרוט (שלב 2.2.4). מניחים את התערובת בחממה באותו (37 ° C ו- 5% CO2).
- בעקבות הדגירה, להסיר את כל המדיה המכילה את הפתרון תרביות תאים מן הבארות ולהחליף אותו עם 1:1 תערובת של ישן, תחזוקה טריים מדיה בצינור חרוט (שלב 2.2.5).
הערה: בהתאם לגודל של המבנה, תאים עשויים להתחיל להביע בתוך 12 שעות; עבור מבנים גדולים יותר, 3-4 ימים עשוי להיות נחוץ לפני הביטוי שיא של המבנה הוא הגיע.
- לדלל את המבנים של המניות (µg 1/µL) לתוך מערבולת Opti-מ מדיה (0.8 µg של הבונה ב- 50 µL של התקשורת Opti-מ). להכין 1 דילול לבנות עבור כל טוב.
3. הגדרת המנגנון פיפטה והמתנשף
הערה: ישנם חמישה מרכיבים בסיסיים זה: פיפטה מזכוכית את הצנרת, המזרק, את micromanipulator, המאגר (של האנק). זה יכול לשמש כל מאגר בעל ריכוזי מלח פיזיולוגית הרלוונטיים.
- משוך על פיפטה בורוסיליקט שיש סביב 45-מיקרומטר-קוטר פתיחה עצה השימוש micropipette והגדוד המפרטים בטבלה3.
הערה: נמצא כי מיקרומטר 45 הוא בגודל מתאים עבור הקוטר של פיפטה פתיחת בתנאים ניסיוני. סטיות בגודל הפתיחה צריך באופן משמעותי משפיע על התוצאות. חשוב לשים לב כי עזיבה גדול יותר מהמספר הזה צריך עדיין לעבוד עבור דליות אינדוקציה על-ידי התאמת הגובה של המזרק מקושר פיפטה דרך צינורות, אך זה ידרוש למשובטים של הערך לחץ. - להוסיף בסוף לא משך פיפטה לתוך צינורות גומי דק.
הערה: הקיר אבובים צריך להיות דק ונוקשה כדי למזער את ההתנגדות נוזלים, המבטיח כי הגובה של המזרק הוא ביחס ישר הלחץ של הנוזל זורם דרך פיפטה בהתנגדות זניח. הצנרת צריכה להיות יותר מאשר כ- 0.6 מ' אורך בכדי למזער את ההתנגדות. - חבר את הקצה השני של הצנרת מזרק פלסטיק 10-mL מחבר עם שסתום תור-אייבל.
הערה: המזרק פלסטיק צריכה שיחבקו בגובה קבוע, מדידים כדי להבטיח מדד מדויק עבור הלחץ בדוי הנובעים פיפטה. לגובה של 190 מילימטר היה מנוצל, מאז זה מספק לחץ מינימלי אך אמין גורם varicosities של אקסונים. ערכי גובה אחרים עשוי לשמש גם אם הלחץ לגרום לתאים לנתק מפני השטח coverslip. מומלץ להשתמש באותה הגדרה לאורך כל הניסוי. - הכנס את פיפטה פסגת בורג micromanipulator כדי להחזיק את פיפטה במקום. בורג הבורג עקף מתכת, שטוח המצורפת את הזרוע micromanipulator כך מחזיקה בסוף לא משך פיפטה מעל איפה לאורך צינור גומי מצורפת. זווית פיפטה בזווית של 45 מעלות עם פני coverslips המכילות נוירון.
הערה: micromanipulator צריך להיות בנוי כך פיפטה יכולים להתקיים ללא זמן הווה לאורך צינור גומי. Micromanipulator לאפשר תנועה של פיפטה ב- x, y, ו- z כיוונים להציבו במדויק בתוך טווח של התאים. גרפיקה, כמו גם תמונה של המנגנון מוצג להלן (איור 1). - הפעלת מסנן קרינה פלואורסצנטית, לפתוח הצמצם ולהבטיח שמקום פלורסנט ניתן לראות עובר את המטרה. שימוש של micromanipulator, להעביר את פיפטה שהמיקום תתיישר את הטיפ עם המקום פלורסנט והורד על פיפטה סמיכה מעל הגובה של המנה התרבות התא (35 מ"מ x 10 מ"מ). ברגע זה בעמדה, להדליק את האור המשודר וכבה זריחה.
- באמצעות פינצטה, להוסיף coverslip אחד (עם התאים פונה כלפי מעלה לכיוון פיפטה) מהצלחת תרבות תא המנה התרבות התא המכיל כ 2 מ"ל של האנק מאגר בטמפרטורת החדר.
- המקום המנה תרבות המכיל את coverslip אל הטווח.
- באמצעות הידית להתמקד בסדר ויעד X 20, להתמקד על מטוס בערך 4 פניות מלאה מעל תאי (כ- 0.4 מ"מ). השתמש את micromanipulator כדי למקם את הטיפ פיפטה כך היא ממוקדת, במרכז, הצד השמאלי של המטוס כפי שהן נראות מבעד את העין החתיכות.
הערה: דנדריטים הם הקרנות שאמורים להיות באותה מסגרת בגוף התא שהם נובעים. כדי לגרום varicosities עצב, אחד צריך בצע תחזיות יותר מהגוף תא כדי אקסונים המדיאלי ו דיסטלי.
4. כיול לחץ פיפטה ניצול מערכת מתיחה-הממברנה
- הגדרת המנגנון פיפטה והמתנשף עם הפרמטרים זהה בדיוק כפי שתואר לעיל על מערכת בעלת קרום סיליקון microfabricated (500 מיקרומטר בקוטר), בעובי 50 מיקרומטר ולהתמקד המיקרוסקופ על גבי המשטח של הקרום.
הערה: מערכת זו תוכננה כדי למדוד ערכי הלחץ קטן, הסבר על המערכת שפורסם לפניעשר. מדידה זו רק שצריך לעשות פעם אחת עבור הנעוצה ניסויים אם אותה הגדרה מדויקת של נשיפת משמש. - מתמקדים המיקרוסקופ המערכים של כדורי מייקרודוט (4 מיקרומטר בקוטר) ו- 10 מיקרומטר בנפרד, כפי שנמדד בין מרכזי. להפוך את השסתום ולאפשר נוזל לזרום מתוך פיפטה. לבחון את הסטה של הקרום בתגובה לחץ הנוזלים עם מיקרוסקופ קונפוקלי.
- לנצל את מודל לינארי כדי לקבוע את הלחץ המתאים הקשורים עם הסטה של הקרום.
הערה: בזמן שנערך המחקר מצא כי אפשרות סטיה של w =-3.143 ± 0.69 µm היה מתקבל על 190 מילימטר מזרק הגובה, זה הפיק בלחץ של 0.25 nN/מיקרומטר ± 0.062 מהכיוונון הנוכחי פיפטה, אשר נמצא בטווח פיזיולוגיים ופתולוגיים, אבל מזרק גובה הוא לא ה דטרמיננטה הבלעדית. גורמים אחרים משפיעים על הערך המדויק לחץ על הנוירונים, כולל פיפטה פתיחה, מיצוב (המרחק והזווית) של קצה פיפטה יחסית לתאים, אפילו את הגמישות של אבובים4,10.
5. הנעוצה לזירוז Varicosities
- ברגע פיפטה בעמדה, מתמקדים מטוס המכיל אזור עניין המיקרוסקופ. מקם את התאים ואת התהליכים במחצית השמאלית של השדה הדמיה (ראה על ידי לכידת חיות של המצלמה) בתוך האזור והמתנשף, בעוד הימני נמצא מחוץ הנעוצה באזור.
הערה: בשל נרחב המוצלח אקסונים דנדריטים של נוירונים, סביר כי כל התהליכים של נוירון נמצאים באותו אזור והמתנשף. זהו למעשה אחד היתרונות של שיטה זו, אשר מאפשרת הבחינה של השפעת המקומי הנעוצה. ישנם שני סוגים של מחשבים, זה יכול להיות מנוצל כדי לגרום varicosities: משך זמן הנעוצה ומתנשף דופק. -
נשיפת
- משך זמן הנעוצה
- מקם את המזרק בשיאה, 190 מ מ מעל coverslip המכיל נוירונים בתרבית4. להתחיל הדמיה בצילום מואץ של תחום העניין זמן החשיפה ממוטבת חשיפת מורפולוגיה ברור עצביים. לכידת מסגרות לפחות 15 במרווח s 2 (s 30 סה כ) כקו הבסיס. מרווח הזמן ניתן להתאים בהתבסס על הניסוי. -מסגרת 16, לפתוח את השסתום תור-אייבל של המזרק ולאפשר נוזל לזרום למסגרות 75 (150 s). -מסגרת 75, לבטל את השסתום כך נוזל לזרום תחנות. לעצור את לכידת וידאו.
הערה: זה צריך לגרום varicosities עצב בנוירונים 7-9 DIV בתוך 5-10 s, ואילו נוירונים בוגרים להימשך זמן רב יותר varicosities טופס.
- מקם את המזרק בשיאה, 190 מ מ מעל coverslip המכיל נוירונים בתרבית4. להתחיל הדמיה בצילום מואץ של תחום העניין זמן החשיפה ממוטבת חשיפת מורפולוגיה ברור עצביים. לכידת מסגרות לפחות 15 במרווח s 2 (s 30 סה כ) כקו הבסיס. מרווח הזמן ניתן להתאים בהתבסס על הניסוי. -מסגרת 16, לפתוח את השסתום תור-אייבל של המזרק ולאפשר נוזל לזרום למסגרות 75 (150 s). -מסגרת 75, לבטל את השסתום כך נוזל לזרום תחנות. לעצור את לכידת וידאו.
- הדופק (משך s 2) נשיפת
- מקם את המזרק הגובה המתאים (190 מ מ). להתחיל הדמיה בצילום מואץ וללכוד מסגרות לפחות 15 (30 s) במרווח s 2. -מסגרת 16, פתח את השסתום של המזרק לאפשר נוזל לזרום, ולאחר מכן סגור את השסתום לאחר 2 s חכי 5-20 ס' (תלוי בתדירות להיבדק) לפני פתיחת המסתם שוב. חזור על פתיחה וסגירה של השסתום כדי ליצור פולסים נוזלים, ולהמשיך לתקופה כוללת של 150-300 ס המשך זמן לשגות הדמיה במשך 20 דקות כדי ללכוד את הבמה השחזור.
הערה: כאשר המרווח הוא יותר מ 10 s, הפולסים זירוז באופן דרסטי פחות varicosities. במרווח s 20, varicosities לא יכולה להיגרם על ידי פולסים4. כדי להשיג היווצרות דליות אמין, עקבית, מומלץ הגובה מזרק צריך להיות בסביבות 190 מ מ. גובה מזרק ואת לחץ הנוזלים לא צריך לגדול עד לנקודה שבה תאים להתחיל ניתוק מפני השטח coverslip.
- מקם את המזרק הגובה המתאים (190 מ מ). להתחיל הדמיה בצילום מואץ וללכוד מסגרות לפחות 15 (30 s) במרווח s 2. -מסגרת 16, פתח את השסתום של המזרק לאפשר נוזל לזרום, ולאחר מכן סגור את השסתום לאחר 2 s חכי 5-20 ס' (תלוי בתדירות להיבדק) לפני פתיחת המסתם שוב. חזור על פתיחה וסגירה של השסתום כדי ליצור פולסים נוזלים, ולהמשיך לתקופה כוללת של 150-300 ס המשך זמן לשגות הדמיה במשך 20 דקות כדי ללכוד את הבמה השחזור.
- לפני יום של שימוש, לנקות את הסידור (פיפטה, אבובים ו מזרק) מאת זורם על 10 מ ל-70% אתנול דרך הסידור. בעקבות האתנול לשטוף, זורמת 10 מ"ל של המאגר של האנק (או מאגר הרצוי) דרך הסידור לשפר את המערכת לשימוש של אותו יום. לאחר ניסויים גימור ליום, לנקות את הסידור כמו שתואר קודם לכן עם אתנול כדי למנוע צמיחה של מזהמים בן לילה.
- משך זמן הנעוצה
6. לחלק מחמאות שיטות
הערה: וזמינותו והמתנשף יכול להיות משולב עם מגוון רחב של טכניקות שונות הנזכרים בסעיף מבוא. כאן הדגש הוא על טכניקות הליבה בהם נעשה שימוש בתדירות הגבוהה ביותר יחד עם וזמינותו והמתנשף, לרבות קרינה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה timelapse הדמיה, הדמיית סידן מבחני שחזור. אלו נדונים להלן.
-
לנהל דימות ברזולוציה פלורסנט בצילום מואץ על ידי ביצוע להלן פרוטוקול
- מעקב אחר תנועת מתויג fluorescently חלבונים בתוך הנוירונים עם 100 X עדשה שמן. הנוירונים הם transfected עם הבונה cDNA נאותה. לכידת למסגרות 150 (סה כ 300 s) עם מרווח s 2.
הערה: לפעמים, הדמיה זמן לשגות מרובים-צבע מתבצע כדי התמונה התנועה של חלבון מתויג fluorescently אחד או יותר בו זמנית. - מפיקים של kymograph או דרך הווידאו לכידת תוכנה או דרך ImageJ (NIH).
הערה: המהירות ואת כיוון הנסיעה ניתן לקבוע באמצעות את kymograph. * כמובן לציין את הכיוון סומא שקרים מאזור להילכד. הנסיעה לכיוון סומא היא רטרוגרדית, אמנם לנסוע הרחק סומא קצה עצב anterograde. - חזור על תהליך זה בעקבות והמתנשף, או kymograph יכולים להיווצר באמצעות לכידת התמונה במהלך והמתנשף וזמינותו.
הערה: ההשפעות של שש־בש תחבורה עצב של המיטוכונדריה, חלבונים סינפטיים הוצגו ב- נייר האחרונים4.
- מעקב אחר תנועת מתויג fluorescently חלבונים בתוך הנוירונים עם 100 X עדשה שמן. הנוירונים הם transfected עם הבונה cDNA נאותה. לכידת למסגרות 150 (סה כ 300 s) עם מרווח s 2.
-
הדמיית סידן
- להוסיף 1 µL (עבור צלחת 24-טוב) או µL 3 (עבור צלחת 6-טוב) של 5 מ מ Fluo-4 בבוקר עד תרבות תקשורת אחד טוב, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- לשטוף את התאים פעמיים עם המאגר של 1 מ"ל האנק.
הערה: נוירונים טעון פולטים קרינה פלואורסצנטית ירוק דרך מערכת סינון FITC. לוקוסים מציינות אזורים של סידן ניכר בתוך התא. בשילוב עם מחשבים, ניתן לראות עלייה בעוצמת (עליית רמת הסידן פנימי).
-
שחזור דליות
הערה: מייד לאחר ניסוי והמתנשף, ניסוי שחזור 20 דקות יכול להתבצע.- לכידת תמונות עבור מסגרות 300 (1,200 s) עם מרווח s 4.
הערה: תא transfected עם מסיסים YFP/mCherry/GFP צריך להראות רמה מתונה (פחות מ 50%) של שחזור עד סוף המושב הדמיה. שחזור עצב תלויה במספר גורמים, כגון שלב התפתחותי של נוירונים בתרבית4. זה יכול גם להיות משולב עם פלורסנט דימות ברזולוציה והדמיה סידן שתוארו לעיל.
- לכידת תמונות עבור מסגרות 300 (1,200 s) עם מרווח s 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני שש־בש, אקסונים בד כ מראה קטנה היווצרות דליות. נשיפת הבאים עם שלנו רגיל לחץ (גובה2O mmH 190), ההתחלה אקסונים לפתח רבים varicosities, כמו חרוז. היווצרות של varicosities הוא הפיך באופן חלקי, כפי שמוצג על ידי מחוזות הדנדריטי לאקסון חוזרים למצבם טרום פצפוצי בעקבות תקופת התאוששות 10 דקות (איור 2א-ב). לאחר תקופה ארוכה של השחזור (> 20 דקות), אקסונים קצת להתאושש לחלוטין. מיקום שיוצרת פיפטה והמתנשף וכן מיקום מדויק המזרק-190 מ מ מעל הבמה אולי אפשרות לייצר varicosities במהירות. תנאים אופטימליים צריך לגרום דליות-צורה האקסונים של נוירונים צעירה (בערך 7 DIV) s 54.
איור 1 : מפרטים טכניים, תצלום של נשיפת המנגנון. (א) צילומים מראה הכוללת הגדרת מיקרוסקופ. (B) נשיפת המנגנון מציג את פיפטה מזכוכית בידי micromanipulator ומחובר לאורך צינור גומי. (ג) שלב חדות תמונות עם המוקד במישור של נוירונים בהיפוקמפוס הראשי מציג צל של פיפטה התחתון הנכון. (ד) מתוך תא המטוס התמקד הנעוצה פיפטה עצה. תיאור סכמטי של מרחקים ומתחים מחושב עבור גרימת varicosities (E). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : להחליפן בתמונות של היווצרות דליות בעקבות שש־בש. (א) הדמיה של 7DIV, GFP transfected העכבר נוירונים בהיפוקמפוס מציג את האקסון של טרום ומתנשף פוסט-כמו גם לאחר תקופה של התאוששות 10 דקות. Kymograph (B) של הדמיה בצילום מואץ של נוירון (A). חצים אדומים מציינים varicosities זה נוצר בעקבות 150 s של 1902O הנעוצה mmH (החל בגיל 30 s). סרגל קנה מידה = 15 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פתרון ציפוי Coverslip | |
| 780 ΜL | Acid17 אצטית מ מ מניות: חומצה אצטית µL 50 50 מ של H2O |
| 200 ΜL | פולי-D-ליזין (מניות 0.5 מ"ג/מ"ל) |
| 20 ΜL | עכבר זנב קולגן (מניות 3 מ"ג/מ"ל) |
| הנפח הכולל נקבעת בהתבסס על מספר coverslips המיועד. | |
טבלה 1: פתרון ציפוי Coverslip. מספק את המתכון להכנת הפתרון ציפוי coverslip נהגו לדבוק תאים בתרבית coverslips.
| 1 x פרוסה לנתיחה הפתרון (עריסה. כשלקס), מסוננים, pH = 7.4, חנות ב 4 ° C | |
| 1 ליטר | ddH2O |
| 82 מ מ | נה2אז4 |
| 30 מ מ | K2אז4 |
| 10 מ מ | HEPES (חומצה חינם) |
| 10 מ מ | D-גלוקוז |
| 5 מ מ | MgCl2 |
| 0.00% | פנול אדום (אופציונלי) |
| ציפוי מדיה (PM, לסנן, לאחסן ב 4 ° C) | |
| 439 mL | המלחים של גברת ארל |
| 50 מ | FBS |
| 11.25 מ | 20% D-גלוקוז |
| 5 מ | נתרן פירובט (100 מ מ) |
| 62.5 ΜL | -גלוטמין (200 מ מ) |
| 5 מ | פניצילין/סטרפטומיצין (P/S, 100 x) |
| תחזוקה מדיה (ממ, לסנן, לאחסן ב 4 ° C) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 מ | תוספת 50 x B27 |
| 1.25 mL | -גלוטמין (200 מ מ) |
| 5 מ | 100 x P/S |
| כל הפתרונות סטריליים באמצעות מסנן עם גודל הנקבוביות 0.2 מ מ. | |
בטבלה 2: תא תרבות המדיה מתכונים. מספק את המתכונים להכנת מדיה מנוצל culturing תאי נוירון בהיפוקמפוס העיקרי.
| המאגר של האנק (מסנן, pH = 7.4, חנות 4° C | |
| 150 מ מ | NaCl |
| 4 מ מ | אשלגן כלורי |
| 1.2 מ מ | MgCl2 |
| 1 מ מ | CaCl2 |
| 10 מ"ג/מ"ל | D-גלוקוז |
| 20 מ מ | HEPES |
טבלה 3: מתכון מאגר של האנק. מספק את המתכון להכנת מאגר מנוצל בפרוטוקול והמתנשף ובמהלך הדמיה לחיות תאים.
| פיפטה משיכת פרמטרים | |||||
| חום | משוך | מהירות | עיכוב | לחץ | הרמפה |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
בטבלה 4: פיפטה משיכת פרמטרים. מספק את הפרמטרים כדי להגדיר את פולר פיפטה כדי להשיג משרה זה בסביבות 45 מיקרומטר בקוטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הנוהל של assay microbiomechanical הזה הוא ישר קדימה. זה יפיק תוצאות אמינות, אם כל השלבים שלה מתבצעות בזהירות. ישנם מספר שלבים מרכזיים שישבשו, אם מבוצעת באופן לא תקין, איסוף נתונים מוצלחת. השלבים הקריטיים להתחיל במעלה הזרם של היישום בפועל של הגירוי והמתנשף. ניתוח זהיר culturing, טיפול של התרבות נוירון ראשי הינם בעדיפות עליונה. אם הנוירונים בתרבית אינם בריאים, הם שלא יגיב באופן עקבי, מאז הם אולי כבר כבר כבר זיהמו למתח. במורד הזרם של התרבות, הגדרת הראשונית כיול של המנגנון והמתנשף לספק לחץ עקבי, יניעו varicosities אבל לא יגרום לניתוק של התאים מפני השטח coverslip, חייב להתבצע עם סבלנות. כיול מדויק של הגדרת עשויה להימשך h 1 עקב סתימת פיפטה, אבובים או בעיות במסתם. זה חיוני כדי להבטיח כי נוזל יאזלו פיפטה התנגדות מינימלית לפני לנוע קדימה עם הצבת התאים בצלחת והמיקום בקצה פיפטה. עד כמה שינויים שיבנו ידיעתם, אחד ניתן לשייך את המנגנון והמתנשף עם זלוף, תיקון מחבר חובק למעקה של כל אחרים מבוססי מיקרוסקופ כלי, תלויה בעיקר המרחב הפיזי חינם בצדדים של המיקרוסקופ.
מערכת זו יש שתי מגבלות מהותי שדורשים תשומת לב. הסידור בעקביות יכול ליזום היווצרות של varicosities הפיך של האקסונים של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית דרך נוזל והמתנשף לתאים. עם זאת, חשוב לציין כי הערכים המדויק לחץ על העצב בתוך אותו שדה והמתנשף אינם זהים. לחץ הנוזלים משפיעה על התאים, מחושב בהתבסס על מדידת עומס לחץ מ4,10ממברנה סיליקון microfabricated, מייצג את הלחץ הממוצע במרכז השדה והמתנשף. לפיכך, הלחץ והמתנשף המדויק הוא הגבוה במרכז השדה והמתנשף ואת הנמוך ביותר סביב קצה השדה. הראינו כי הלחץ כוח בקורלציה עם תחילתה, הגודל, ואת המספר של varicosities המושרה4. לחץ גבוה כתוצאה תחילת מהר יותר, גדול יותר, ו- varicosities שופע יותר4. במחקרים האחרונים שלנו, השתמשנו לחץ מינימלי (190 מ מ כספית, בקצה פיפטה והמתנשף) זה עדיין אמין יכול לגרום varicosities אקסונים רוב4. תחת תנאי זה, דליות התחלתה של נוירונים צעיר הוא בדרך כלל על 5 s. חשוב לציין כי עם בדיוק אותו הנעוצה מערכת, הערך של פעם התפרצות יכול להשתנות, אשר לא רק תלוי בסוג עצביים, גיל, תא subcellular, אבל גם יכול להיות מושפע על-ידי העמדה של הנוירון בשטח והמתנשף. למרות וריאציית בלחץ והמתנשף שהתקבלו על-ידי נוירונים, המערכת assay עדיין מספק אמצעים אמינים לימוד ההשפעות מכני על נוירונים במרכז, מניב תוצאות ניסויית מאוד עקבית, לשחזור.
המגבלה השנייה של המערכת היא בעיה clogging שלה. כדי להשיג לחץ רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, הפתח של מדי סוכר הוא קטן, סביב 45 μm. אולם, הפתח קטן נוטה לסתום עם פסולת לאורך צינור פלסטיק, ניתן לראות בבירור הלכלוך בקצה פיפטה מתחת למיקרוסקופ. פעולה זו מגדילה את כמות הזמן מכינים את הסידור, במקרה של להדביק פיפטה. לכן, כל הפתרונות מסוננים היטב לפני שהומת לתוך המזרק, אבובים, פיפטה. זה גם חשוב לשטוף את המערכת והמתנשף עם 70% אתנול-ההתחלה והסוף של היום, ואחריה כביסה עם המאגר של האנק מסוננים. כדי לפתור את בעיית clogging פוטנציאליים, אנו מציעים מנסה למשוך פיפטות מרובים. זה חיוני כדי לוודא כי הפתרון הוא למעשה נשענתי מחוץ פיפטה באמצעות הדמיה לפני תחילת הניסויים. לאחר מערכת והמתנשף טובה הוא הוקם, זה בדרך כלל יכול להימשך עד סוף היום.
זה וזמינותו ביו-מכני, בשילוב עם נוירון תרבות, מציג הזדמנות ייחודית ללמוד נוירון המרכזית mechanosensation מחקה בתנאים פיזיולוגיים ו/או הקשורים pathophysiological. מערכת זו מאפשרת לנו לבחון את ההשפעה של דחיסה, הטיה על הנוירונים. לעומת זאת, מערכות אחרות שימשו כדי לבחון בתוך מטוס-6,5,-מתיחה-7. הלחץ הממוצע שקיבל את הנוירונים במרכז האזורים והמתנשף הוא 0.25 ± 0.06 nN/מיקרומטר2 המערכת שלנו4. זה הלחץ המופעל על תאים הוא להשוות הנפח של נוירונים בהיפוקמפוס, כפי שנמדד בעבר ניצול סריקה כוח מיקרוסקופ, בצובר rheology, לזהות דפורמציה שטיחות המושרה13,14, וכן לחצים המשמשת לשינוי הצמיחה של neurite הקצוות המובילים במבחנה, נמדד על-ידי סריקת כוח מיקרוסקופ (0.27 ± 0.04 nN/מיקרומטר2)16. הלחץ הזה אינו עולה על הלחץ זה יכול להיווצר באופן טבעי על ידי תאים mesenchymal העובר E11, כפי שהיא נמדדת באמצעות שמן בגודל תא פלורסנט מכנית ספציפי microdroplets (1.6 ± 0.8 nN/מיקרומטר)2,14.
מערכת זו כבר שימש בהצלחה בשילוב עם סידן הדמיה, תיקון מחבר חובק למעקה, מיקרוסקופ אלקטרוני, וניתוח הסלולר מודל4העכבר mTBI הגולגולת סגורות. וזמינותו יכול לשמש גם בשילוב עם מיקרוסקופ מבוסס ניסויים, כגון קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP), כדי לבדוק חלבון להפוך מעל בתוך varicosities, כמו גם דאגה ללמוד אם שונו אינטראקציות חלבון-חלבון במהלך היווצרות דליות. בעיקרו של דבר, כל שיטה שניתן לעשות באמצעות מיקרוסקופ תא חי הדמיה הגדרת ניתן לזווג עם assay והמתנשף הזה. צדדיות של assay הזה הוא חשוב מאוד ללמוד את המנגנונים המולקולריים שבבסיס אפקטים שונים על מורפולוגיה עצביים ופונקציות על ידי מתח micromechanical.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
כל הניסויים נערכו בהתאם נבחרת מוסדות של בריאות בעלי חיים שימוש לקווים המנחים. עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מענקים של מכוני הבריאות הלאומיים (R01NS093073 ו- R21AA024873) ג. ג. א.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
- Nikić, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat. Med. 17, 495-499 (2011).
- Yang, J., et al. Regulation of axon degeneration after injury and in development by the endogenous calpain inhibitor calpastatin. Neuron. 80 (5), 1175-1189 (2013).
- Debanne, D.
- Gu, Y., Jukkola, P., Wang, Q., Esparza, T., Zhao, Y., Brody, D., Gu, C. Polarity of varicosity initiation in central neuron mechanosensation. J Cell Biol. 216 (7), 2179-2199 (2017).
- Chung, R. S., et al. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy. J. Neurotrauma. 22 (10), 1081-1091 (2005).
- Staal, J. A., Dickson, T. C., Chung, R. S., Vickers, J. C. Cyclosporin-A treatment attenuates delayed cytoskeletal alterations and secondary axotomy following mild axonal stretch injury. Dev. Neurobiol. 67 (14), 1831-1842 (2007).
- Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Exp. Neurol. 233 (1), 364-372 (2012).
- Donkin, J. J., Vink, R. Mechanisms of cerebral edema in traumatic brain injury: therapeutic developments. Curr Opin Neurol. 23 (3), 293-299 (2010).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nat Protoc. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Wang, Q., Zhang, X., Zhao, Y. Micromechanical stimulator for localized cell loading: fabrication and strain analysis. J. Micromech. Microeng. 23, 015002 (2013).
- Lu, Y. B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (47), 17759-17764 (2006).
- Elkin, B. S., Azeloglu, E. U., Costa, K. D., Morrison, B. Mechanical heterogeneity of the rat hippocampus measured by atomic force microscope indentation. J. Neurotrauma. 24 (5), 812-822 (2007).
- Franze, K., et al. Neurite branch retraction is caused by a threshold-dependent mechanical impact. Biophys. J. 97 (7), 1883-1890 (2009).
- Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11 (2), 183-189 (2014).
