Summary
이 프로토콜 varicosities 뉴런에서의 빠르고 가역 유도 순수 관련, 압력 액체 접근 방식을 설명합니다.
Abstract
Axonal varicosities는이 성분의 높은 학위를 가진 축 삭의 샤프트 따라 확대 구조. 그들은 신경 퇴행 성 질병 또는 부상, 두뇌에 뿐만 아니라 정상적인 두뇌에서 존재 한다입니다. 여기, 빠르게, 안정적으로, 그리고 역 유도 axonal varicosities 새로 설립 micromechanical 시스템 varicosity 형성 및 이종 단백질 구성에 적용 하는 메커니즘을 이해 하 고 우리 수 있도록 설명 합니다. 이 시스템은 스트레칭의 효과에 주로 집중 하는 다른 체 외에 시스템에서 다른 뉴런의 다른 subcellular 구획에 압축 및 전단 스트레스의 효과 평가 하는 새로운 수단을 나타냅니다. 중요 한 것은, 우리의 시스템의 고유한 기능 때문에 우리는 최근 그 가압 유체 응용 프로그램 수 있습니다 신속 하 고 역 유도 axonal varicosities 일시적인 수용 체 잠재력 채널의 활성화를 통해 보여주는 새로운 발견을 했다. 우리의 biomechanical 시스템 마약 관류, 라이브 세포 이미징, 칼슘 이미징 및 패치 클램프 기록 함께 편리 하 게 이용하실 수 있습니다. 따라서,이 방법은 공부 mechanosensitive 이온 채널, axonal 수송, axonal 골격 역학, 칼슘 신호, 규정과 형태학 변화와 관련 된 외상 성 뇌 손상에 대 한 채택 될 수 있다.
Introduction
Varicosity 형성, 또는 붓기/구슬, 축 삭을 따라 neurodegeneration 많은 장애 또는 다 발성 경화 증, 알츠하이머병, 파 킨 슨 병를 포함 하 여 중앙 신경의 상해에서 관찰의 눈에 띄는 기능입니다 그리고 충격 뇌 부상1,2. 활동 전위 전파와 시 냅 스 전송3axonal varicosities의 중요 한 생리 적 영향에도 불구 하 고는 varicosities는 생성 하는 방법을 알 수 없는 남아 있습니다. 최근, 설치류에서 교양된 hippocampal 신경에 새로 설립 된 microbiomechanical 분석 결과 사용 하 여, 우리 기계적 자극에 매우 흥미로운 기능으로 이러한 뉴런 varicosities 일으킬 수 발견. 첫째, varicosity 유도 급속 하다 (< 10 s) 고이 프로세스는 예기치 않게 뒤집을 수. 둘째, varicosity 개시 압력 피 강도 따라 달라 집니다: 높은 압력, 빨리 개시. 셋째, varicosity 개시 신경 연령에 따라 달라 집니다. 젊은 신경의 축 삭 이전 뉴런의 그에 비해 기계적 스트레스에 더 반응이 나타납니다. 넷째, dendrites 이러한 뉴런의 초기 축 삭 세그먼트 동안 hippocampal 신경의 축 삭을 따라 varicosities 폼 같은 puffing 조건 변경을 표시 합니다. 따라서, 우리의 연구는 신경 극성의 새로운 기능을 공개 했다. 생체 외에서 시스템으로 이러한 결과 생리 적으로 관련. 우리 axonal varicosities 가까이 두개골 영향, 우리의 생체 외에서 일치 직후 쥐의 somatosensory 피 질에서 다중 초점 방식에서 개발 했다 온화한 외상 성 뇌 손상 (mTBI)에 대 한 vivo에서 모델을 사용 하 여, 결과4. 그것은 중요 한 우리의 얼룩 및 이미징 mTBI 쥐의 신경 형태학 변화의 스냅 샷 제공, vivo에서 수행 이후 기계적 영향 동안 신경 형태학의 시간 경과 이미징이 가능 하지.
이 액체 피 시스템 수 있었습니다 관련 기계적 스트레스 유발 varicosity 형성 된 독특한 기능을 잡으려고 뿐만 아니라 기본 메커니즘을 확인 하. 테스트 함으로써 다른 세포 외 솔루션, 차단제와 mechanosensitive 이온 채널, 세포 생리학의 다른 후보자의 오프너, 우리는 일시적인 수용 체 잠재력 양이온 채널 인도의 V 회원 4 (TRPV4) 확인 채널을 캘리포니아2 + 그리고 Na+ 에 침투성 피 활성화는 주로 axonal varicosity 형성4초기 기계적 스트레스를 감지 합니다. 이 추가 siRNA 녹아웃 방식으로 확인 되었다. 함께,이 새로운 분석 결과 시스템 hippocampal 신경 문화 개발 했습니다 찍은, 다른 기술을 조합에 특히 중앙 신경의 micromechanical 속성을 공부에 대 한 매우 귀중 한입니다.
우리는 설립이 micromechanical 시스템와 독특한 몇 가지 주요 측면에서 이전 기존 시스템에서 다릅니다. 첫째,이 시스템에는 신경 압축 및 전단의 형태로 비행기 밖으로 기계적 스트레스 경험. 기계적 충격, 동안 신경 프로세스 coverslip 표면에 부착 된 유지 하 고 이동 하지 않습니다. 이 다른 실험 주로 절곡 하 고 비행기에서 스트레칭 관련 시스템 (또는 긴장)와 다른, 예를 들어, 번들된 axons의 편향 같은 문자열5,6 이동 또는 micropatterned에 성장 축 삭 기지개 채널 고 stretchable 막7,8. 또한, 비록 axonal varicosities 또한에서 유도 될 수 있다 액체 피 시스템 이러한 설정 과정에서에서 같은이 분석 실험 (몇 시간6,,7810 분)에서 훨씬 더 많은 시간이 나타나고 돌이킬 수 없는. 마지막으로, 우리의 시스템 로컬 유체 피를 사용 하 여 수 varicosity 형성의 공간 기능 시험 (예., 모 수석, 모 수석 등뼈, 소마, axonal 초기 세그먼트, axonal 터미널), 그것의 일시적인 기능 외. 이 시스템을 사용 하 여, 우리는 여러 예상치 못한 독특한 기능과를 axonal varicosity 형성, 특히 급속 한 발병, 느린 가역 및 축 삭 모 수석 극성을 발견 했다.
우리가이 문서에서 설명 하는 시스템은 분자의 많은 기술과 호환 되 고 세포 생물학. 예를 들어, 신경 형태와 기능에 기계적 스트레스의 효과 연구, 그것은 함께 사용할 수 있습니다 myelin coculture, 형광 공명 에너지 전달 (무서 워) 및 총 내부 반사 형광 (TIRF), 이미징 시간 경과 칼슘 이미징, 그리고 패치 클램프 기록입니다. 이 문서에서 우리는 시스템의 핵심 구성 요소에 초점. Hippocampal 신경 문화, 액체 피 설정, axonal 전송에 대 한 고해상도 시간 경과 영상 및 칼슘 이미징 아래 단계별 설명 됩니다.
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Protocol
아래에서 설명 하는 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 오하이오 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. Coverslip 준비
- 70% 질소 산을 포함 하는 유리 비 커에 12 m m 또는 25 mm coverslips의 하나 이상의 상자를 놓고 하룻밤 실 온에서 coverslips를 품 어.
참고: 12 m m coverslips로 같은 비 커에 25 mm coverslips 씻지 않는. 별도로 그들을 세척 하는 것이 낫다. - 가득한 ddH2O의 2.5 L 4 L 비 커에 모든 coverslips를 전송 하 고 100 rpm에서 1 h에 대 한 coverslips를 포함 하는 비이 커를 흔들어. 고무 밴드를 사용 하 여 비 커를 동요 하는 동안. 4 번 신선한 2.5 L ddH2O와 린스를 반복 합니다.
- 금속 커버와 함께 건조 플라스 크를 청소 coverslips를 전송 합니다. Coverslips 6 h 225 ° C에서 오븐에 구워 고 실내 온도에 냉각 하도록 허용.
참고: 25 mm coverslip 끊기에 수 그린 이다. Coverslips 하나 하나를 분리 하 고, 건조 한 공기 다음 오븐에 구워. - 사용법까지 멸 균된 플라스틱 컨테이너에 실 온에서 건조 및 청소 coverslips를 저장 합니다.
-
코트는 coverslips 다음과 같습니다.
- 원심 분리기 튜브에서 신선한 코팅 솔루션을 준비 합니다.
- 24-잘 (또는 6 잘) 접시의 한 잘에 각 coverslip을 넣으십시오. 12 m m (또는 25 mm) coverslip 소용돌이에 coverslip 코팅 솔루션 (표 1)의 30 (또는 100) µ L를 놓습니다. 우물에 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, 조직 문화 등급)의 1 mL를 추가 합니다. 이 판 수 중 즉시 사용 또는 주일에 대 한 살 균 PBS에 4 ° C에 저장 될.
- 해 부의 날, PBS를 제거 합니다. 건조 하 고 자외선 (30W) 2-4 h 아래 접시를 놓습니다.
참고: 마지막 단계 세포 문화 층 류 두건에 UV 빛과 완료 되어야 한다. 후드의 문은 coverslips를 건조 공기 흐름을 허용 하도록 약간 해제 해야 합니다.
2. 해 부, 분리, 및 임신 마우스/쥐에서 Hippocampal 신경의 문화
-
해 부와 문화에 대 한 hippocampal 신경의 분리
- Protease 효소 솔루션 (3 mg/mL protease 23 된, 표 1에서) 해 동 및 중 도금을 따뜻한 미디어 (표 2) 37 ° c.
- 해 부 해 마 그리고 이전 게시14에서 설명 하는 방법에 따라 된, 린스.
참고: 4 개의 된 한 24-잘 또는 한 6 잘 플레이트에 대 한 충분 한 세포를 제공합니다. - 제거 된 프로 테아 제 효소 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2 15 분 샘플을 품 어.
- 해 마 explants 도금 매체의 5-10 mL와 함께 두 번 세척. 중 도금의 5 mL를 추가 합니다. 1 mL 플라스틱 팁을 피 펫을 사용 하 여 작은 소용돌이 생성 하 여 단일 세포로 hippocampal explants 해리. 플라스틱 아래로 약 40 배, 유지 산소 거품, 솔루션은 흐린 됩니다 때까지 explant의 더 큰 조각을의 형성을 방지.
참고: 세척 하는 동안 몇 가지 미디어를 떠나 기억, hippocampal explants 전체 과정에서 매체에 잠긴 남아 있어야 한다. - 1125 x g 3 분 제거 셀으로 상쾌한 미디어에 빠져들에 대 한에 셀 원심 미디어를 도금의 145 ml 셀 resuspend 셀 서 스 펜 션의 1 mL/잘 24-잘 접시 (3 mL/잘 6 잘 플레이트)를 추가 합니다.
참고: 미디어를 도금의 145 mL 낮은 세포 밀도 세포 현 탁 액을 생산 하기 위해 사용 됩니다. 이 볼륨에는 6 24-잘 접시, 8 6-잘 접시, 또는 실험 실시에 따라 24-또는 6-잘 접시의 다양 한 조합으로 셀의 도금 수 있게 됩니다. 24-잘 접시의 각 잘 약 3 x 104 의 세포9있을 것 이다. - 37 ° C, 5% CO2 2-4 h에서 도금 미디어에 셀을 품 어 다음 모든 도금 미디어를 제거 하 고 신선한 유지 보수 미디어 바꿉니다.
- 2 일 후 ( 체 외에서2 일, 2DIV), 대체 미디어의 절반 2 µ M 섬유 아 세포, 내 피, 그리고 glial 세포의 성장을 억제 유지 미디어에 녹아 있는 아 라-C (arabinosylcytosine). 이틀 동안 아 라-c 셀을 노출 후 미디어를 신선한 유지 보수 미디어 바꿉니다.
-
Transfection 세포 형태학의 시각화를 위한
참고: Transfect 녹색 형광 단백질 (GFP), 노란 형광 성 단백질 (YFP), mCherry, 개별 뉴런의 형태를 밝히는 등 의 형광 구문으로 셀.- Opti 메모리 미디어 (Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 구조물의 0.8 µ g)와 소용돌이로 재고 (1 µ g / µ L)에서 구조를 희석. 각 잘 1 구문 희석을 준비 합니다.
참고: 24-잘 접시 Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 구문의 0.8 µ g을 필요합니다. 6 잘 플레이트 구문 150 µ L Opti 메모리 미디어에서 2.4 µ g이 필요합니다. - Opti 메모리 미디어 (Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 transfection 시 약의 1.5 µ L)와 소용돌이 transfection liposome 중재 시 약 희석. 각 잘 1 transfection 희석을 준비 합니다.
참고: 24-잘 접시 Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 transfection 시 약의 1.5 µ L를 필요합니다. 6 잘 플레이트 4.5 µ L을 Opti 메모리 미디어의 150 µ L에서 transfection 시 약의 필요합니다. - Opti 메모리 미디어와 소용돌이 Opti 메모리 미디어와 transfection 시 약에 구성의 1:1 혼합물 (100 µ L)를 준비 합니다. 20 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어.
참고: 잘, 당 이어야 한다 약 100 µ L 24-잘 접시 (6-잘 접시 300 µ L)을 사용 하는 경우 구문, transfection 시 약 및 Opti 메모리 미디어를 포함 하는 솔루션의. - 각 우물에서 미디어 (24-잘 접시, 6 잘 플레이트 1.5 mL 500 µ L)의 절반을 제거 하 고 깨끗 한 원뿔 관으로이 매체를 전송. 인큐베이터에이 튜브를 유지. 다음 우물에 있는 나머지 미디어를 100 µ L 혼합물 (2.2.3 단계)를 추가 합니다. 20-30 분 동안 37 ° C에서 품 어를 셀 수 있습니다.
- 인큐베이션 (2.2.4 단계) 동안 신선한 유지 보수 미디어의 볼륨 원뿔 튜브 (단계 2.2.4)에 미디어를 추가 합니다. 같은 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2)에 있는 혼합물을 놓습니다.
- 외피, 다음 우물에서 transfection 솔루션을 포함 하는 모든 미디어를 제거 하 고 1:1 혼합물의 원뿔 튜브 (단계 2.2.5)에 신선한 유지 보수 미디어와 그것을 대체 합니다.
참고: 구문의 크기에 따라 세포 수 있습니다 시작 12 h; 내 표현 더 큰 구조에 대 한 3-4 일의 구문이 피크 식에 도달 하기 전에 필요할 수 있습니다.
- Opti 메모리 미디어 (Opti 메모리 미디어의 50 µ L에서 구조물의 0.8 µ g)와 소용돌이로 재고 (1 µ g / µ L)에서 구조를 희석. 각 잘 1 구문 희석을 준비 합니다.
3. Puffing 피 펫 장치 설정
참고:이 설정에 5 개의 기본 구성 요소가 있습니다: 유리 피 펫, 튜브, 주사기, micromanipulator, 그리고 버퍼 (행 크). 이 설정에 관련 된 순수 소금 농도 모든 버퍼를 사용 수 있습니다.
- 붕 규 산 피 펫 45 µ m 직경 오프닝 팁 micropipette 끌어당기는 사람 및 사양 표 3에 사용 하 여 주위를 당겨.
참고: 그것은 발견 하는 45 µ m 실험 조건 하에서 여 피 펫의 직경에 대 한 적당 한 크기입니다. 오프닝 크기에 약간의 변화가 크게 미치지 않습니다 결과. 그것은이 숫자에서 큰 출발, 튜브를 통해 피 펫에 연결 되는 주사기의 높이 조정 하 여 varicosity 유도 여전히 작동 해야 하지만이 압력 값의 재를 필요 합니다. - 얇은 고무 튜브에 피펫으로 취소 가져온된 끝을 삽입 합니다.
참고: 튜브 벽 얇고 주사기의 높이 무시할 수 저항 피펫으로 통해 흐르는 액체의 압력에 직접 비례 보장 유체 저항을 최소화 하기 위해 엄격한 해야 합니다. 튜브 보다는 저항을 최소화 하는 길이 더 약 0.6 m 이상 이어야 한다. - 회전 수 밸브와 커넥터를 통해 10 mL 플라스틱 주사기에 튜브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다.
참고: 플라스틱 주사기는 피 펫에서 흐르는 가정된 압력에 대 한 정확한 측정을 보장 하기 위해 일정, 측정 높이에서 개최 될 필요가 있다. 이 최소한의 압력을 제공 하지만 안정적으로 유도 하는 축 삭에 varicosities 190 m m의 높이 이용 되었다. 다른 높이 값 압력 coverslip 표면에서 분리 하는 세포가 발생할 경우에 사용할 수 있습니다. 실험을 통해 동일한 설정을 사용 하는 것이 좋습니다. - 장소에는 피 펫 잡아 micromanipulator 나사 상단에 피펫으로 삽입 합니다. 고무 튜브를 연결 하는 곳 바로 위에 피 펫의 유엔 가져온된 끝 보유 하 고 있도록 micromanipulator 팔에 부착 된 금속, 평면 올랐다 나사를 나사. 각도 45 ° 각도 신경 포함 된 coverslips의 표면에 피 펫.
참고:는 micromanipulator 피펫으로 constricting 고무 튜브 없이 개최 될 수 있도록 건설 되어야 한다. micromanipulator 셀의 범위 내에서 정확 하 게 위치를 x, y 및 z 방향에서 피 펫의 움직임을 허용 해야 합니다. 그래픽으로 기구의 사진 (그림 1) 아래 제공 됩니다. - 형광 필터, 조리개를 열고 켜고 보장 형광 자리는 목표를 통해 오고 볼 수 있습니다. micromanipulator를 사용 하 여 형광 자리 끝까지 라인을 피펫으로 세포 문화 접시 (35 m m x 10 m m)의 높이 보다 큰 위치에 낮은 위치에 피펫으로 이동 합니다. 그것은 위치에, 일단 전송 빛 하 고 형광을 끄십시오.
- 핀셋을 사용 하 여, 추가 한 coverslip (피펫으로 쪽으로 향하도록 셀) 셀 문화 판에서 실 온에서 행 크의 버퍼의 약 2 mL를 포함 하는 셀 문화 접시에.
- 포함 하는 범위에 coverslip 문화 접시를 놓습니다.
- 정밀한 초점 손잡이 및 20 X 목표 using, 셀 (약 0.4 m m) 보다 약 4 전체 회전 평면에 초점. micromanipulator를 사용 하 여 초점을 맞춘 고 센터, 눈 조각을 통해 본 비행기의 왼쪽에에서 피 펫 팁의 위치.
참고: 모 수석 세포 체에서 발생 같은 프레임에 있어야 하는 프로젝션 됩니다. Axonal varicosities 유도, 한 중간과 원심 축 삭을 세포 체에서 더 이상 예측을 따라야 한다.
4. 보정 Stretchable 막 시스템을 활용 하 여 피 펫의 압력
- ﹙ 실리콘 막 (직경에서 500 µ m) 및 50 µ m 두께 포함 하는 시스템을 통해 위에서 설명한 대로 정확한 동일한 매개 변수와 함께 puffing 피 펫 장치를 설치 하 고 막의 표면에 현미경을 집중 한다.
참고:이 시스템 작은 압력 값을 측정 하도록 설계 되었습니다 및 시스템에 대 한 설명10전에 게시 되었습니다. 이 측정만 한 번 피의 정확한 동일한 설정을 사용 하는 경우 실험 피에 대 한 필요가 있다. - 센터 사이 측정 현미경 (4 µ m 직경에서)와 10 µ m 간격, microdots 배열에 초점. 스톱 밸브를 설정 하 고 피펫으로에서 흐르는 액체를 허용 합니다. 유체 압력에 응답에서 막의 편향 confocal 현미경으로 검사 합니다.
- 막의 편향와 관련 된 해당 압력을 결정 하는 선형 모델을 활용 합니다.
참고: 동안 최근 연구 발견 w의 편향-3.143 = 0.69 ± µ m 높이 190 m m 주사기에 대 한 얻은,이 생산은 생리 적 및 병 적인 범위 내에서 하지만 현재 피 펫 설정에서 0.25 ± 0.06 nN / µ m2 의 압력에서 주사기 높이 유일한 결정 요인이 아니다. 다른 요인 뿐만 아니라, 신경에 피 펫 열기, 위치 (거리 및 각도)의 세포, 및 튜브4,10의 유연성도 피 펫 팁을 포함 하 여 정확한 압력 값 영향.
5. 피 Varicosities 유도 하
- 일단 피펫으로 위치에 현미경 관심 영역을 포함 하는 비행기에 초점. 오른쪽은 피 영역 외부 puffing 영역 내에서 이미지 필드 (카메라의 라이브 캡처 볼)의 왼쪽된 절반에 셀, 프로세스를 배치 합니다.
참고: axons의 광범위 한 파생물과 뉴런의 dendrites, 그것 아니다 신경의 모든 프로세스 영역 내에서 동일한 puffing 가능성이. 이것은 실제로 피의 현지 효력의 검사를 수 있는이 시스템의 장점 중 하나 이다. 거기 두 가지 유형의 피 varicosities 유도를 활용할 수 있는: 오랜 기간 피 고 펄스 피. -
피
- 오랜 기간 피
- 교양된 신경4를 포함 하는 coverslip 위에 190 m m 높이에 주사기를 놓습니다. 분명 신경 형태학을 계시 하는 최적화 된 노출 시간 시간 경과 영상 관심 분야의 시작. 기준으로 2 s 간격 (30 s 총)에서 적어도 15 프레임을 캡처하십시오. 간격 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 16 프레임에서 주사기의 턴 수 스톱 밸브 열고 75 프레임에 대 한 흐름을 액체 허용 (150 s). 프레임 75, 해제 밸브는 유체 흐름을 중지 합니다. 비디오 캡처를 중지 합니다.
참고:이 한다 유도 신경 axonal varicosities 이내 5-10 s, 7-9 DIV 반면 오래 된 뉴런 양식 varicosities 데 시간이 걸릴.
- 교양된 신경4를 포함 하는 coverslip 위에 190 m m 높이에 주사기를 놓습니다. 분명 신경 형태학을 계시 하는 최적화 된 노출 시간 시간 경과 영상 관심 분야의 시작. 기준으로 2 s 간격 (30 s 총)에서 적어도 15 프레임을 캡처하십시오. 간격 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 16 프레임에서 주사기의 턴 수 스톱 밸브 열고 75 프레임에 대 한 흐름을 액체 허용 (150 s). 프레임 75, 해제 밸브는 유체 흐름을 중지 합니다. 비디오 캡처를 중지 합니다.
- 펄스 (2 s 기간) 피
- 적절 한 높이 (190 m m)에 주사기를 놓습니다. 시간 경과 화상 진 찰을 시작 하 고 적어도 15 프레임 (30 s) 2 s 간격에. 16 프레임, 주사기의 밸브 및 유체 흐름, 허용 열고 밸브를 다시 열기 전에 (테스트 주파수)에 따라 2 s. 대기 5-20 s 후 밸브를 닫습니다. 유체 펄스를 만들고 150-300 미 계속 시간 20 분에 대 한 이미징 복구 단계를 캡처의 전체 기간에 대 한 계속 밸브의 개폐를 반복 합니다.
참고: 때 간격 보다 깁니다 10 s, 펄스 유도 크게 덜 varicosities. 20 s 간격에 아무 varicosities 펄스4에 의해 유도 될 수 있다. 안정적이 고 일관 된 varicosity 형성을 얻기 위해 주사기 높이 이어야 한다 약 190 m m. 주사기 높이 및 유체 압력 해야 어디 셀 coverslip 표면에서 분리 시작 지점에 발생 하지 것이 좋습니다.
- 적절 한 높이 (190 m m)에 주사기를 놓습니다. 시간 경과 화상 진 찰을 시작 하 고 적어도 15 프레임 (30 s) 2 s 간격에. 16 프레임, 주사기의 밸브 및 유체 흐름, 허용 열고 밸브를 다시 열기 전에 (테스트 주파수)에 따라 2 s. 대기 5-20 s 후 밸브를 닫습니다. 유체 펄스를 만들고 150-300 미 계속 시간 20 분에 대 한 이미징 복구 단계를 캡처의 전체 기간에 대 한 계속 밸브의 개폐를 반복 합니다.
- 사용 일 하기 전에 흐르는 10 mL 70%에 대 한 설정 (피 펫, 튜빙, 및 주사기) 청소 설정 통해 에탄올. 에탄올에 따라 세척, 행 크의 버퍼 (또는 원하는 버퍼) 10 mL를 그 날의 사용에 대 한 시스템 설정 통해 흐름. 하루 마무리 실험 청소로 설정 후 하룻밤 오염 물질의 성장을 방지 하기 위해 에탄올 기술 이전.
- 오랜 기간 피
6. 칭찬 방법
참고: puffing 분석 결과 소개 섹션에서 설명 하는 다른 기술의 다양 한 결합 될 수 있다. 여기, 초점 puffing 분석 결과, 고해상도 형광 timelapse 이미징, 칼슘 이미징 및 복구 분석을 포함 하 여 함께 가장 자주 사용 되는 핵심 기술입니다. 이러한 아래에 설명 됩니다.
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프로토콜 아래에 따라 고해상도 형광 시간 경과 화상 진 찰을 실시
- 오일 렌즈 X 100 뉴런 내 단백질 붙일 태그의 움직임을 추적 합니다. 신경 세포는 적절 한 cDNA 구조물과 페. 150 프레임 캡처 (총 300 s) 2 s 간격으로.
참고: 때때로, 다중 색상 시간 경과 영상 동시에 하나 이상의 붙일 태그가 단백질의 움직임을 이미지를 수행 됩니다. - 비디오 캡처 소프트웨어를 통해 또는 ImageJ (NIH)를 통해 kymograph를 생성 합니다.
참고: 속도 여행의 방향을 결정할 수 있습니다는 kymograph를 사용 하 여. * 물론 soma 지역에서 속 인 다 방향 참고 캡처됩니다. Soma 향해 여행 axonal 끝에 soma 멀리 여행 참가자는 역행, 이다. - Puffing 분석 결과 중 이미지 캡처를 사용 하 여 만들 수 피, 또는 kymograph에 따라이 프로세스를 반복 합니다.
참고: 미토 콘 드리 아와 시 냅 스 단백질의 axonal 전송에 피의 효과 최근 종이4에 표시 했다.
- 오일 렌즈 X 100 뉴런 내 단백질 붙일 태그의 움직임을 추적 합니다. 신경 세포는 적절 한 cDNA 구조물과 페. 150 프레임 캡처 (총 300 s) 2 s 간격으로.
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칼슘 이미징
- (24-잘 접시)에 대 한 1 µ L 또는 5mm Fluo-4 (6-잘 접시)에 대 한 3 µ L 추가 미디어에서 잘 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 문화에 오전.
- 1 mL 행 크의 버퍼와 두 번 셀을 씻어.
참고: 로드 된 뉴런 FITC 필터 집합을 통해 녹색 형광을 방출 한다. Loci 셀 내에 감지할 칼슘의 영역을 나타냅니다. 피와 결합 하면, 강도 (내부 칼슘 수준에 증가) 증가 볼 수 있습니다.
-
Varicosity 복구
참고: 즉시 puffing 실험 다음 20 분 복구 실험 수행할 수 있습니다.- 300 프레임에 대 한 이미지를 캡처 (1200 s) 4 s 간격으로.
참고: 가용성 YFP/mCherry/GFP와 페 셀 표시 합니다 적당 한 수준 (50% 미만) 복구의 이미징 세션의 끝에 의해. Axonal 복구는 등 여러 가지 요인, 교양된 신경4의 발달 단계에 따라 달라 집니다. 이 또한 고해상도 형광 이미징 및 칼슘 이미징 위에서 설명한와 결합 수 있습니다.
- 300 프레임에 대 한 이미지를 캡처 (1200 s) 4 s 간격으로.
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Representative Results
피, 이전 축 삭은 일반적으로 작은 varicosity 형성 표시. 다음 우리의 표준 압력 (mmH2O 높이 190), 많은 구슬 모양의 varicosities 개발 축 삭 시작으로 피. 그들의 사전 부풀어 상태로 10 분 회복 기간 (그림 2A-B)를 반환 하는 축 삭의 지역 같이 varicosities의 대형은 부분적으로 가역. 회복의 긴 기간 후 (> 20 분), 일부 축 삭 완전히 복구. 피 피 펫으로 무대 위에 190 m m에서 주사기의 정확한 포지셔닝의 차선 위치 수 있습니다 생성 하지 varicosities 빠르게. 최적의 조건 약 5 s4에 (약 7 DIV) 젊은 신경의 축 삭에 varicosity 형성 될 해야 합니다.
그림 1 : 회로도 및 기구를 피 사진. (A) 사진 보여주는 전반적인 현미경 설정. (B) 피 유리 피 펫을 보여주는 장치는 micromanipulator 보유 및 고무 튜브에 연결. (C) 단계 대조 이미지 오른쪽 하단에 피 펫의 그림자를 보여주는 기본 hippocampal 신경의 평면에 초점. (D) 피 피 펫 팁에 초점을 맞춘 셀 평면의 밖으로. 거리 및 varicosities 유도 대 한 계산 된 압력의 회로도 (E) 눈금 막대 = 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Varicosity 형성 피 다음의 대표 이미지. (A) 7DIV, 페 GFP 마우스 hippocampal 신경 축 삭 사전 및 10 분 회복 기간에 따라 뿐만 아니라 피 후의 이미지입니다. (B) (A)에서 뉴런의 시간 경과 화상의 Kymograph. 빨간색 화살표 표시 150 다음 형성 varicosities 190 mmH2O 피의 s (30에 시작 s). 눈금 막대 = 15 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| Coverslip 코팅 솔루션 | |
| 780 Μ L | 초의 acid17 m m 재고: H2O의 50 ml에서 50 µ L 초 산 |
| 200 Μ L | 폴 리-D-리 신 (주식 0.5 mg/mL) |
| 20 Μ L | 쥐 꼬리 콜라겐 (3 mg/mL 주식) |
| 총 볼륨 코팅 coverslips의 수에 따라을 결정 됩니다. | |
표 1: Coverslip 코팅 솔루션. 배양된 세포는 coverslips 준수 하는 데 사용 하는 coverslip 코팅 솔루션을 준비 하기 위한 조리법을 제공 합니다.
| 1 x 슬라이스 해 부 솔루션 (SLDS), 필터링, pH 7.4, 4 ° C에서 저장소 = | |
| 1 L | ddH2O |
| 82 mM | 나2이렇게4 |
| 30 mM | K2이렇게4 |
| 10 m m | HEPES (자유로운 산) |
| 10 m m | D-포도 당 |
| 5 mM | MgCl2 |
| 0.00% | 페 놀 레드 (옵션) |
| 미디어를 도금 (오후, 필터링, 4 ° C에서 저장) | |
| 439 mL | MEM 얼의 소금 |
| 50 mL | FBS |
| 11.25 mL | 20 %D-포도 당 |
| 5 mL | 나트륨 pyruvate (100 mM) |
| 62.5 Μ L | L-글루타민 (200 mM) |
| 5 mL | 페니실린/스 (P/S, 100 x) |
| 유지 보수 미디어 (MM, 필터링, 4 ° C에서 저장) | |
| 484 mL | Neurobasal |
| 10 mL | B27 50 x 보충 |
| 1.25 mL | L-글루타민 (200 mM) |
| 5 mL | 100 x P/S |
| 모든 솔루션은 0.2 m m 기 공 크기와 필터를 사용 하 여 살 균. | |
표 2: 세포 배양 조리법. 기본 hippocampal 신경 세포의 배양에 활용 하는 미디어를 준비 하기 위한 조리법을 제공 합니다.
| 행 크의 버퍼 (필터, pH = 7.4, 4에 게° C | |
| 150 mM | NaCl |
| 4 m m | KCl |
| 1.2 m m | MgCl2 |
| 1mm | CaCl2 |
| 10 mg/mL | D-포도 당 |
| 20 mM | HEPES |
표 3: 행 크의 버퍼 조리법. 라이브 셀 이미징 동안 puffing 프로토콜에 사용 하는 버퍼를 준비 하기 위한 조리법을 제공 합니다.
| 매개 변수를 당기 플라스틱 | |||||
| 열 | 풀 | 속도 | 지연 | 압력 | 진입로 |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
표 4: 매개 변수를 당기 플라스틱. 피 펫 끌어당기는 사람에는 직경에서 약 45 µ m는 여를 설정할 수 매개 변수를 제공 합니다.
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Discussion
이 microbiomechanical 분석 결과의 절차는 똑 바른 앞으로 이다. 그것은 그것의 모든 단계는 신중 하 게 실시 하는 경우 신뢰할 수 있는 결과 생산할 예정 이다. 잘못 수행 하는 경우 성공적인 데이터 수집을 방해 것입니다 하는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 중요 한 단계 시작 상류 puffing 자극의 실제 응용 프로그램의. 조심 해 부, 경작, 및 관리의 기본 신경 문화는 답해야 합니다. 교양된 신경 건강 한 있다면, 그들은 것입니다 반응 하지 않을 일관 되 게, 이후 그들은 수도 이미 되어 액 스트레스에 대 한. 문화, 초기 설정 및 varicosities 유발 한다 하지만 coverslip 표면에서 세포의 분리를 일으키지 것입니다, 인내심을가지고 수행 해야 일관 된 압력을 제공 하기 위해 puffing 기구의 교정의 다운스트림. 설정의 정확한 구경 측정 피 펫 막힘, 배관, 또는 밸브 문제 1 시간을 걸릴 수 있습니다. 그것은 액체 접시에 셀 배치 및 피 펫 팁 위치 앞으로 이동 하기 전에 최소한의 저항으로 피펫으로에서 흐름을 보장 하기 위해 중요 한. 설정 수정을 걱정 하는 만큼 관류, 패치 죄, 그리고 모든 다른 현미경 기반 악기, 현미경의 옆에 무료 물리적 공간에 주로 의존 puffing 장치 쌍 수 하나.
이 시스템은 주의 필요로 하는 두 가지 본질적인 제한이 있다. 설정은 지속적으로 피 액체는 세포를 통해 교양된 hippocampal 신경의 축 삭에 가역 varicosities의 형성을 시작할 수 있습니다. 그러나, 정확한 압력 값 필드 내에 같은 puffing 뉴런에는 동일 하 중요 하다. 유체 압력 셀 영향, ﹙ 실리콘 막4,10에서 압력 부하 측정에 따라 계산, puffing 필드의 중앙에 평균 압력을 나타냅니다. 따라서, 정확한 puffing 압력 puffing 필드와 필드의 가장자리의 주위에 가장 낮은 센터에 최고입니다. 우리는 그 발병, 크기, 및 varicosities 수와 압력 강도 상호 유도4보였다. 높은 압력 결과 빠른 발병, 더 큰, 그리고 더 풍부한 varicosities4. 우리의 최근 연구에서 우리는 여전히 안정적으로 대부분 축 삭4varicosities을 일으킬 수 있는 최소한의 압력 (190 mmHg 피 피 펫의 끝에)를 사용 합니다. 이 조건 하에서 젊은 신경에 varicosity 개시는 일반적으로 약 5 s. 그것은 정확한와 동일한 피 시스템, 발병 시간 값 수 다릅니다, 중요 한 뿐만 아니라 신경 유형, 나이, 및 subcellular 구획에 따라 달라 집니다 하지만 또한 puffing 분야에 있는 신경의 위치에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 뉴런을 받은 피 압력의 변화에도 불구 하 고이 분석 결과 시스템 여전히 중앙 신경에 기계적 효과 공부에 대 한 신뢰할 수 있는 수단을 제공 하 고 매우 일관 되 고 재현 실험 결과 생성 합니다.
시스템의 두 번째 한계는 막힘 문제 이다. 순수 관련 압력을 달성 하는 펫의 오프닝이 작습니다, 45 μ m의 주위. 그러나, 작은 여 플라스틱 튜브에서 파편을 췄 다 경향이 고 피 펫 팁에서 파편은 현미경 명확 하 게 볼 수 있습니다. 피 펫 방해할 경우 설정, 준비 시간 증가. 따라서, 모든 솔루션 주사기, 튜브, 그리고 피 펫에 입고 되기 전에 신중 하 게 필터링 됩니다. 그것은 또한 puffing 시스템 시작 및 필터링 된 행 크의 버퍼와 세척 뒤 하루의 끝에 70% 에탄올으로 세척 하는 것이 중요. 잠재적인 막힘 문제를 해결 하려면 여러 펫을 내려고 노력 하는 것이 좋습니다. 솔루션은 실험을 시작 하기 전에 시각화를 통해 피 펫에서 부풀어 실제로 확인이 필수적입니다. 좋은 puffing 시스템 설립 되 면, 그것은 일반적으로 하루 중 나머지에 대 한 지난 수 있습니다.
신경 문화 결합이 biomechanical 분석 결과 중앙 신경 mechanosensation 생리 및 병 태 생리 조건을 흉내 낸 공부에 대 한 독특한 기회를 제공 합니다. 이 시스템은 압축 및 신경에 전단의 효과 검사 수 있습니다. 반면, 다른 시스템에서 비행기 스트레칭5,,67검사 사용 되었다. 평균 압력 받은 puffing 분야의 센터에 있는 신경 세포는 0.25 ± 0.06 nN / µ m2 우리의 시스템4. 셀에이 압력은 hippocampal 신경의 탄성 계수 측정 스캐닝 힘 현미경 검사 법 및 대량 유동성, 광학 유도 변형13,14, 식별 하기 위해 이전 활용 뿐만 아니라 변경 neurite 최고의 가장자리 생체 외에서, 스캔 하 여 측정의 성장 하는 데 사용 하는 압력 힘 현미경 검사 법 (0.27 ± 0.04 nN/μ m2)16. 이 압력으로 기계적으로 특정 형광 세포 크기의 기름 microdroplets (1.6 ± 0.8 nN / µ m)2,14를 사용 하 여 측정 E11 배아, 중간 엽 세포에 의해 자연스럽 게 생성 될 수 있는 압력을 초과 하지 않습니다.
이 시스템은 이미 성공적으로 칼슘 이미징, 패치 죄, 전자 현미경, 및 닫힌된 두개골 mTBI 마우스 모델4의 세포 분석과 함께 사용 되었습니다. 있으 나 분석 결과 varicosities, 내 단백질 턴 오버를 검사 하 고 변경 되는 단백질 단백질 상호 작용 하는 경우 공부를 무서 워 함께 photobleaching (FRAP) 후 형광 복구 등 현미경 기반 실험에에서도 사용할 수 있습니다. 동안에 varicosity 형성. 할 수 있는 어떤 방법 기본적으로, 현미경 및 라이브 셀 이미징 설정 사용 하 여이 puffing 분석 결과와 결합 수 있습니다. 이 분석 결과의 다양성은 분자 메커니즘 micromechanical 스트레스로 신경 형태 및 기능에 다양 한 효과 기본 공부에 매우 중요 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
모든 동물 실험 지침에 따라 국립 연구소의 건강 동물 사용 실시 되었습니다. 이 작품은 C. 번에 건강의 국가 학회 (R01NS093073 및 R21AA024873)에서 교부 금에 의해 부분에서 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm coverslips | Warner Instruments | 64-0702 | for 24-well plate |
| 25 mm coverslips | Fisher Scientific | 12-545-102 | for 6-well plate |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Rat tail collagen | Roche | 11 179 179 001 | |
| 10X PBS | National Diagnostics | CL-253 | |
| Na2SO4 | Fisher Scientific | S373-500 | |
| K2SO4 | Fisher Scientific | P304-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| NaOH | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Protease enzyme | Sigma | P4032 | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin 100x (P/S) | Gibco | 15140122 | |
| MEM Earle's Salts | Gibco | 11090 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Arabinosylcytosine (Ara-C) | Sigma | 147-94-4 | |
| Opti-MEM media | Gibco | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1854313 | transfection reagent |
| Borosilicate rods | World Precision Instruments Inc. | PG52151-4 | for puffing pipette |
| rubber tubing | Fisher Scientific | 14-169-1A | |
| 10cc plastic syringe and plunger | Becton Dickinson | ||
| micromanipulator | Sutter Instruments | ||
| NaCl | Fisher Scientific | S640-3 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C70-500 | |
| Cell culture dish (35 mm x 10 mm) | Corning | 3294 | |
| Fluo-4 AM | Molecular Probes | F14201 | for calcium imaging |
| Mito-YFP construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| YFP-N1 construct | Takara Bio Inc. | for cell transfection | |
| Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Eclipse TE2000-U Mcroscope | Nikon | ||
| Plan Fluor ELWD 20x lens | Nikon | 062933 | objective |
| Apo TIRF 100x/1.49 oil lens | Nikon | MRD01991 | objective |
References
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