Summary
ここハイドロゲルを用いた複雑な形状設計組織を生成するために使用できるカスタム ポリジメチルシロキサン金型を製造するため急速な安易なと低コスト手法を提案します。さらにこの手法を使用して生産設計された心臓ティッシュの実施される力学的および組織学的評価の結果について述べる。
Abstract
組織工学の分野が成熟するにつれ組織形状を含む組織パラメーターの広い範囲で関心の高まりがあった。センチメートルのスケールにマイクロメータの組織形状を操作するで、セルの配置を直接し、効果的な機械的性質を変更し、栄養素の拡散に関連する制限に対処できます。さらに、ティッシュが用意されて容器は組織細胞とマトリックスの両方の構造に影響を与えることができますさらに応力場での機械的な制約を与えることができます。再現性の高い次元の形をした組織も、サンプルの寸法は、全体組織力学的解析など、重要なの in vitroアッセイするためのユーティリティがあります。
この原稿は、レーザー エッチングされたアクリルから調製した負のマスター金型を活用した代替製造方法をについて説明しますこれらの金型ポリジメチルシロキサン (PDMS) を発揮、センチ スケールと機能寸法とデザインを許可。25 μ m より小さいサイズし急速に設計し、作製、低コストと最小限の専門知識を持つ。最小限の時間とコストの要件は、最適なデザインを決定するまでに急速に反復処理してティッシュ エンジニア リングの分野を超えても含め関心の任意のアッセイに合わせて簡単に適応するレーザー エッチングされた金型の許可します。
Introduction
過去二十年以上ソフト リソグラフィに使用されています作製技術として広く特にマイクロ流体システム、材料研究と組織工学1、2の分野で科学的な研究をサポート 3。負のマスター型から所望の形状を持つオブジェクトを作成するレプリカ成形ヒドロゲルを形鋳造用、便利で低コストの製造方法 PDMS に複製は、正を使用ことができます提供しています。ただし、必要な負マスター金型は高価な時間のかかる、サイズに制限は、微細加工技術を使用して生成される通常、クリーン ルーム空間と高度な機器を必要とします。3 D プリントは、潜在的な代替手段を提供、その有用性はやや低価格プリンターと共通の 3 D プリンターのポリマーと硬化を阻害することができます PDMS の化学相互作用の解像度制限により限られています。
大幅により少なく高価なしたがってより研究ツールを製造するためのアクセス両方を切断、プラスチック、木材、ガラス、金属などの材料をエッチングできるレーザー カッター システムは近年します。商業用等級レーザー カッターは 25 μ m より小さい最小機能を備えたセンチ スケール上のオブジェクトの加工が可能なさらに最小限のトレーニング、専門知識、および使用する時間を必要とします。PDMS のアブレーションは、マイクロ流体デバイスの作製で以前使用されています、一方我々 の知識に原稿がプロセスを説明ないレーザー切断された否定的なマスター金型4 からミリとセンチ スケール金型を加工できます。.
栄養素の拡散、細胞の配置、および機械的性質5,6,7を向上させるために設計された組織の形状を操作する主にこのテクニックを使いました。ただし、この手法の汎用性は、成形ゲルが薬剤配達および材料科学研究8など、関心のある任意のフィールドで利用できます。レーザー カッターへのアクセス、PDMS 金型複製はほぼすべてジオメトリの場合 (つまり、本稿の範囲を超えているマルチパート金型なしの除去を阻害するだろう) のオーバー ハングせず作ることができるレーザーのベッドの寸法内に収まる。
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Protocol
1. ベクトル形式マスター金型設計を作成します。
- ベクトル形式ベクトル グラフィック プログラムを使用しての必要な金型形状を組み立てる (材料、装置およびソフトウェア」の表を参照)。ファイルを選択 |新しいの RGB カラー形式で適切なサイズのキャンバスを作成するとします。左側のパネルでシェイプ ツールを使用して目的のジオメトリを作成する: (最初表示されない場合上部に変換ボタンをクリック) ウィンドウの上部に目的の寸法を入力図形のサイズを正確に定義します。
注: 金型形状最も外側のフィーチャのエッジと切削ラインの少なくとも 6 mm 罫線の次の金型鋳造 PDMS メニスカスのトリミングを許可するように許可する必要があります。完成した金型に培養皿の底に平らになります。さらに、金型の形状は、カーフ幅と最小機能サイズを含む使用されるレーザー カッター モデルに関連する考察制限に入れなければなりません。説明する作業用レーザー 0.2 mm カーフ幅、エッチング フィーチャの最小サイズは 25 μ m (1,000 の最大 DPI) 本特集 (材料、装置およびソフトウェア」の表を参照)。金型寸法は 10 cm 皿や 6-24 ウェル プレートなど、目的のカルチャの容器に合わせて選択できます。 - ウィンドウの左上隅でカラーピッカーを開くし、新しい色見本レーザー カッター ソフトウェアと互換性を定義します。
注: 切断は、赤 (RGB 255, 0, 0) を使用し、エッチング (RGB 0, 0, 255) のブルーします。(たとえば、1 つ以上のエッチング深さが必要な) 場合、設計の要件に応じて追加のスウォッチを定義できます。- 切削パスにパスを選択し、カラー ピッカーからパスの色のカット見本と塗りつぶしの色に[なし]を選択してこれらのスウォッチ カラーを割り当てます。
- 同様に、オブジェクトを選択し、カラー ピッカーから塗りつぶしの色をエッチング パスとパス色に[なし]を選択してパスをエッチングするスウォッチ カラーを割り当てます。
- Either.ai or.pdf のファイル形式は、ベクトル グラフィック プログラムとレーザー カッターの互換性によって (図 1 aと補足ファイル) としてデザインを保存します。
2. レーザー カット アクリル マスター金型
- 否定的なマスター金型材料を選択します。
注: 1/4 インチ厚いアクリル レーザーの切断は、比較的低コストとの互換性のためこのアプリケーションに適しています、機能により、最大厚 〜 5.5 mm の高さ。ただし、次の要件を満たすその他の材料も同様使用する: (i) PDMS の養生; 非反応性(ii) 非多孔質/強接着剤硬化 PDMS;(iii) 削減し、レーザー カッターできれいにエッチング(iv) 維持ガラス状態の 60 ° C まで(v) の厚さが最大の希望する機能の高さと互換性があります。 - 製造元の仕様に応じた切断をレーザー カッターを準備します。十分な換気がされており、ベッドの高さが選ばれた否定的なマスター金型材料の厚さを正しく校正されてことを確認します。
- レーザー カッターに接続されているコンピューター上のベクトル グラフィックス プログラムの設計ファイルを開き、ファイルをクリックして |印刷。レーザー カッターがプリンターとして設定されているスケーリングの「縮小を行いません」が選択されていることを確認ドロップ ダウン メニューの印刷ダイアログ ボックスの下部に [印刷] ボタンをクリックする前に、デザインの歪みを防ぐために。
- レーザー カッターの印刷ユーティリティでは、右下隅の [設定] ボタンをクリックします。すべての設計機能のカット、エッチングのパラメーターを設定する前に選択した色のそれぞれにパワー、速度、およびパルス単位のインチ (PPI) 設定を割り当てます。
注: ここでは、レーザー カッター搭載 75 W レーザー (材料、装置およびソフトウェア」の表を参照)、次の設定を使用: 100%、1% の速度、および 1,000 PPI は切れ味が ¼"アクリル; を通じて100%、8% の速度、および 500 PPI をアクリル; 2.75 mm の深さにエッチングします。100% 電源 5% 高速化、500 PPI をアクリルで 3.50 mm の深さにエッチングします。レーザー カッター構成またはマテリアルの不明な場合、試験片を試行錯誤しながら経験的これらのパラメーターが確認できます。 - Etch 切り負マスター金型、レーザー レーザー カッター ソフトウェアの大きな緑色のボタンをクリックします。
- PDMS 鋳造用小ブラシや圧縮空気 (図 1 b) と残差切除残骸を削除することによって負のマスター型を準備します。
3. セルまたはティッシュ文化の PDMS 金型を準備します。
- そのメーカーの仕様によると PDMS 鋳造ミックスを準備します。マスター型; の 0.35 mL/cm2を準備します。これは、金型機能と高さに基づいて異なります。
- 標準的な実験室の真空ラインに接続されているドガ真空チャンバー内で準備の PDMS (< 500 mmHg) 1 h、またはすべての泡を排除されているまで。
- テープを拡張するようにビニールまたはマスキング テープ (テープ作品も色付きのラベル) の金型の外側の端をテープ > 負のマスター型のエッチングの顔の上 3 mm。後で漏れを防止する金型の側面に対してしっかりとテープを押します。
注: アクリル マスター金型機能スルーホールは場合、必要があります (図 1) にも金型の下にテープを適用します。 - 脱 PDMS を負のマスター型のエッチングの顔に注ぐ。
注: PDMS 厚さがアプリケーションによって異なります、厚い PDMS モールド底がターゲット イメージングに挑戦を行うことができます。最小厚さ 〜 1.5 mm イメージングの考慮事項とカビの除去の容易さの良いバランスが取れています。 - 真空チャンバー内に PDMS コーティング負マスター型を配置し、1 時間、またはすべての泡を排除されているまで再度ドガします。
- オーブン棚が水平であることを確認、少なくとも 6 h に対する治療を 60 ° C のオーブンに脱 PDMS コーティングの負マスター型を配置します。また、37 ° C 夜間、または常温の PDMS を許可する 〜 72 時間。
- 複数の鋳型は同じ否定的なマスター型にキャストされた、負のマスター型にまだいる間これらのモールドの離れてカットに、黒人を使用します。その後、負のマスター型から各 PDMS 金型をはがします。ゆっくりと慎重に PDMS 金型を収集できるようにするコレクションの中に引き裂く金型機能を防ぐために。
- 鋳造から半月板を持つ領域を切り落とすかみそりの刃を使用して、横になっているフラットと同様、余分な材料または残骸 (図 1) から金型を妨げることになります。
- 必要な場合は、オートクレーブに入れることによって細胞/組織鋳造用金型を準備します。
4. キャストのコラーゲンとフィブリン ハイドロゲル組織
注: は、無菌性を維持するために無菌の適切な手順を使用します。
- 必要な容器の底にカビを付着します。(PDMS の疎水性) のために未処理のプラスチックに対して金型をしっかりと押すことによって組織培養処理板の下部に新しい金型を遵守します。
注: ただし、組織文化が扱われる場合ポリカーボネートが使用される、または添付ファイルを確実にしっかりと付着しにくい傾向があり、再利用型の場合 (フィブリンまたはシリコーンの密封剤は一晩硬化) などの天然または合成接着剤を使用できます。 - そのキャスト組織におけるそれぞれの必要な濃度を達成するソリューションを鋳造し、中和されたコラーゲン、トロンビン、フィブリノゲンを準備します。鋳造まで氷にコラーゲンを保ちます。
注: フィブリノゲンとトロンビンいけない鋳造直前までミックスします。必要に応じて、フィブリノゲンとトロンビンのソリューションすることができますも底冷えがする重合時間を増やします。0-8 間最終フィブリノーゲン濃度を用いて mg/mL, 10 100 U/mL と最終的なコラーゲン濃度 0.8 - 2.0 mg/mL (図 2) の間の最終的なトロンビン濃度。設計された心臓ティッシュの私たちはしばしば 1.6 mg/mL、4 mg/mL フィブリノゲン 20 U/mL トロンビンと 12 x 106セル/ml で心筋細胞を使用 (トロンビンは鋳造前にすぐに追加されます)。(これらの推奨される範囲) 以外にも至適濃度は、経験的に決定する必要があります。 - 標準プロトコルの後で細胞を収穫し、鋳造組織に必要な初期細胞密度を達成するために適切な濃度で再停止しなさい。
注: ひと誘導多能性幹細胞由来心筋細胞はリアンらで説明されているようで収穫されました。9は、氷の上収穫された細胞を保ちます。細胞容積細胞懸濁液を準備するとき考慮するべきであります。最適な範囲にセル人口 (図 2) によって期待が 9-18 106セル/mL、x に至る細胞濃度を使いました。 - 鋳造のミックスを作成する (たとえば手順 4.2 参照) フィブリノゲン、中和されたコラーゲンと細胞懸濁液を組み合わせます。氷の上に鋳造ミックスを保ちます。
注: フィブリノゲンとトロンビンの温度および濃度が決定重合動力学;鋳造時の重合を防ぐためには、数によって鋳造ミックスの別のバッチとキャストが構成要素のボリュームを準備する必要があります。 - PDMS の疎水性を軽減するために鋳造のミックスにさらされる金型の表面を扱う (PDMS 疎水性タンパク質の吸着を増加し、鋳造を困難)。
- ハンドヘルドの高周波発電機 (例えば、リットン エンジニア リングから BD 20 a) のように酸素プラズマと扱うことによって表面親水化を実現します。3-5 秒、キャストする前に約 5 分のプラズマ処理セル/ゲル混合物を接触する金型のすべての面を公開します。
- また、プルロニック F-127 (1 %w/v)10のような界面活性剤を扱います。極性の変化が時間の経過とともに悪化するので、できるだけ詠唱時間近くとして表面処理を実行します。
- 直前の鋳造、気泡を導入することがなく、上下ピペッティングにより、鋳造ミックスとミックスに徹底的にトロンビンを追加します。
- 鋳造ミックスをピペット作業が迅速に、すべてのコーナーと金型の隙間にミックスを入金する気を使用して、鋳型に。構造内のバブル形成を防ぐために最初のピット ストップを超えてピペット放出を避けます。
- 4.6 および 4.7 鋳造ミックスのバッチ処理を行う必要に応じて手順を繰り返します。
- 45 分の 37 ° C のインキュベーターで培養容器を配置します。インキュベーターがよく湿度がない場合は入金携帯メディア構築脱水症状を防ぐために孵化する前に金型の周りです。
注: 携帯メディアの種類は細胞タイプによって異なりますが、RPMI 1640 + B27 サプリメントを用いて設計された心臓ティッシュの構造のため。 - 45 分後、フードと携帯メディアでカバーするインキュベーターに戻る前に構成要素を返します。
- セルに応じてすべての 48-72 h 携帯メディアを変更し、型を構築します。
注: セルの最大の健康を確保する推奨手順、サプライヤーによって提供されるによるとメディアの変更を計画する必要があります。構成要素を妨害を避けるために、メディアを変更するときに、注意をしてください。我々 は、フローティング構造の問題を経験していないが、それは背の高い記事をメディアのレベルを超えて拡張金型設計に追加することによってできない場合がありますこのような場合。 - 使用後は、10% の漂白剤、70% エタノールで順番に金型を洗浄し、蒸留水します。まで乾燥と再利用のためのオートクレーブを空気 〜 10 倍。
5. 解析手法: 組織の圧縮
注: 圧縮マトリックス改造に起因は組織の生存率と光学顕微鏡と画像解析を簡単に測定することができます開発の指標です。
- 鋳造後の 96 h 2 h に至る時間刻みで金型構造の光学顕微鏡画像を収集します。
注: 倍率の必要度が低いため解剖顕微鏡カメラ マウントではこのアプリケーションにも適しています。 - ImageJ など画像解析スイートで目に見える構造領域をトレース (オープン ソース、imagej.nih.gov/ij/)。
- 率と圧縮 (図 2) の最終的な程度を分析します。
6. 解析手法: 引張試験
注: 両方のアクティブな力学 (力または細胞の活動のために設計された組織によって生成される系統) 受動的力学 (力または応用系統または力に応答して生成された系統) が設計された多くの重要な機能特性を組織とこれは特に設計された心臓ティッシュに当てはまります。分析用マイクロメカニカル アナライザーは、材料表の説明です。彼らは、水和テストのため長制御機能がるし、張力範囲と解像度の測定を組織に関連すると仮定すると、他の機械式試験装置を同様に適用でした。5 mN のロードセルは、単一の平方ミリメートル程度の断面積と kPa 万程度の剛性と組織、良いフィット感です。大きくより堅い材料は大きな負荷セルを必要があります。試験前に, 合力トランスデューサーならびに長さコント ローラーの両方に適切に校正されてを確認します。
- 長さコント ローラーをオンに、トランスデューサー、パルス発生器、温度コント ローラーを強制します。
- 機械的試験トラフ タイロード液 (1.8 mM 塩化カルシウム、塩化マグネシウム 1.0 mM、塩化カリウム 5.4 mM、140 mM 塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム 0.33 mM、10 mM HEPES、および ddH2O、pH 7.4 に調整で 5 mM グルコース) を埋める心臓組織を設計されています。37 ° C の風呂の温度を達成するように熱電対を調整します。
- アクティブな収縮データを収集するための機械的試験プロトコルを読み込みます。
注: 我々 はステップの長さプロトコルどの長さで 5% 歪みでステップ インクリメントを 30%、120 の開催によるアクティブな収縮力学評価した収縮力 (図 3 a) に対する歪みの影響を評価する s。さらに、10% ひずみ/分 (図 3 b) の定ひずみ速度でプルを破るプロトコルを介して受動的な力学的特性を評価しました。これらのプロトコルの両方は、アクティブおよびパッシブの力学解析のための良い出発点として役立つかもしれない。 - 郭清範囲の下で自由に浮いているように慎重に PDMS 金型から設計された組織構造をデタッチします。
注: 組織の圧縮を受けている Cellularized 構造可能性がありますすでにからデタッチされます。 内装金型の表面、これらのケースで最低限の操作が必要です。- 圧縮がリリースするコンストラクトを生じない場合は、優しくから側面と下部組織の損傷を避けるために金型の構造を分離する鉗子を使用します。
- 鉗子を使用して、優しくコンストラクトをピックアップし、機械的テストお風呂にそれを転送します。
- 解剖顕微鏡を使って構成を表示する、合力トランスデューサーならびにレバー腕に接続されているフックに構築のいずれかの端をマウントします。
- 適用ひずみなく構造体が配置されるまで、マニピュレーターを使用してレバー腕の位置を調整します。ゼロ長さのコント ローラーとコント ローラーが。
- 画像解析による構造体の寸法を測定できますので、郭清範囲をコンストラクトをイメージします。
- アクティブ力プロトコルを開始し、収集保存データ プロトコルがしたら完了 (図 3)。
- 受動的な機械的データも必要がある場合は、ゼロの適用ひずみがあるまでにレバー腕をもう一度調整しています。長さをゼロ、力コント ローラーおよび 2 番目の構成要素を画像の読み込みと受動的力学プロトコル (図 3) を開始する前に時間。収集したデータを保存します。
7. 解析手法: パラフィン組織および免疫組織化学
注: 組織形態は、最高の保存状態、パラフィン ブロックを使用して設計されたティッシュ セクションをイメージングで偉大な成功を収めています。プロセスのすべての手順を慎重に検討および真空または圧力なしのサンプルを処理、経験的適切な抗原検索方法の決定および一次抗体を滴定を含むエンジニア リング組織に合わせた必要濃度。スライドを準備するための冷凍ブロックを使用するなど、他の手法は、目的のアプリケーションに応じて十分な結果を生成しながら以下の時間と費用を必要があります。
- 郭清範囲の下で慎重にそれが自由に浮いているように優しく、PDMS と区別するため構築と PDMS の間下落した鉗子を使用して、PDMS 金型から設計された組織構造をデタッチします。微量遠心チューブの固定のためにこれらの構成要素を転送します。
注: 壊れやすい構造や型自体によって提供される静的応力条件下で固定で固定後、金型から構成を削除するにも文化のソリューションを変更しての金型で修正される可能性があります。 - すぐに室温で 10 分間 4% パラホルムアルデヒド (PF) の沈没によって設計された組織を修正します。組織の厚さ 1 ミリメートルあたり 1 h 以上を推定します。過剰が解決しません。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で組織をすすいでください。
- 濡れたティッシュを維持し、それを 10-30 s ピンク染色して 70% のエタノールで洗い流しエオシンのドロップを配置します。
注: ピンク色区分後のパラフィン ブロックで識別するため、deparaffinization の間に洗い流されます。 - 組織カセットでレンズ ペーパーで組織と場所をラップします。泡パッド組織をフラットに保つために必要に応じてに、カセットで使用します。
- パラフィン加工の準備ができるまで 70 %etoh、4 ° C で店でカセットが水没します。
- エタノール (2 x 30 分ごと 70、95、および 100% の) の濃度の増加で脱水して組織を処理します。入浴 30 分 3 つシーケンシャル キシレン風呂のサンプル。
- 30 分の 3 連続パラフィン浴でサンプルが水没します。
- ウォーム アップ、カセット、慎重に展開し、レンズ ペーパーからエオシン染色組織を削除およびパラフィン浸透して組織をパラフィン ブロックに埋め込みます。簡単に断面を有効にする金型の底部にサンプルを置くように注意します。
- (5-8 μ m 厚) 必要に応じてミクロトームを使用して組織のセクションで、最適なエンジニア リング組織 (図 4) 標準的なプロシージャを使用して染色します。
注: パラフィン切片に代わるものが冷凍のブロックを使用してサンプルの形態が危険にさらされる可能性があります。3 h や試料が平衡 (例えば、一晩) まで PBS で 30% ショ糖の固定構成要素を配置します。1 h. 10 月の 70% を使用して媒体を凍結冷凍ブロックに構成要素を配置のために媒体を凍結 50/50 v 30% ショ糖と最適の切削温度 (OCT) ソリューションを交換プラスチック トレーの凍結迅速なブロックのドライアイス スラリーのエタノール。ブロックのセクション 10-50 μ m 厚いセクションをクライオスタットを。
8. 解析手法: セルの配置
注: セルの配置は、多くのネイティブの組織の定義機能を調節することが組織の形状と内部応力場を操作します。
- 興味のジオメトリと PDMS 金型のエンジニア リングの組織構成を準備します。
- 培養期間の終わりに、PBS で構造体を洗って、4% に修正 PF (手順 7.2 参照)、構造区分および組織 (セクション 7 を参照) によって画像の準備を収穫または全体染色をマウントします。
注: 全台紙染色組織学・免疫組織化学的に同様の手順に従いますが、長い潜伏期間を必要とする、染料、抗体、および任意のイメージング手法 (構造に光浸透深さ) などの浸透深さ経験的構造組成を決定する必要があります。 - 切片 (金型下部の平面に平行) の水平面内の向きし、興味のセルのためのマーカーの染色します。ファロイジンなどの f アクチン ラベルを使用して、ほとんどの種類の細胞のアクチン繊維の応力をマークします。また、細胞の特定のマーカーを使用します。
注: 設計された心臓ティッシュの場合向きだった α-アクチニンに染まったサルコメアによって決定されます。 - すべてのセルまたは関心領域における核の主要な軸を手動で評価または分析ツール (例えばImageJ、MATLAB)。
注: 場合によっては、(メッシュのような幾何学や「コア」「ノード」、「バンドル」領域)、円形ジオメトリの「エッジ」など幾何学によって、同じ構成要素のさまざまな地域を分類すると便利があります。
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Representative Results
レーザー カッターの光学系エッチング深さの増加と寸法は非常にわずかに減少するエッチング エリアとレーザー ビームの先を細くための結果金型の非常に微妙な傾斜が付いている壁。これはキャスト PDMS カビの除去を容易にするのに役立ちますが、負のマスター型を非常に深くエッチングする場合慎重に検討する必要があります (> 6 mm) が必須です (図 1)。
培養時間をかけて cellularized 構造がマトリックス割合と程度をこれに足場構成、セルの負荷によって異なりますが発生しますしかし、改造、培養条件により圧縮されます。
マトリックス改造再編と、周囲マトリックス (と同様の新しいマトリックスの沈着)、劣化を発生しますが、通常断面積の減少に伴う機械的剛性の増加に関連付けられています。1.6 mg/mL コラーゲンから成る 12 x 106心筋/mL コラーゲンだけの構造、構造がわかります 19.7 ± 2.8% 圧縮試金鋳造 (図 2) の後に 4 日間の最初の幅のコンパクト。この試金には、3 D プロセスの代表的な 2 D の近似値が得られます、データ収集と非破壊的な性質を容易すること構築開発プロセスを研究するための強力なツール。細胞の不在でも、細胞培養条件下コラーゲン力学することができます変更両方のため時間をかけて自己集合と架橋11。フィブリンは線溶系で急速に低下する可能性が両方との in vitro antifibrinolytic、アプロチニンまたはアミノカプロン酸12など存在にない場合。したがって、構造の定式化を選択するとき長期的組織開発と組織形成だけでなく足場のコンポーネントの影響を考慮する必要があります。金型設計と経験的に最終的な組織のサイズが特定のアプリケーションにとって重要な場合、圧縮を考慮されなければならないまた決定細胞型とマトリックスの組成に基づきます。その組織の圧縮することができますセルの配置 (図 4) を奨励する cellularized 構造で操作することができます組織内の応力場を誘導するも注意してください。
足場高分子濃度および初期細胞播種量の広い範囲は、文学、エンジニア リング組織を作成する使用されている、これは様々 な細胞の種類、細胞、およびアプリケーションのさまざまな要件に主に起因することができます。による由来心筋細胞と私たち自身の仕事に基づいて、我々 は信じているコラーゲン濃度 1.25 mg/mL と播種の ~ 1500 万セル/mL は良い開始点13。また、フィブリンは広く使用同様、心臓組織の足場材料として通常 3-4 mg/mL14の範囲で。アプリケーションによっては、要素の数に基づく細胞播種密度を選択可能性がありますが、ネイティブの組織の細胞の密度は良い参照ポイントを提供します。また高濃度細胞を特に量が少ないため、動作するように困難になることことを検討してください。特定のセル人口の足場の定式化を調整ことができます。一般的に高分子濃度を増やして組織も壊れているまたは分割圧縮、および組織が硬いまたは15をコンパクトに失敗したときに高分子濃度を増加させるとき。
文化の中にポイントいつでも受動的力学解析を実行する前に、機械的に構築サンプル前提、裏付けに適切なことがあります。天然高分子ゲルの前処理・設計組織が材料の粘弾性によりテスト結果の再現性を高める・ コンストラクトが臨床で示すプロパティのより良い指標を提供アプリケーション。力学的評価 (図 3) を開始する前に 10% のひずみ/分の速度で三角形の波形に 10% ひずみの 8 サイクルを使用します。
組織と細胞型の特定の形態は、従来の方法で組織および免疫組織化学によって評価できます。しかし、我々 は、パラフィン加工、埋め込み、断面、抗原検索、染色が必要されていると比較して設計された心筋細胞をメッキまたはネイティブ断面のほぼすべての手順の最適化を発見した組織 (図4)。
図 1: 設計・ レーザーから PDMS 金型製作プロセスのアウトライン カット アクリル マスター 。(A) モールド設計ベクトル グラフィックス形式で準備します。(B) クリーニング レーザー エッチング アクリル否定的なマスターです。(C) PDMS は録音されたアクリル マスター金型の表面にキャストします。(D) 結果 PDMS カビ培養前に殺菌のため準備ができています。Inset: 平面図、同じスケールします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 文化の時間をかけて圧縮を作成します。(A) 文化に時間をかけて帳票の最適化の準備長方形の構造の画像。緑のオーバーレイが表す画像解析の表示構成領域を計算するために使用するマスク。(B) 面積 (構造圧縮の二次元測定基準) 時間をかけて構成のプロット。水平の線は平均値を表し、エラーバーは標準偏差を示します。すべてのグループ、n = 3、* pを示します < 0.05 分散分析により評価。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 人工心臓組織の力学特性評価の生のトレース。インセットは、単一の代表的な筋収縮トレース (主要なプロットとして同じ軸) を表示します。(A) アクティブな力学応答 5% ひずみ増分で保持しているに続いて急速な手順から生じる。(B) 受動的力学応答 10% ひずみ/分の速度で引きを破るテストから生じる。すべてのサンプルはタイロード液の 37 ° C お風呂に行った。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:パラフィンは、様々 なデザインの人工心臓組織構造組織画像をブロックします。様々 なデザインの設計された心臓ティッシュの構成要素のパラフィン ブロック組織画像染色 (A) ヘマトキシリンとエオシン、(B) ジアミノベンジジン (抗心筋トロポニン T、ブラウン)、ヘマトキシリン核対比染色 (C) picrosirius 赤染色対比高速グリーン細胞質染色および (D) マウス抗 α-アクチニン抗体 (緑) 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核対比染色 (青) とコラーゲン。セルの配置は、構造設計と組織の圧縮の結果として異なります。スケール バーでは B と C に同様に適用されます。D のはめ込みは、横紋筋性心筋細胞を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
組織培養と互換性のあるカスタムの PDMS 金型形状はあるセルの配置、拡散率、有効剛性などの重要なエンジニア リング組織プロパティをチューニングするための素晴らしいユーティリティです。さらに、これらの金型、ジオメトリは機械的テスト16,17など、重要な分析アプリケーションの組織を準備するため非常に便利です。否定的なマスター金型を提供しています時間と伝統的な微細加工に関連するコストと比べると、これらのツールを利用した迅速・簡便には、・低コスト法をカット レーザーからこれらのデバイスの準備します。レーザー切断は、カッターのベッドのサイズによってのみ制限さ最大金型の大きいサイズも可能です。我々 は正常にさまざまな設計された心臓ティッシュ、活動電位伝搬の光学マッピング、力生産とパッシブの機械的特性、および注入の評価などの研究を実行するのにこれらの汎用性の高い金型を使用しています。心筋梗塞13,18のラット モデル。心血管再生工学研究のニッチを超えて、薬剤・材料研究フィールド組織工学アプリケーションが広大なことと認識しています。
自分自身金型の作製にいくつかの技術的に挑戦的な手順がありますが、機能的な組織を作成するのに関与するいくつかの重要な手順があります。24 h 後周囲のマトリックスをコンパクトに構成が失敗した場合は、まず生存率は設計組織の染色によって細胞の生存率を確認します。細胞生存率が高い場合は、組織の次のセットの構造の組成を変更することを検討してください。結果は、細胞集団によって大きく異なりますが、一方我々 は、播種密度は高く、コラーゲン濃度に関連付けられている増加された圧縮を観察しました。最後に、圧縮を奨励する、線維芽細胞などの行列が改造に適していますセル型と共にシード セル人口を補うために役立ちますがあります。
これらの型の 1 つの制限です小さな疎水性の分子を吸着する PDMS の可能性です。我々 のアプリケーションにこれは問題となっていないが、これらの分子の損失に非常に敏感な試金の心配のそれかもしれません。これらのケースで、polyhydrophilic または polyzwitterionic 材料19などの防汚剤による PDMS タンパク質吸着を軽減できます。また、滅菌 PDMS 金型は、アガロースなどの別の非吸着素材でキャストする文化型の (レーザー エッチングの肯定的な金型) から否定的なマスターとして準備でした。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は NIH R00 HL115123 とブラウン大学工学部からの資金を認めます。彼らは訓練のためブラウン デザイン ワーク ショップおよびクリス牛に感謝しています、レーザー カッターでサポートします。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
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