Summary
Här presenterar vi en snabb lättköpt och billig metod för att fabricera anpassade Polydimetylsiloxan formar som kan användas för att producera hydrogel-baserade bakåtkompilerade vävnader med komplexa geometrier. Dessutom beskriver vi resultat från mekanisk och histologiska bedömningar genomförs på bakåtkompilerade hjärt vävnader produceras med hjälp av denna teknik.
Abstract
Eftersom fältet av vävnadsteknik har fortsatt att mogna, har man ökat intresse för ett brett utbud av vävnad parametrar, inklusive vävnad form. Manipulera vävnad form på Mikrometern till centimeter skala kan direkt celljustering, ändra effektiv mekaniska egenskaper och hantera begränsningar relaterade till näringsämnen diffusion. Fartyget som en vävnad är förberedda kan dessutom förmedla mekaniska begränsningar på vävnad, vilket resulterar i stress fält som ytterligare kan påverka både cellen och matrix struktur. Formade vävnader med mycket reproducerbara mått har också verktyg för in vitro- analyser i vilka prov dimensioner är kritiska, såsom hela vävnad mekanisk analys.
Detta manuskript beskriver en alternativa fabrication metod utnyttjar negativa master formar beredd från laser etsade akryl: dessa formar utföra väl med Polydimetylsiloxan (PDMS), tillåta mönster med dimensioner på centimeter omfattning och funktion storlekar mindre än 25 µm, och kan snabbt utformas och tillverkas till en låg kostnad och med minimal kompetens. Minimal tid och kostnad krav möjliggör laser etsade formar att vara snabbt upprepade vid tills en optimal design bestäms och anpassas enkelt till någon analys av intresse, inklusive de utanför området för vävnadsteknik.
Introduction
Under de senaste två decennierna, har mjuk litografi använts flitigt som en fabrication teknik för att stödja vetenskaplig forskning, särskilt inom områdena mikrofluidik, materialforskning och tissue engineering1,2, 3. Replika molding, där ett objekt med en önskad form skapas från en negativ herre mögel, erbjuder en bekväm och billig metod för att producera positiva PDMS replikerar som kan användas för gjutning formade hydrogels. Dock krävs negativa master formarna tillverkas vanligtvis med mikrofabrikation tekniker som är dyrt, tidskrävande, storlek, begränsad och kräver renrum utrymme och sofistikerad utrustning. Även 3D-printing erbjuder ett potentiellt alternativ, är dess nytta något begränsad på grund av billigare skrivare och kemiska samspelet mellan vanliga 3D-skrivare polymerer och PDMS som kan hämma bota resolution gränser.
Laser skärare system kan både skära och etsning material såsom plast, trä, glas och metall har nyligen blivit drastiskt billigare och därför mer lättillgänglig för fabricera forskningsverktyg. Kommersiell kvalitet laserskärare klarar av att tillverka objekt på centimeter skala med minsta funktioner som är mindre än 25 µm, och ytterligare kräver minimal utbildning, kompetens och tid att använda. Medan laser ablation av PDMS har tidigare använts vid tillverkning av mikrofluidik enheter, enligt vår kännedom har inga manuskript beskrivit en process genom vilken millimeter och centimeter skala formar kan fabriceras från laserskurna negativa master formar4 .
Vi har använt denna teknik främst för att ändra formen på bakåtkompilerade vävnader för att förbättra näringsämnen diffusion, cellulär anpassning och mekaniska egenskaper5,6,7. Mångsidigheten hos denna teknik tillåter dock för ett utnyttjande i något fält som var gjuten hydrogeler är av intresse, såsom drug delivery och material science forskning8. Med tillgång till en laserskärare, PDMS mögel replikat kan göras för nästan alla geometri utan överhäng (som skulle hämma borttagning utan ett flerdelat mögel, som är utanför ramen för detta manuskript) och som passar med mått av laser sängen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. skapa de vektor Format Master Mold mönster
- Montera den önskade form geometrin i vektorformat med en vektor grafik-program (se material, utrustning, och mjukvaran bord). Välj fil | Nya och skapa en duk av lämpliga dimensioner med RGB-färgformat. Skapa önskad geometri med formverktygen i panelen till vänster: Ange önskade dimensioner längst upp i fönstret (klicka på transform knappen på toppen om inte initialt synliga) att exakt definiera formen storlekar.
Obs: Mögel geometrier bör tillåta minst en 6-mm gränsen mellan kanten på de yttersta funktionerna och såglinjen att tillåta trimning av PDMS menisken efter mögel gjutning. Detta gör att den färdiga mögel att lägga jäms med botten av en kultur maträtt. Ytterligare, mögel geometrier bör ta hänsyn begränsningar är associerad med laser skärare modellen som ska användas, inklusive sågspåret bredd och minsta storleken. Den laser som används för det arbete som beskrivs häri (se material, utrustning, och mjukvaran bord) innehöll en 0,2 mm snittyta bredd och en minsta etsade funktionen storlek 25 µm (maximal DPI 1000). Mögel dimensioner kan väljas för att rymma en önskad kultur fartyg, till exempel en 10-cm skålen eller 6 - eller 24 brunnar. - Öppna färgväljaren i det övre vänstra hörnet av fönstret och definiera nya färgrutor som är kompatibel med programvaran laser skärare.
Obs: Vi använder röd (RGB-255, 0, 0) för kapning och blå (RGB 0, 0, 255) för etsning. Ytterligare färgrutor kan definieras beroende på krav på utformning (t.ex. om mer än en etsning djup önskas).- Tilldela skärbanor dessa swatch färger genom att välja sökvägen och sedan skära färgrutan för den sökväg färgen och [Ingen] för fyllningsfärg i färgväljaren.
- På samma sätt tilldela swatch färger till etsning sökvägar genom att markera objektet och sedan välja etsning sökvägen för Fyllningsfärg och [Ingen] för sökvägen färg från färgväljaren.
- Spara mönster som either.ai or.pdf format, beroende på den vektor grafik program och laser skärare kompatibiliteten (figur 1A och Kompletterande fil).
2. laserskuren akryl Master formarna
- Välj ett negativt herre mögel material.
Obs: Kvartalet-tums tjock akryl lämpar sig väl till denna ansökan på grund av dess förenlighet med laserskärning, relativt låg kostnad, och tjocklek vilket möjliggör funktioner upp till ~ 5.5 mm i höjd. Dock andra material som uppfyller följande krav får användas samt: (i) icke-reaktivt med PDMS bota; (ii) icke-porösa/starkt lim härdade PDMS; (iii) skär och etsar rent med en laserskärare; (iv) upprätthåller en glasartad staten upp till 60 ° C; (v) med en tjocklek som är kompatibel med önskad maximal funktion höjden. - Förbereda laserskärare för kapning enligt tillverkarens specifikationer. Se till att tillräcklig ventilation används och att sängen höjd är kalibrerade till valt negativa herre mögel materialets tjocklek.
- Öppna filen design i en vektorer grafik-program på datorn ansluten till laserskärare och klicka filen | Skriv ut. Se till att laserskärare är inställd som skrivaren och att ”Göra inte skala” är markerad i den skalning nedrullningsbara menyn att förhindra snedvridning av designen innan du klickar på knappen Skriv ut längst ned i dialogrutan utskrift.
- Klicka på knappen Inställningar i det nedre högra hörnet i laser skärare utskrift verktyget. Tilldela kraft, hastighet och pulser per tum (PPI) inställningar till var och en av de tidigare valda färgerna till cut/etch parametrar för alla designfunktioner.
Obs: Här, laserskärare utrustad med en 75 W laser (se material, utrustning, och mjukvaran bord), används inställningarna för följande: 100% effekt, 1% hastighet och 1 000 PPI skär rent genom ¼ ”akryl; 100% effekt, 8% hastighet och 500 PPI etsningar till ett djup av 2,75 mm i akryl; och 100% effekt, 5% hastighet, 500 PPI etsningar till ett djup av 3,50 mm i akryl. Om okänd för en laser skärare konfiguration eller material, kan dessa parametrar bestämmas empiriskt genom trial and error med ett provstycke. - Klicka på den stora gröna knappen i laser skärare programvaran till laser etch och minska negativa master formarna.
- Förbereda negativa master formarna för PDMS gjutning genom att ta bort eventuellt kvarvarande skärande skräp med små borstar eller tryckluft (figur 1B).
3. Förbered PDMS formarna för Cell eller vävnad kultur
- Förbereda en PDMS gjutning blandning enligt dess tillverkarens specifikationer. Förbereda 0,35 mL/cm2 av herre mögel; Detta kommer att variera beroende på mögel funktioner och höjd.
- Degas den beredda PDMS i en vakuumkammare anslutna till en standard lab vakuum linje (< 500 mmHg) för 1 h, eller tills alla bubblor har eliminerats.
- Tejpa den yttre kanten av formen med vinyl eller maskeringstejp (färgade etikett tejp fungerar bra) så att tejpen utökar > 3 mm ovanför etsade ansiktet av negativa master mögel. Tryck på tejpen ordentligt mot mögel att förhindra läckage senare sida.
Obs: Om den akryl herre mögel har genomgående hål, kan det behöva applicera tejpen till botten av mögel samt (figur 1 c). - Häll den avgasade PDMS över etsade ansiktet av negativa master mögel.
Obs: Målet PDMS tjocklek beror på programmet, men tjock PDMS mögel bottnar kan göra imaging utmanande. En minsta tjocklek på ~ 1,5 mm en god balans mellan imaging överväganden och användarvänlighet mögel borttagning. - Placera den PDMS-belagd negativa herre mögel i en vakuumkammare och lufta igen i 1 h eller tills alla bubblor har eliminerats.
- Placera den avgasade PDMS-belagd negativa herre mögel i en 60 ° C ugn att bota för minst 6 h. se till att ugnen hyllan är nivå. Alternativt kan tillåta PDMS att bota vid 37 ° C över natten, eller vid omgivningstemperatur för ~ 72 h.
- Om flera formar kastades på den samma negativa herre mögel, Använd ett rakblad för att skära dessa formar apart medan de är fortfarande på den negativa herre mögel. Dra sedan, varje PDMS mögel bort av den negativa herre mögel. Säkerställa att PDMS formar samlas långsamt och försiktigt att förhindra mögel funktionen Riva under samlingen.
- Med ett rakblad, trimma bort regioner med menisken från gjutning, som skulle förhindra mögel från liggande platt, liksom alla överflödigt material eller skräp (figur 1 d).
- Om nödvändigt, utarbeta formar för cell/vävnad gjutning i autoklav.
4. kasta av kollagen och Fibrin Hydrogel vävnader
Obs: Använd en korrekt aseptiska förfarande för att upprätthålla sterilitet.
- Följa formarna till botten av önskad fartyget. Följ nya formar till botten av en icke-vävnadskultur behandlade plattan genom att trycka ordentligt på mögel mot obehandlad plast (på grund av den vattenavvisande egenskaper av PDMS).
Dock om vävnadsodling behandlat polykarbonat är att användas, eller vid återanvändas formar, som tenderar att följa mindre fast, ett naturligt eller syntetiskt lim (såsom fibrin eller silikon tätningsmedel botas natten) kan användas för fastsättning. - Förbereda fibrinogen och trombin neutraliserat kollagen gjutning lösningar så att önskad koncentration av varje kommer att uppnås i cast vävnaden. Hålla kollagen på is tills gjutning.
Obs: Fibrinogen och trombin bör inte tillåtas att blanda förrän omedelbart före gjutning. Om det behövs kan de fibrinogen och trombin lösningarna även kylas för att öka tiden för polymerisation. Vi har använt en sista fibrinogen koncentration mellan 0-8 mg/mL, en slutlig trombin koncentration mellan 10-100 U/mL och en slutlig kollagen koncentration mellan 0,8 - 2,0 mg/mL (figur 2). För bakåtkompilerade hjärt vävnader, använder vi ofta hjärtmuskelceller på 12 x 106 celler/mL med 1,6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinogen och 20 U/mL trombin (trombin läggs omedelbart före gjutning). Optimala koncentrationer (även utanför dessa föreslagna intervall) bör bestämmas empiriskt. - Skörda celler efter standardprotokoll och resuspendera vid en koncentration som är lämpliga för att uppnå önskad första cell densiteten i cast vävnaden.
Obs: Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived hjärtmuskelcellerna skördades som beskrivs i Lian o.a. 9 håll skördade cellerna på is. Cellvolym skall redovisas när du förbereder cellsuspension. Vi har använt cell koncentrationer från 9-18 x 106 celler/mL, men optimal spänner förväntas variera med cell befolkningen (figur 2). - Kombinera den fibrinogen neutraliserat kollagen och cellsuspension (se punkt 4.2 för ett exempel) för att skapa en gjutning mix. Håll gjutning mixen på is.
Obs: Fibrinogen och trombin temperaturer och koncentrationer avgör polymerisation kinetik; för att förhindra polymerisation under gjutning, kan det vara nödvändigt att utarbeta separata satser av gjutning blandning beroende på antalet och volymen av de konstruktioner som kommer att kastas. - Behandla ytorna av mögel som kommer att utsättas till gjutning mixen att mildra PDMS vattenavvisande egenskaper (PDMS vattenavvisande egenskaper kommer att öka protein adsorption och försvåra gjutning).
- Uppnå hydrofil ytmodifiering genom att behandla med syre plasma, som med en handhållen högfrekvens-generator (t.ex., BD-20A från Litton Engineering). Exponera alla ytor av mögel som kontaktar cell/gel blandningen till plasmabehandling för 3-5 s, ca 5 min före gjutning.
- Alternativt behandla med ett ytaktivt ämne, som Pluronic F-127 (1% w/v)10. Utföra ytbehandling som nära gjutning tiden som möjligt, som förändringen i polaritet kommer att försämras över tid.
- Omedelbart före gjutning, lägga till trombin till gjutning mixen och blanda grundligt genom pipettering upp och ner utan att införa bubblor.
- Arbeta snabbt, Pipettera gjutning blandningen i formarna, med omsorg för att sätta in blandningen i alla hörn och skrevor av mögel. Undvika pipett utmatning bortom det första stoppet att förhindra bubbla bildandet inuti konstruktioner.
- Upprepa steg 4.6 och 4.7 som behövs för eventuella ytterligare partier av gjutning mix.
- Placera vävnadsodling fartyget i en 37 ° C inkubator för 45 min. Om inkubatorn inte är väl fuktad, deponera cell media runt formarna före inkubering att förhindra konstruera uttorkning.
Obs: Typ av cell media beror på celltyp, men för bakåtkompilerade hjärtvävnad konstruktioner använder vi RPMI 1640 + B27 tillägg. - Efter 45 min, återgå konstruktioner till huven och täck med cell media innan han återvände till inkubatorn.
- Ändra cellen media varje 48-72 h som behövs för cellen och konstruera typen.
Obs: Media förändring bör planeras enligt rekommenderade instruktionerna som tillhandahålls av leverantören att säkerställa maximal cell hälsa. Var försiktig när du ändrar media för att undvika störande konstruktioner. Vi har inte upplevt problem med konstruktioner flytande, men om detta inträffar, den kan förebyggas genom att lägga till höga inlägg till mögel design som sträcker sig utöver nivån som media. - Efter användning, tvätta formarna sekventiellt med 10% blekmedel, 70% etanol, och destillerat vatten. Sedan luften torr samt autoklav för återanvändning upp till ~ 10 gånger.
5. analys tekniker: Vävnad packning
Obs: Packning resultera från matrix remodeling är en indikator på vävnad livskraft och utveckling som lätt kan mätas genom optisk mikroskopi och bild analys.
- Samla optisk mikroskopi bilder av konstruktioner i formarna på tidssteg som sträcker sig från 2 h till 96 timmar efter gjutning.
Obs: På grund av den låga graden av förstoring krävs, dissektion Mikroskop med en kamera mount är väl lämpad för denna applikation. - Spåra synliga konstruera området i en bild analys Svit såsom ImageJ (öppen källkod, imagej.nih.gov/ij/).
- Analysera den takt och slutliga graden av komprimering (figur 2).
6. analys tekniker: Tensile tester
Obs: Båda aktiva mekanik (krafter eller stammar som genereras av en konstruerad vävnad på grund av cellsaktivitet) och passiv mekanik (krafter eller stammar som genereras som svar på tillämpad stammar eller styrkor) är kritisk funktionella egenskaper hos många konstruerad vävnader, och detta gäller särskilt för bakåtkompilerade hjärt vävnader. Mikromekaniska analysatorn används för analyserna beskrivs i Tabell för material. Andra mekaniska tester apparaturar kunde tillämpas på motsvarande sätt förutsatt att de möjliggör hydrerad testning och klarar av att kontroll av längd och tvinga mätningar över spänner och resolutioner relevanta för vävnaden. För vävnader med tvärsnittsarea på order av enda kvadratmillimeter och stiffnesses storleksordningen tiotals kPa är en 5 mN lastcell en bra passform. Större och hårdare material skulle kräva en större lastcell. Före testning, se till att både kraftgivare och längd controller är kalibrerade.
- Slå på längd handkontroll, tvinga givaren, pulsgenerator och temperatur styrenhet.
- Fyll i mekanisk provning tråg med Tyrodes lösning (1,8 mM kalciumklorid, 1,0 mM magnesiumklorid, 5.4 mM kaliumklorid, 140 mM natriumklorid, natriumfosfat 0,33 mM, 10 mM HEPES och 5 mM glukos i ddH2O, pH justeras till 7,4) för Engineered hjärt vävnader. Justera termoelementet sådan att en bad temperatur av 37 ° C uppnås.
- Ladda en mekanisk provning protokoll för aktiv sammandragning datainsamling.
Obs: Vi har utvärderat aktiva kontraktila mekanik med en längd steg protokoll i vilken längd steg i 5% stam ökar upp till 30% hålls för 120 s för att utvärdera effekterna av påfrestningar på kontraktion kraft (figur 3A). Dessutom har vi utvärderat passiva mekaniska egenskaper genom en pull-to-break protokoll ständiga påfrestningar uppgå till 10% stam/min (figur 3B). Båda dessa protokoll kan fungera som bra utgångspunkter för aktiv och passiv mekanisk analys. - Omfattas en dissektion, försiktigt loss den bakåtkompilerade vävnad bygga från PDMS mögel, så att det flyter fritt.
Obs: Cellularized konstruktioner som har genomgått vävnad packning kommer sannolikt redan vara fristående från interiör mögel ytor, och i dessa fall krävs minimal manipulation.- Om packning inte har orsakat konstruktionen att släppa, använda pincett försiktigt separera konstruktionen från sidor och botten av mögel att undvika att skada vävnaden.
- Med pincett, försiktigt plocka upp konstruktionen och överföra det till mekanisk provning badet.
- Visning konstruktionen genom dissektion Mikroskop, montera ände av konstruktionen att krokarna bifogas kraftgivare och hävarm.
- Justera spaken arm position med micromanipulator tills bygga är placerad utan tillämpad stam. Noll längd handkontrollen och tvinga controller.
- Bild konstruktionen genom dissektion tillämpningsområdet så att måtten på konstruktionen kan mätas via bildanalys.
- Initiera protokollet aktiv kraft och spara de insamlade data när protokollet har slutförts (figur 3).
- Om passiv mekaniska data krävs samt justera hävarmen igen tills det finns noll tillämpad stam. Noll längd och tvinga styrenheter och bild bygga en andra tid före lastning och initiera passiva mekanik protokollet (figur 3). Spara insamlade data.
7. analys teknik: Paraffin histologi och immunohistokemi
Obs: Vi har haft störst framgång i imaging bakåtkompilerade vävnadssnitt med paraffinblock så att vävnaden morfologi är bäst bevarad. Alla steg i processen måste noga beaktas och anpassade till den bakåtkompilerade vävnad, inklusive behandling prover utan vakuum eller tryck, empiriskt bestämma lämpligt antigen retrieval metoderna och titrering av primär antikropp koncentrationen. Andra tekniker, såsom att använda frysta block för att förbereda bilder, kan kräva mindre tid och kostnad samtidigt som ger tillräckligt resultat beroende på den avsedda användningen.
- Omfattas en dissektion, försiktigt loss den bakåtkompilerade vävnad bygga från PDMS mögel använder tången gled mellan konstruktion och PDMS försiktigt separera det från PDMS, så att det flyter fritt. Överföra dessa konstruktioner i en mikrocentrifug rör för fixering.
Obs: Bräcklig konstruktioner eller de ska fästas på statiska stress villkor som tillhandahålls av mögel själv får fastställas i mögel genom att ändra lösningar i kulturen väl och ta bort konstruktionen från mögel efter fixering. - Omedelbart åtgärda bakåtkompilerade vävnaderna genom att dränka i 4% PARAFORMALDEHYD (PF) under 10 minuter vid rumstemperatur. Uppskatta inte mer än 1 h per 1 mm av vävnad tjocklek; fixa inte alltför.
- Skölj vävnader med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Att hålla vävnaden våt, placera en droppe av eosin på att färga det rosa för 10-30 s, och skölj sedan med 70% etanol.
Obs: Den rosa färgen hjälper till att identifiera det i blocket paraffin för snittning senare och kommer att spolas bort under avparaffinering. - Wrap vävnaden i linsen papper och plats i en kassett som histologi. Använd skum kuddar i kassett som behövs för att hålla vävnaden platta.
- Dränka kassetten i 70% EtOH och förvaras vid 4 ° C tills redo för paraffin behandling.
- Bearbeta vävnaden av uttorkande det i ökande koncentrationer av etanol (2 x 30 min varje 70, 95 och 100%). Sedan bada prover i tre sekventiella xylen bad för 30 min varje.
- Dränka proverna i tre sekventiella paraffin bad för 30 min varje.
- Värma upp korgarna, noggrant utvecklas bort eosin-färgade vävnaden från objektivet papperet och bädda in paraffin-infiltrerade vävnaden i ett paraffin-block. Var försiktig med att lägga provet platt på botten av formen för att lättare snittning.
- Avsnitt vävnader med hjälp av en mikrotom som önskas (5-8 µm tjock) och fläckar med hjälp av standardprocedurer optimerad för bakåtkompilerade vävnaden (figur 4).
Obs: Ett alternativ till paraffin avsnitt är att använda frysta block, även om morfologi av provet kan äventyras. Placera de fasta konstruktioner i 30% sackaros i PBS i 3 tim eller tills preparatet är skakad (t.ex.över natten). Utbyta lösningen med 50/50 v/v 30% sackaros och optimal skärtemperatur (ULT) frysning medium för 1 h. Placera konstruktioner i frysta block med OCT frysning medium med en 70% EtOH med torris flytgödsel för snabb block frysning i plastbrickor. Avsnitt block med en kryostat för 10-50 µm tjocka sektioner.
8. analys teknik: Celljustering
Obs: Manipulera vävnad form och inre stress fält kan modulera celljustering, en definierande funktion av många infödda vävnader.
- Förbereda de bakåtkompilerade vävnad konstruktioner i PDMS formar med geometrier sevärdheter.
- I slutet av perioden kultur, tvätta konstruktioner i PBS, fixa i 4% PF (se steg 7,2) och skörda konstruktioner förbereda för avbildning av snittning och histologi (se avsnitt 7) eller hela montera färgning.
Obs: Hela mount färgning följer liknande steg till histologi/immunohistokemi men kräver längre inkubation och genomträngningsdjupet av färgämnen, antikroppar och eventuella imaging tekniker (såsom lätta genomträngningsdjupet in konstruktioner) kommer behöver fastställas empiriskt för konstruera sammansättningen. - Orient avsnitten vävnad i horisontalplanet (parallellt med mögel botten plan) och fläcken för en markör för cellen i intresse. Använda en f-aktin etikett, till exempel phalloidin, att markera aktin stress fibrerna i de flesta celltyper. Alternativt använda en cell specifik markör.
Obs: När det gäller bakåtkompilerade hjärt vävnader, orientering bestämdes av sarkomerer färgas med α-actinin. - Bedöma huvudaxeln av alla celler eller kärnor i regionen sevärdheter manuellt eller använda en analys verktyg (t.ex., ImageJ, MATLAB).
Obs: Det kan vara användbart att kategorisera olika regioner i samma konstruktion, beroende på geometri såsom (”node” och ”bundle” regioner i en mesh-liknande geometri, eller ”core”) och ”edge” i en cirkulär geometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optiken i laserskärare kommer att orsaka etsade områden har minskat mycket något mått som etsning djup ökar, och resultaten i mögel väggar med en mycket subtil avfasning, tack till nedtrappning av laserstrålen. Detta kommer att bidra till att underlätta avlägsnande av cast PDMS formarna, men bör övervägas noggrant om mycket djupt etsade negativa master formar (> 6 mm) är krävs (figur 1).
Över tid i kultur, cellularized konstruktioner kommer kompakt på grund av matris remodeling, även om hastigheten, och som detta inträffar beror på byggnadsställning sammansättning, cell belastning, och odling villkor.
Matrix remodeling kan uppstå både genom omorganisation och nedbrytning av den omgivande matrix (liksom nedfall av ny matris), men är vanligtvis förknippas med en ökning av mekaniska stelhet på grund av minskningen i tvärsnittsarea. Med kollagen-bara konstruktioner består av 1,6 mg/mL kollagen och 12 x 106 hjärtmuskelcellerna/mL, ser vi konstruktioner kompakt 19,7 ± 2,8% av sin ursprungliga bredd under de fyra dagar efter gjutning (figur 2) via packning analysen. Medan denna analys ger en representativ 2D tillnärmning av en 3D-processen, en enkel datainsamling och icke-destruktiv karaktär gör det ett kraftfullt verktyg för att studera konstruera utvecklingsprocessen. Observera att under cell kultur förhållanden, även i avsaknad av celler, kollagen mekanik kan förändras över tiden på grund av både självmontering och tvärbindande11. Fibrinvävnadslim kan vara snabbt brutits ner genom fibrinolys både i vivo och in vitro- om inte i närvaro av en antifibrinolytiska, såsom aprotinin eller aminokapronsyra syra12. Effekterna av byggnadsställning komponenter på lång sikt vävnad utveckling, och inte bara vävnad formation, bör därför övervägas när du väljer en konstruera formulering. Om slutliga vävnad storlek är viktigt för en viss tillämpning, packning måste också beaktas i mögel design och empiriskt bestäms baserat på cell typ(er) och matrix sammansättning. Observera att vävnad packning kan också inducera stress fält inom den vävnad som kan manipuleras i cellularized konstruktioner att uppmuntra celljustering (figur 4).
Ett brett utbud av byggnadsställning polymer koncentrationer och inledande cell sådd tätheter har använts för att skapa bakåtkompilerade vävnader i litteraturen, och detta kan tillskrivas främst olika krav för olika celltyper, cell linjer och program. Baserat på vårt eget arbete med hiPSC-derived hjärtmuskelceller, anser vi att en kollagen koncentration av 1,25 mg/mL och en sådd densitet på ~ 15 miljoner celler/mL är en bra start punkt13. Alternativt, fibrin används allmänt som ett hjärtvävnad byggnadsställning material samt, vanligtvis i intervallet 3-4 mg/mL14. Cell sådd densitet kan väljas baserat på ett antal faktorer beroende på applikation, men cellen tätheterna av infödda vävnader ger en bra referenspunkt. Också överväga att högkoncentrerad cell lösningar kan bli utmanande att arbeta med, speciellt för små volymer. För en viss cell befolkning, kan byggnadsställning formuleringen stämmas; generellt genom att öka polymer koncentrationen när vävnader är alltför bräcklig eller bryta vid packning och öka polymer koncentrationen när vävnaderna är för stel eller misslyckas att komprimera15.
Innan du utför passiv mekanisk analys helst punkt under kultur, kan det vara lämpligt att mekaniskt förutsättning konstruera provet. Prekonditionering av naturlig polymer hydrogels och manipulerade vävnader kommer att öka reproducerbarheten för testning resultatet på grund av materiella viskoelasticitet och ge en bättre indikation på de egenskaper som konstruktionen ställer ut i en klinisk ansökan. Vi använder 8 gånger av 10% stam i en triangulär vågform med en hastighet av 10% stam/min före start mekanisk bedömning (figur 3).
Vävnad och celltyp specifik morfologi kan bedömas genom histologi och immunhistokemi med traditionella metoder. Men vi har funnit att optimering av nästan alla steg i den paraffin bearbetning, inbäddning, snittning, antigen retrieval och färgning har varit nödvändigt för de bakåtkompilerade hjärtvävnad jämfört med förkromad celler eller sektioneras infödda vävnad (figur 4).
Figur 1 : Översikt över processen för att utforma och förbereda PDMS formar från laser skär akryl masters. (A) mögel design tillagas i vektorgrafikformat. (B) rengjorda laser etsade akryl negativa master. (C) PDMS gjutna på ytan av den tejpade akryl herre mögel. (D) resulterande PDMS mögel redo för sterilisering före vävnadskultur. Infällt: ovanifrån, samma skala. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Konstruera packning över tid i kultur. (A) bilder av rektangulära konstruktioner som förberett i tre exemplar komprimering över tid i kultur. Gröna överlägg representerar masker som används för att beräkna synliga konstruera området för bildanalys. (B) tomt bygga området (en tvådimensionell metrisk konstruera packningsgrad) över tid. Horisontella linjerna representerar medelvärden och felstaplar visar standardavvikelsen. För alla grupper, n = 3 och * indikerar p < 0,05 som utvärderas av ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Raw spår för mekaniska karaktärisering av bakåtkompilerade hjärt vävnader. Inläggningar visas en enda representativa twitch kontraktion trace (samma axlar som viktigaste tomt). (A) aktiv mekaniska svar följd av snabba steg följt av håller på 5% stam steg. (B) passiv mekaniska svar som härrör från ett pull-to-break test med en hastighet av 10% stam/min. Alla prover analyserades i ett 37 ° C bad Tyrodes lösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Paraffin blockera histologi bilder för bakåtkompilerade hjärtvävnad konstruktioner av olika konstruktioner. Paraffin blockera histologi bilder för bakåtkompilerade hjärtvävnad konstruktioner av olika mönster färgas med (A) hematoxylin och eosin, (B) Diaminobenzidin (anti hjärt troponin T, brown) och hematoxylin nukleära motfärg, (C ) picrosirius röda fläcken för kollagen med snabb grön cytoplasmiska motfärg, och (D) musen anti-α-actinin antikropp (grön) och 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) kärntekniska motfärg (blå). Celljustering skiljer sig till följd av den konstruera design och vävnad packningen. Skalstapeln i A gäller B och C samt. Infälld i D visar tvärstrimmig hjärtmuskelcellerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anpassade PDMS mögel geometrier som är kompatibla med vävnadskultur har stor nytta i att trimma viktigt bakåtkompilerade vävnad egenskaper, till exempel celljustering, diffusion ränta och effektiv stelhet. Dessutom, är dessa formar mycket användbara för att förbereda vävnader analys tillämpningar där geometri är viktiga, såsom mekanisk provning16,17. Förbereda dessa enheter från laser skär negativa master formar erbjuder en snabb, lättköpt och billig metod att utnyttja dessa verktyg, särskilt i jämförelse med tiden och kostnaderna associerade med traditionella mikrofabrikation. Laserskärning tillåter även en större maximal mögel storlek, endast begränsas av säng storleken på fräsen. Vi har framgångsrikt använt dessa mångsidiga formar för att utföra en mängd olika studier med bakåtkompilerade hjärt vävnader, inklusive optisk kartläggning av aktionspotentialens spridning, bedömning av kraft produktion och passiv mekaniska egenskaper och implantation i en råtta modell av hjärtinfarkt13,18. Vi inser att utöver den forskning nischen av kardiovaskulära regenerativ teknik, programmen för fält vävnadsteknik, drug delivery och materialforskning är stora.
Medan det finns några tekniskt utmanande steg vid tillverkning av formar sig, finns det ett antal kritiska steg involverad i att skapa funktionella vävnader. Om konstruktioner inte kompakt omgivande matrisen efter 24 h, först bekräfta cellviabiliteten genom livskraft färgning av bakåtkompilerade vävnader. Om cellernas viabilitet är hög, överväga att ändra konstruera sammansättningen för nästa uppsättning av vävnader. Medan resultaten kommer att variera kraftigt beroende på cell befolkningen, har vi observerat ökad kompaktering är associerad med högre sådd densiteter och lägre kollagen koncentrationer. Slutligen, det kan också vara användbart att komplettera seedade cell befolkningen med en celltyp som lämpar sig väl för matrix remodeling, såsom fibroblaster, för att uppmuntra packning.
En begränsning med dessa formar är potentialen för PDMS att adsorbera små hydrofoba molekyler. Medan för våra applikationer inte har detta varit problematisk, kan det vara oro i analyser mycket känslig för förlust av dessa molekyler. I dessa fall kan PDMS protein adsorption lindras genom behandling med en bottenfärg agent såsom polyhydrophilic eller polyzwitterionic material19. Alternativt kunde en steriliserad PDMS mögel förberedas som en negativ master (från en lasergraverade positiva mögel) för en kultur mögel att kastas i en annan, icke-adsorbent material, såsom agaros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering från NIH R00 HL115123 och Brown University School of Engineering. De är också tacksamma till Brown Design Workshop och Chris Bull för utbildning och stöd med laserskärare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
