Summary
Aneuploidi leder till genomet instabilitet, som så småningom producerar cellcykeln-arresterade celler med komplexa karyotypes. Detta dokument ger en enkel och bekväm metod för att isolera aneuploid celler med komplexa karyotypes som upphör att dela.
Abstract
MIS kromosomsegregering leder till aneuploidi, ett tillstånd där celler hysa en obalanserad kromosomantalet. Flera rader av bevis tyder starkt på att aneuploidi utlöser genomet instabilitet, i slutändan generera celler med komplexa karyotypes att gripa deras spridning. Isolering och karakterisering av celler hysa komplex karyotypes är avgörande för att studera effekterna av en obalanserad kromosomantalet på cellfysiologi. Hittills har inga metoder fastställts att tillförlitligt isolera sådana aneuploid celler. Detta dokument innehåller ett protokoll för anrikning och analys av aneuploid celler med komplexa karyotypes utnyttja standard, billig vävnadsodling tekniker. Detta protokoll kan användas för att analysera flera funktioner av aneuploid celler med komplexa karyotypes inklusive deras inducerad åldras-associerade sekretoriska fenotyp, pro-inflammatoriska egenskaper och förmågan att interagera med immunceller. Eftersom cancerceller hamnområde ofta obalanser i kromosom nummer, är det avgörande att dechiffrera hur aneuploidi påverkar cellfysiologi i normala celler, med slutmålet att avslöja både dess pro - och anti - tumorigenic effekter.
Introduction
Fel i färd med att kromosomsegregering leder till aneuploidi, ett tillstånd som kännetecknas av en kromosom nummer som inte är en multipel av det haploida komplement1,2,3,4. Aneuploid karyotypes utlösa replikering stress som genererar ytterligare genomisk instabilitet5,6,7,8,9,10, ökar karyotyp komplexitet, och i slutändan leder till cellcykelarrest av en subpopulation av celler10. Syftet med den metod som presenteras här är att generera och separera sådan en subpopulation från cykling celler. Genom att anställa billig vävnadsodling tekniker, underlättar detta protokoll isolering och karakterisering av cellcykeln-greps aneuploid celler med komplexa karyotypes. Dessa celler kallas ArCK (frihetsberövad med komplex karyotyp) celler och deras euploid cykling motsvarigheter som kontroller.
Detta protokoll är det första som skall fastställas för detta ändamål och tillåter för isolering och ytterligare studera ArCK linjer inklusive, men inte begränsat till, deras inducerad åldras och åldras-associerade sekretoriska fenotypen (SASP), deras pro-inflammatoriska funktioner och deras förmåga att utföra med immunceller. Metoden presenteras här har utvecklats i ej omformad, förevigade mänskliga celler men har ännu inte testats i cancer linjer. Vissa celler kan vara okänsligt för cellcykelarrest på grund av hämning av en eller flera vägar; Därför ska ytterligare validering utföras i andra cellinjer.
Protocol
Kultur skick
RPE-1 hTERT cellinje var odlade i Dulbeccos modifierade Eagle Medium (Tabell för material) kompletteras med 10% fetalt bovint Serum, 2 mM L-glutamin och 100 U/ml penicillin/streptomycin. Cellerna var inkuberas vid 37 ° C med 5% CO2 i en fuktig miljö. Protokollet beskrivs nedan har utvecklats med hjälp av 10-cm rätter och alla tekniska detaljer rapporterade hänvisa till dessa rätter. Om du använder olika rätter, skala upp eller ner med detta.
1. synkronisering av RPE-1 celler
- Använd färska upptinade celler som inte har genomgått mer än 15 passager för alla experiment. Dag 1, Tina och fördela ~2.5 - 5,0 x 105 RPE-1 hTERT celler i en 10-cm vävnadsodling skålen. Tillsätt 8 mL standard odlingsmedium och inkubera över natten. Bestämma antalet celler med hjälp av en vanlig cell räknare (till exempel en hemocytometer).
Obs: Cell densiteten refererar till tillväxt villkorar av RPE-1 celler. Tillväxt villkorar kan variera mellan olika cellinjer; överväga att justera dem med detta. - Dag 2, synkronisera celler vid G1/S gränsen genom att aspirera regelbundna odlingsmedium och lägga 8 mL medium innehållande 5 mM tymidin.
Obs: Tymidin koncentration och längd på behandlingen kan variera mellan olika cellinjer. Det är lämpligt att utföra pilotförsök för att avgöra de bästa förutsättningarna för den cellen ledning(ar) till testas. - Dag 3, 24 h efter att lägga till tymidin medium (steg 1.2), släpp från tymidin block av aspirering medium och tvättning-celler tre gånger med 1 x PBS. Tillsätt 8 mL vanlig odlingsmedium och återgå plattor till inkubatorn.
2. generering av Aneuploid celler av störningar med aktiviteten av mitotiska Kinas Mps1
- Dag 3, 6 h efter release från tymidin block (steg 1.3; Detta är ca 3-6 h innan celler ange Mitos), aspirera medium, tvätta en gång med 1 x PBS och ersätta med medium innehållande 500 nM reversine (den Mps1-hämmaren).
Obs: RPE-1 celler ange Mitos 9-12 h efter tymidin wash-out10,11. Cellcykelns kinetik varierar dock mellan olika cellinjer. Därför är det avgörande att fastställa de kinetics i pilotförsök genom att utföra cellcykeln analys av etablerade metoder (t.ex., genom att mäta DNA-innehåll via FACS-analys). Den optimala arbetande koncentrationen av Mps1 hämmare kan dessutom variera mellan cellinjer. Tidigare experiment med RPE1 celler har varit framgångsrik med reversine på en arbetande koncentration av 500 nM10,11,12. Det är lämpligt att utföra pilotförsök för att bestämma den optimala koncentrationen för den cellinje som ska testas. - På dag 4, 12 h efter reversine behandling (ca 6 h efter celler i Mitos), aspirera reversine medium och tvätta celler tre gånger med 1 x PBS. Lägg till 8 mL vanlig odlingsmedium till plattan och återgå celler till inkubatorn.
3. avlägsnande av Aneuploid cykling celler och anrikning av ArCK befolkningen
- Dag 6, ca 72 h efter celler anger den första Mitosen (steg 2.2; Detta är ca 66 h efter reversine wash-out, vilket motsvarar ca 2-3 cell cykler), aspirera medium, tvätta en gång med 1 x PBS och ersätta med medium innehållande 300 nM nocodazole.
Obs: Senaste arbete har visat att RPE-1 celler hysa aneuploid karyotypes är genomiskt instabila och gripa deras spridning om 2-3 cell cykler efter de första felaktiga Mitos10. Dock kan denna kinetik variera mellan olika cellinjer. Därför är det avgörande att utföra pilotförsök för att bestämma rätt tidpunkten för avlägsnande av aneuploid cykling celler. - Dag 7, 12 h efter nocodazole behandling, aspirera medium och Lägg till 3 mL 1 x PBS till plattan. Skaka av de mitotiska cellerna genom att trycka på sidan av plattan. Rotera plattan mellan varje tryck att tillåta även borttagning av mitotiska celler.
- För att säkerställa fullständig borttagning av mitotiska celler, upprepa processen shake-off för flera rundor (3 - 5 gånger rekommenderas), aspirera och lägga 3 mL 1 x PBS mellan varje omgång.
- Efter shake-off, försiktigt aspirera vätska som anslutit sig till locket eller på kanten av plattan. Kort, kontrollera plattan under ett Mikroskop vid 10 X förstoring. Se till att få mitotiska celler iakttas. Om fler än fem mitotiska celler ses under 10 X mål, upprepa ytterligare en runda av shake-off.
Obs: Mitotiska celler verkar rundade och kan vara delvis fristående efter shake-off. Det är viktigt att säkerställa fullständig borttagning av mitotiska celler innan utsätta celler till nästa omgång av nocodazole behandling. Underlåtenhet att göra detta kan leda till mitotiska celldöd eller resultera i generation av gräsart celler. - Efter sista shake-off, tvätta cellerna en gång med 5 mL 1 x PBS. Lägg till 8 mL medium som innehåller 330 nM nocodazole i plattan och inkubera i 12 h.
- Upprepa nocodazole behandling/shake-off (steg 3.1-3.5) varje 12 h tills ingen mitotiska celler observeras efter inkubation. Vanligtvis rekommenderas 4-5 rundor av behandling/shake-off.
Obs: Informationen här se RPE-1 celler. Antalet omgångar av behandling/shake-off kan variera mellan olika cellinjer. Undvik långvarig och onödig exponering för nocodazole är det viktigt att noggrant bestämma, i en pilot experiment, antalet omgångar som krävs för effektiv och fullständig borttagning av aneuploid cykling celler. - Efter 4-5 rundor av nocodazole behandling/shake-off (steg 3.1-3.6), tillsätt 10 mL av regelbundna odlingsmedium och inkubera. Tillåta celler att vila för 12-24 h innan framtida manipulation eller assay användning.
Obs: Efter sista shake-off, celler kvar på plattan är cellcykeln greps och som nyligen visas10, hamnen komplexa karyotypes. Dessa celler kallas ArCK (frihetsberövad med komplex karyotyp) celler. Det är lämpligt att utföra analyser på ArCK populationer inom en vecka efter isolering. - Alternativt för att bedöma andelen arresterade celler med komplexa karyotypes, samla och räkna celler från varje shake-off med hjälp av en vanlig cell räknare.
Figur 1: övergripande Schematisk av den metod som används för att generera och isolera aneuploid celler med komplex karyotyp (ArCK) och representativa bilder. (A) Schematisk av ArCK celler generation och isolering protokoll. (B) representativa bilder av RPE-1 hTERT celler i varje skede av behandlingen. Den sista panelen (rödmarkerade) representerar de isolera ArCK cellerna. Skala bar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
4. karakterisering av ArCK befolkningen
- Bekräfta lyckad isolering av ArCK befolkningen genom att utföra följande analyserna.
- Åsnor beta-galaktosidas färgning (en markör för åldras) använder en kommersiellt tillgänglig kit (se tabell för material).
- Mäta utsöndringen av pro-inflammatoriska cytokiner, såsom CCL2, genom att använda kommersiellt tillgängliga Kit (se tabell för material).
- Bekräfta ökade nivåer av cellcykeln-hämmare p53, p21, p16 genom Western Blot.
Obs: För att ordentligt kontrollera dessa analyser, ArCK populationer bör jämföras med både euploid och aneuploid cykling celler. Den förstnämnda är låg passage, vildtyp RPE-1 hTERT celler exponentiellt växande. Den senare kan erhållas genom inducerande mis kromosomsegregering i RPE-1 hTERT och skörd celler 72 h efter den första avvikande Mitosen. Till gör så, följa protokollet beskrivs ovan från steg 1.1 och skörden celler precis innan första nocodazole behandling (steg 3.1).
- Utföra encelliga sekvensering för att bedöma karyotyp arresterade celler.
Obs: Single-cell sekvensering är en väletablerad metod för att bestämma kromosomala och sub kromosomala förändringar över en cell befolkningen vid enstaka cell nivå13. Detaljerade procedurer för hur du utför encelliga sekvensering kan hittas någon annanstans10.
Representative Results
Denna metod använder en in vitro- vävnadskultur system för att isolera aneuploid celler med komplexa karyotypes att gripa deras spridning. Denna population kallas ArCK (frihetsberövad med komplexa Karyotypes) celler. Figur 1A visar systematiken i experimentet. Vildtyp cykling RPE-1 hTERT celler synkroniseras vid G1/S gränsen med tymidin och behandlades med en Mps1-hämmare att inducera mis kromosomsegregering. Den spindeln gift nocodazole läggs till cellerna 72 h efter induktion av mis kromosomsegregering. 12 h efter nocodazole behandling, aneuploid cellerna som fortfarande klarar föröka ange Mitos och är fångade i nuläget cellcykeln på grund av störningar med mikrotubuli polymerisation. Dessa fångade celler avlägsnas sedan enkelt av mild shake-off. Shake-off processen är upprepad 3 - 5 gånger att säkerställa fullständig borttagning av cykling celler. Figur 1B visar de representativa bilderna av RPE-1 celler i varje skede av behandlingen.
ArCK celler visar ökade nivåer av cellcykeln-hämmare, som p53, p21 och p16 jämfört med euploid och aneuploid cykling celler, som visas i figur 2A. Dessutom visar figur 2B positiva β-galaktosidas färgning i ArCK celler i jämförelse med euploid kontroll celler, en väletablerad markör för cellulära åldras.
Figur 2: representativa resultat utnyttja ArCK celler. (A) Western blot bedömningen av cellcykeln hämmare nivåer i euploid, aneuploid cykling och ArCK celler. Nivåerna av p53, p21 och p16 bestämdes genom western blot analys. Aktin tjänade som en lastning kontroll. (B) β-galaktosidas färgning bedömningen av åldras i ArCK celler. Åldras-associerade β-galaktosidas (β-Gal) aktiviteten bestämts i euploid och ArCK celler. Skala bar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Detta cellcykelarrest är ett framträdande inslag i aneuploid celler med komplexa karyotypes, som visas av representativa karyotyp analys från encelliga sekvensering i figur 3, där ArCK celler visar flera slumpmässiga kromosom vinster och förluster. Detta konstaterande är helt överens med tidigare rapporter10.
Figur 3: representativa encelliga sekvensering av ArCK celler. Segmentering tomter visar karyotyp av sex representativa ArCK celler. Segmentering tomter Visa kopia antalet alla kromosomer från 1 till X i förhållande till en euploid referens på en log2 -skala (vilda typ RPE-1 är en diploid cell fodrar av kvinnliga ursprung). Kromosom vinster är markerade i rött, kromosom förluster i grönt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Denna nya metod att generera och berika för arresterade celler med komplexa karyotypes (ArCK) möjliggör studier av celler som har flera kromosom vinster eller förluster och upphöra att dela. Den metod setup har utformats för att underlätta isolering av ArCK celler på ett snabbt och tillförlitligt sätt.
Det mest kritiska steget i denna analys är rigoröst kontrollera tidslinjen för missbruksbehandling och, viktigast av allt, avlägsnande av aneuploid cykling celler. För optimalt resultat är tidpunkten för nocodazole behandling och shake-off särskilt viktigt att säkerställa att cykling celler avlägsnas från plåten medan de är fortfarande rundade och mitotiska, förhindra möjligheten av mitotiska celldöd eller slirning i G1, potentiellt skapa en gräsart befolkning. Det rekommenderas inte att tidpunkten för shake-off avviker mer än två timmar från rekommenderade 12-h nocodazole ruvning.
Framtida studier på ArCK celler har potential att ge en djupare förståelse för hur komplexa karyotypes påverka cellfysiologi. I synnerhet visade en nyligen genomförd studie att celler i immunförsvaret är att interagera med och trigger immun clearance av ArCK celler10. Den metod som beskrivs här ger en utmärkt utgångspunkt för ytterligare karakterisering av ArCK celler, inklusive klargörandet av de molekylära mekanismerna bakom immun clearance i ej omformad celler och studiet av hur Onkogen transformation kan kringgå denna övervakningsmekanism, en avgörande fråga i fältet14,15.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av Koch Institute stöd (core) Grant P30-CA 14051 från National Cancer Institute, genom den nationella institut för hälsa Grant (CA206157-22 och GM118066) och Curt marmor Cancer Research Fund att Angelika Amon. Angelika Amon är också en utredare av den Howard Hughes Medical Institute och Glenn Foundation for Biomedical Research. S. S. stöddes av den amerikanska italienska Cancer Foundation (AICF), genom ett stipendium inom cancerforskning från Marie Curie-åtgärderna och den italienska föreningen för Cancer forskning (AIRC), och genom en KI Tyskland Cancer Research Fellowship. E.M. stöddes av ett stipendium från Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) | Thermofisher | 11995-073 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T1859 | |
| Reversine | Cayman Chemical Company | 10004412 | |
| Nocodazole | Sigma Aldrich | M1410 | |
| Anti-p53 antibody | Santa Cruz | sc-126 | |
| Anti-p21 antibody | Santa Cruz | sc-6246 | |
| Anti-p16 antibody | BD | 554079 | |
| Senescence b-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling Technology | 9860 | |
| Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit | R&D Systems | ARY005B |
References
- Santaguida, S., Amon, A. Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).
- Pfau, S. J., Amon, A. Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man. EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).
- Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. Causes and consequences of aneuploidy in cancer. Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).
- Meena, J. K., Cerutti, A., et al. Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion. The EMBO Journal. , 1-14 (2015).
- Ohashi, A., Ohori, M., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668 (2015).
- Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. The presence of extra chromosomes leads to genomic instability. Nature Communications. 7, 10754 (2016).
- Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. Aneuploidy drives genomic instability in yeast. Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).
- Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast. PLoS Genetics. 8 (5), e1002719 (2012).
- Santaguida, S., Richardson, A., et al. Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System. Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).
- Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation. Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).
- Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine. The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).
- Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
- López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes. Trends in cell biology. , 1-4 (2017).
- Watson, E. V., Elledge, S. J. Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown! Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).
