Summary
Здесь мы представляем быстрым, легким и лоу кост метод для изготовления форм пользовательских полидиметилсилоксан, которые могут использоваться для производства на основе гидрогеля инженерии тканей со сложной геометрией. Мы дополнительно описать результаты от механических и гистологической оценок, проводимых на инженерии сердечной ткани производятся, используя эту технику.
Abstract
В области тканевой инженерии продолжает Зрелые, наблюдается повышенный интерес в широком диапазоне параметров ткани, включая ткани форму. Манипулируя ткани форму на Микрометр сантиметр масштаба можно прямое выравнивание ячейки, изменять эффективные механические свойства и рассмотреть ограничения, относящиеся к диффузии питательных веществ. Кроме того судно, в котором готовится ткани может распространять механических ограничений на ткани, привело поля напряжений, которые далее могут влиять на структуру клеток и матрицы. Фасонные ткани с высокой воспроизводимости измерений также есть утилита для анализов в пробирке в котором образца размеры имеют решающее значение, таких как механический анализ всей ткани.
Эта рукопись описывает метод альтернативного изготовление, используя отрицательные мастер формы, приготовленный из лазером акриловые: эти формы выполняют хорошо с полиэфиром (PDMS), разрешение конструкции с размерами на сантиметр масштаба и функция размеры меньше, чем 25 мкм и может быть быстро разработаны и изготовлены по низкой цене и с минимальным опытом. Минимальное время и стоимость требований позволяют для лазерных травленная прессформы быть быстро итерации по пока не определен оптимальный дизайн и быть легко адаптированы для любого анализа интерес, в том числе за пределами области тканевой инженерии.
Introduction
За последние два десятилетия мягкие литографии как изготовление техника широко используется для поддержки научных исследований, особенно в областях микрофлюидика, материалы исследований и ткани инженерных1,2, 3. Литье реплики, в которой создается объект с желаемой формы от негативных мастер плесень, предлагает удобный и недорогой метод производства положительная PDMS реплицирует который может использоваться для литья в форме гидрогели. Однако требуется негативные мастер формы обычно производятся с использованием микротехнологий методов, которые стоят дорого, много времени, ограничены по размеру, и требуют пространство комнаты и сложного оборудования. В то время как 3D печати предлагает потенциальной альтернативой, его полезность несколько ограничены из-за пределы резолюции недорогих принтеров и химических взаимодействий между общей 3D принтер полимеров и PDMS, которые могут препятствовать отверждения.
Лазерный резак системы способны как резки и травления такие материалы, как пластик, дерево, стекло и металл в последнее время стали значительно менее дорогостоящими и поэтому более доступными для изготовления инструментов исследования. Коммерческого класса Лазерные резаки способны сфабриковать объектов на шкале сантиметр с минимумом функций менее 25 мкм и далее требуют минимальной подготовки, опыта и времени для использования. В то время как лазерной абляции PDMS ранее использовался при изготовлении устройств микрофлюидика, наши знания не рукопись описал процесс, по которому миллиметр и сантиметр масштаба формы могут быть изготовлены из лазерной резки негативных мастер формы4 .
Мы использовали этот метод прежде всего для того, чтобы манипулировать форму инженерии тканей с целью улучшения питательных диффузии, сотовой выравнивание и механические свойства5,6,7. Однако для использования в любой области, где формованные гидрогели представляют интерес, например наркотиками доставки и материал науки исследований8позволяет универсальность этой техники. С доступ к лазерный резак, реплицирует PDMS плесень могут быть сделаны для почти любой геометрии без свесы (которые будет препятствовать удалению без многодетальном плесень, которая выходит за рамки этой рукописи) и что вписывается в габариты кровати лазера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создайте векторный формат мастер дизайн плесень
- Соберите желаемой формы геометрии в векторном формате с помощью программы векторной графики (см. материалы, оборудование и программное обеспечение таблица). Выберите файл | Новые и создайте холст соответствующих измерений с RGB цветовой формат. Создание требуемой геометрии с помощью инструментов «Фигура» в левой панели: введите нужные размеры в верхней части окна (нажмите кнопку Преобразование в верхней части, если не первоначально видимым) точно определить размеры фигуры.
Примечание: Форма геометрии должен предусматривать по крайней мере 6-мм границы между краем внешней функции и линии резки разрешить ролям PDMS менисков, после литья плесень. Это позволит готовой формы заложить заподлицо с нижней части культуры блюдо. Кроме того формы геометрии следует учитывать рассмотрение ограничения, связанные с лазерный резак модель, которая будет использоваться, включая ширину пропила и минимальным размером. Лазер, используемый для работы, описанной здесь (см. материалы, оборудование и программное обеспечение таблица) Рекомендуемые 0,2 мм ширина пропила и травились минимальным размером 25 мкм (максимальная DPI 1000). Размеры формы могут быть выбраны для размещения желаемого культуры судна, например 10-см блюдо, или 6 - или 24-ну пластины. - Откройте палитру цветов в левом верхнем углу окна и определить новый цвет swatches, совместимы с программным обеспечением лазерный резак.
Примечание: Мы используем красный (RGB 255, 0, 0) для резки и синий (RGB 0, 0, 255) для травления. Дополнительные образцы могут быть определены в зависимости от требования к конструкции (например, если глубина более чем одной травления).- Назначьте эти цвета образец резки пути, выбора пути и затем выбрав среза swatch путь цвета и [None] для цвета заливки из палитры цветов.
- Аналогично назначьте палитру цветов для травления пути, выбрав объект и затем выбрав путь травления для цвета заливки и [None] путь цвет из палитры цветов.
- Сохранение образцов в either.ai or.pdf форматы файлов, в зависимости от векторной графики программу и лазерной резец совместимости (рис. 1A и Дополнительный файл).
2. Лазерная резка акрила мастер формы
- Выберите материал отрицательный главной формы.
Примечание: Четверть дюйма толщиной акриловые хорошо подходит для этого приложения из-за ее совместимости с лазерной резки, относительно низкой стоимости и толщины, которая позволяет для функций до ~ 5,5 мм в высоту. Однако, другие материалы, которые удовлетворяют следующим требованиям могут использоваться также: (i) не реагирующие с PDMS отверждения; (ii) не пористых/сильно клей вылечить PDMS; (iii) порезы и гравирует чисто с лазерным резаком; (iv) поддерживает стекловидный государства до 60 ° C; (v) толщиной совместим с желаемую функцию максимальная высота. - Подготовьте лазерный резак для резки в соответствии со спецификациями изготовителя. Убедитесь, что используется достаточной вентиляции и что высота кровати правильно откалиброван для выбранных негативные мастер плесени материалом толщиной.
- Откройте файл дизайн в графической программе векторов на компьютере, подключенном к лазерной резки и нажмите файл | Печать. Убедитесь, что лазерный резак задается как принтер и что «Не масштаб» выбран масштаб выпадающее меню для предотвращения искажения дизайна перед нажатием кнопки Печать в нижней части окна печати.
- Лазерный резак печати утилиты нажмите на кнопку Настройка в правом нижнем углу. Назначьте мощность, скорость и импульсов на дюйм (PPI) параметры каждого из ранее выбранные цвета установить вырезать/etch параметры для всех конструктивных особенностей.
Примечание: Здесь, лазерный резак оснащен 75 W лазерные (см. материалы, оборудование и программное обеспечение таблица), используемые параметры следующие: 100% мощности, 1% скорость и 1000 PPI чисто прорезает ¼" акрил; 100% мощности, 8% скорость и 500 PPI гравирует на глубину до 2,75 мм, акрил; и 100% мощности, 5% скорость, 500 PPI гравирует на глубину до 3,50 мм в акрил. Если неизвестное для лазерный резак конфигурации или материал, эти параметры можно определить эмпирически путем проб и ошибок с кусочком теста. - Нажмите кнопку большой зеленый лазерный резак программного обеспечения лазерного etch и сократить негативные главной формы.
- Подготовьте негативные мастер форм для литья PDMS, удалив любые остаточные резки мусора с небольшой кисти или сжатого воздуха (рис. 1B).
3. Подготовьте формы PDMS для клетки или ткани, культура
- Подготовка смесь литья PDMS согласно его изготовителя. Подготовить 0,35 мл/см2 мастер плесени; Это будет различаться в зависимости от особенности формы и высоты.
- Дега подготовленный PDMS в вакуумной камере подключен к стандартной лаборатории вакуумной линии (< 500 мм рт.ст.) за 1 ч, или до тех пор, пока все пузырьки были ликвидированы.
- Лента внешнего края формы с винила или липкой лентой (Цветные метки ленты работает хорошо), таким образом, что расширяет ленты > 3 мм выше травлению лицом негативных главной формы. Нажмите кнопку ленты твердо против стороны плесень для предотвращения утечек позже.
Примечание: Если акриловые мастер формы функции через отверстия, может потребоваться применить ленты в нижней части формы (рис. 1 c). - Залейте дегазацию PDMS травлению лицом негативных главной формы.
Примечание: Цель, которую PDMS толщина будет зависеть приложения, хотя толстые PDMS форма днища можно сделать визуализации сложной. Минимальная толщина ~ 1,5 мм представляет собой хороший баланс между изображений соображений и легкость удаления плесени. - Поместите PDMS-покрытием негативные мастер плесень в вакуумной камере и Дега снова за 1 ч, или до тех пор, пока все пузырьки были ликвидированы.
- Место дегазацию PDMS-покрытием негативные мастер плесень в 60 ° C духовке вылечить для по крайней мере 6 ч. Убедитесь, что печь шельфа является уровень. Кроме того, позволяют PDMS вылечить при 37 ° C на ночь, или при комнатной температуре для ~ 72 ч.
- Если несколько форм были отлиты на же отрицательный мастер плесень, используйте razorblade для разрезать эти формы, пока они еще на негативные главной формы. Затем чистить каждый PDMS плесень прочь негативные главной формы. Убедитесь, что PDMS формы собираются медленно и осторожно для предотвращения плесени функция разрывов во время сбора.
- С помощью лезвия бритвы, обрежьте регионов с мениска от литья, что бы избежать появления плесени из лежал плоский, а также любые излишки материала или мусора (рис. 1 d).
- При необходимости, подготовьте формы для литья ткани клеток путем автоклавирования.
4. бросили коллагена и фибрин гидрогеля тканей
Примечание: Используйте асептические надлежащую процедуру для поддержания стерильности.
- Придерживайтесь формы в нижней части желаемого судна. Придерживаться новой формы в нижней части культуры ткани обработанные пластины с усилием нажать плесень против необработанных пластика (благодаря гидрофобность PDMS).
Примечание: Однако, если рассматривать культуры ткани поликарбоната будет использоваться, или в случае повторно используемые формы, которые, как правило, придерживаются менее прочно, натуральный или синтетический клей (например фибрина или силиконовый герметик вылечить на ночь) может использоваться для обеспечения вложения. - Подготовьте фибриноген, тромбина и нейтрализованы коллагена, литья решения такие достижения желаемой концентрации каждого в ролях ткани. Держите коллагена на льду до литья.
Примечание: Фибриногена и тромбина не должно быть позволено смешивать непосредственно до литья. При необходимости, фибриногена и тромбина решения также могут быть охлажденным увеличить время полимеризации. Мы использовали заключительный фибриноген концентрации между 0-8 мг/мл, концентрация окончательный тромбина между 10-100 ед/мл и окончательный коллаген концентрации между 0,8 - 2,0 мг/мл (рис. 2). Для инженерии сердечной ткани, мы часто используем кардиомиоцитов на 12 х 106 клеток/мл с 1,6 мг/мл, фибриноген 4 мг/мл и 20 ед/мл тромбина (тромбин добавляется непосредственно перед литья). Оптимальной концентрации (даже за пределами этих предлагаемых диапазонов) следует определить эмпирически. - Урожай следующие стандартные протоколы клетки и Ресуспензируйте в концентрации, необходимыми для достижения желаемого первоначальная клеточная плотность в ролях ткани.
Примечание: Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоцитов были собраны как описано в Лиан и др. 9 Держите заготовленных клеток на льду. Объем ячейки должны учитываться при подготовке суспензию клеток. Мы использовали концентрации клеток, начиная с 9-18 х 106 клеток/мл, хотя оптимальные диапазоны, как ожидается, будут меняться с популяции клеток (рис. 2). - Объединить фибриноген, нейтрализованные коллагена и суспензии клеток (см. шаг 4.2 для примера) для создания смеси литья. Держите литья микс на льду.
Примечание: Фибриногена и тромбина температуры и концентрации определит кинетика полимеризации; во избежание полимеризации в течение литья, может быть необходимо для подготовки отдельных партий литья смеси в зависимости от числа и объема конструкций, которые будут подаваться. - Обработки поверхности формы, который будет выставлен для литья смеси для уменьшения гидрофобности PDMS (гидрофобность PDMS увеличить белка адсорбции и затрудняют литья).
- Достижения гидрофильные модификации поверхности, рассматривая с кислородной плазмы, такие, как с помощью портативных высокой частоты генератора (например, BD-20A от инженерных Litton). Предоставлять все поверхности плесень контактирующих клеток/гель смесь для плазменной обработки для 3-5 s, около 5 мин до литья.
- В качестве альтернативы лечения сурфактантом, как плюрониевого F-127 (1% w/v)10. Выполните обработки поверхности, как близко к времени литья как можно скорее, как смена полярности будет ухудшаться с течением времени.
- Непосредственно перед литья, добавьте тромбина для литья смесь и перемешать тщательно, закупорить вверх и вниз без введения пузыри.
- Работает быстро, Пипетка микс литья в формы, используя уход на хранение смеси во всех углах и щелях плесень. Избегайте пипеткой выброса за пределы первой остановкой для предотвращения формирования пузырь внутри конструкции.
- Повторите шаги 4.6 и 4.7 как необходимые для любых дополнительных партий литья смеси.
- Место культуры ткани судна в инкубаторе 37 ° C на 45 мин. Если инкубатор хорошо не увлажняется, депозитные ячейки СМИ вокруг формы до инкубации для предотвращения обезвоживания конструкции.
Примечание: Тип ячейки СМИ будет зависеть от типа клеток, но для конструкций инженерии сердечной ткани мы используем RPMI 1640 + дополнение B27. - После 45 минут возвращение конструкции на капот и крышка с ячейки СМИ до возвращения в инкубаторе.
- Изменить ячейки СМИ каждые 48-72 ч как необходимые для ячейки и построить тип.
Примечание: Изменения СМИ должны планироваться согласно рекомендуется инструкции, предоставляемые поставщиком для обеспечения максимальной клеток здоровья. Будьте осторожны при изменении средства массовой информации чтобы не мешать конструкций. Мы не испытывали проблемы с плавающей конструкции, но если это происходит, он может быть предотвращены путем добавления высокие должности формы дизайна, которые выходят за рамки на уровне средств массовой информации. - После использования вымойте формы последовательно с хлоркой 10%, этанол 70% и дистиллированной воды. Затем воздух сухой и автоклав для повторного использования до ~ 10 раз.
5. анализ методов: Ткани уплотнения
Примечание: Уплотнение результате матрица ремоделирования является показателем жизнеспособность тканей и развития, которая легко может быть измерена путем анализа оптической микроскопии и изображения.
- Собирайте изображения оптической микроскопии конструкций в плесени в приращениях времени, начиная с 2 ч до 96 ч после заливки.
Примечание: Из-за низкой степени требуется увеличение, рассечение микроскоп с горе камеры хорошо подходит для этого приложения. - Отслеживать области видны конструкции в пакет анализа изображений, например ImageJ (открытым исходным кодом, imagej.nih.gov/ij/).
- Анализировать уровень и окончательный степень уплотнения (рис. 2).
6. анализ методов: Испытания на растяжение
Примечание: Обе активные механика (силы или штаммов, порожденных инженерии тканей из-за активности клеток) и пассивных механики (силы или штаммов, созданный в ответ на прикладной штаммов или силы) являются критическим функциональные характеристики многих инженерных ткани и это особенно верно для инженерии сердечной ткани. Микромеханические анализатор, используемый для анализа описаны в Таблице материалов. Другие механические испытания аппараты могут применяться аналогичным образом предполагая, они позволяют гидратированных тестирования и способны контроля длины и заставить измерения диапазонов и резолюций соответствующие для ткани. Для тканей с поперечного области порядка одного квадратных миллиметров и жесткость порядка десятков кПа ячейка нагрузки 5 МН — хорошо подходят. Более крупные и более жесткая материалов потребует большей нагрузки ячейки. До начала испытаний, убедитесь, что датчик силы и длина контроллер правильно откалиброван.
- Включите контроллер длина, силы датчики, генератор импульсов и контроллер температуры.
- Заполняют раствором Tyrode в (хлористый кальций 1,8 мм, хлорид магния 1,0 мм, хлористый калий 5,4 мм, 140 мм хлорида натрия, фосфат натрия 0,33 мм, 10 мм HEPES и 5 мм глюкозы в ddH2O, рН, скорректированы до 7,4) механических испытаний корыто для инженерии сердечной ткани. Отрегулируйте термопара, таким образом, что достигается ванны температура 37 ° c.
- Загрузите механических испытаний протокол сбора данных активного сокращения.
Примечание: Мы оценивали активных сократительной механики с помощью для 120 проводятся длина шага протокол, в котором длина шаги в 5% деформации увеличивается до 30% s, чтобы оценить влияние нагрузки на сжатие силы (рис. 3A). Кроме того мы оценивали пассивной механические свойства через протокол тянуть перерыв в размере 10% деформации/мин (рис. 3B) постоянной деформации. Оба из этих протоколов могут служить хорошей отправной точки для активных и пассивных механического анализа. - Под областью рассечение Аккуратно отсоедините инженерии тканей конструкции от PDMS плесени, таким образом, чтобы он свободно плавающий.
Примечание: Cellularized конструкций, которые претерпели уплотнения ткани будет скорее всего уже отсоединена от внутренней поверхности, и в этих случаях требуется минимальная манипуляция.- Если уплотнение не вызвало конструкции выпуска, используйте корнцанг осторожно отделить конструкцию от стенки и дно формы, чтобы избежать повреждения ткани.
- С помощью щипцов, осторожно подобрать конструкцию и передача его в механических испытаний ванна.
- Просмотр конструкции через микроскоп рассечение, смонтируйте либо конец конструкции к креплениям, придает силу датчика и рычаг.
- Отрегулируйте положение руки рычаг, с помощью микроманипулятор, до тех пор, пока конструкция располагается без прикладной напряжения. Нулевой длины контроллер и заставить контроллер.
- Изображение конструкции через область рассечение, так, что размеры конструкции могут быть измерены посредством анализа изображений.
- Инициировать протокол активной силой и сохранить собранные данные после того, как протокол была завершена (рис. 3).
- Если пассивные Механические данные требуются также, отрегулируйте рычаг снова до тех пор, пока есть нулевой прикладной штамм. Нулевой длины и силу контроллеры и изображения построить второй раз перед загрузкой и инициирует протокол пассивной механики (рис. 3). Сохраните собранные данные.
7. анализ техника: Парафин иммуногистохимии и гистологии
Примечание: Мы имели большой успех в визуализации разделов инженерии ткани с помощью парафиновые блоки так, что морфология ткани лучше всего сохранилась. Все шаги процесса должны тщательно рассматриваться и с учетом инженерии тканей, включая обработку образцов без вакуума или давление, эмпирически определение методов извлечения соответствующего антигена и титрования основное антитело концентрация. Другие методы, например использование замороженных блоков для подготовки слайдов, может потребоваться меньше времени и затрат при дают достаточные результаты в зависимости от предполагаемого применения.
- Под областью рассечение Аккуратно отсоедините инженерии тканей конструкции от PDMS плесени, с помощью щипцов, скользнул между конструкцией и PDMS осторожно отделить его от PDMS, таким образом, чтобы он свободно плавающий. Передать эти конструкции microcentrifuge трубки для фиксации.
Примечание: Хрупкие конструкции или тех, устанавливается при условии статическое напряжение, предоставляемый плесень, сама может быть исправлена в плесени, изменив решения в культуре также и удаление конструкцию из формы после фиксации. - Немедленно исправьте инженерии тканей, погрузив в параформальдегида 4% (PF) для 10 мин при комнатной температуре. Оценить не более чем 1 час на 1 мм толщины ткани; не чрезмерно исправить.
- Полоскания тканей с-фосфатный буфер (PBS).
- Сохраняя мокрой ткани, место капля эозина на пятно розовый для 10-30 s, а затем промыть 70% этиловом спирте.
Примечание: Розовый цвет помогает идентифицировать его в блоке парафин для разрезания позже и будут смыты во время депарафинизации. - Оберните ткани в объектив бумаги и место в гистологии кассету. Используйте прокладки в кассету при необходимости сохранить ткани плоский.
- Опускайте кассету в 70% EtOH и хранить при 4 ° С до готовности для обработки парафином.
- Обрабатывать ткани от обезвоживания в повышении концентрации этанола (2 x 30 мин 70, 95 и 100%). Затем, купаться образцов в трех последовательных ксилол ванны для 30 мин.
- Опускайте образцы в трех последовательных парафиновые аппликации на 30 мин.
- Разогреть кассеты, тщательно разворачиваться и удалить эозина окрашенных тканей из бумаги объектив и внедрить проникли в парафин ткани в блоке парафина. Будьте осторожны, чтобы заложить плашмя на нижней части формы для включения легче секционирование образца.
- Раздел тканей, используя микротом как желаемое (толщиной 5-8 мкм) и пятен с использованием стандартных процедур, оптимизированный для инженерии тканей (рис. 4).
Примечание: Альтернативой парафиновых срезах является использование замороженных блоков, хотя морфологии образца может быть нарушена. Место основных конструкций в 30% сахарозы в ФБР за 3 часа или пока образца уравновешенной (например, на ночь). Обмен решение с представленности v/v 30% сахарозы и оптимального раскроя температуры (OCT) замораживание среднего за 1 ч. место конструкции в замороженных блоков с октября замораживание среднего с использованием 70% EtOH с сухим льдом суспензии для быстрого замораживания в лотки блока. Раздел блоков с криостата толстые разделов 10-50 мкм.
8. анализ техника: Выравнивание ячеек
Примечание: Манипуляции ткани формы и поля внутренних напряжений может модулировать выравнивание ячеек, определяющей чертой многих родной тканей.
- Подготовка инженерных ткани конструкции PDMS формы с геометрией интерес.
- В конце периода культуры, мыть конструкции в PBS, исправить в 4% PF (см. шаг 7.2) и урожай конструкции для подготовки изображений путем разрезания и гистологии (см. раздел 7) или весь смонтировать пятнать.
Примечание: Вся гора окрашивания следует аналогичные шаги гистология/иммуногистохимии, но требует больше инкубационных периодов, и будет глубина проникновения красителей, антитела, и любые методы обработки изображений (например, глубина проникновения света в конструкции) должны определяться эпирически для конструкции композиции. - Ориент разделов ткани в горизонтальной плоскости (параллельно плоскости дна плесень) и пятно для маркера для ячейки интерес. F актина метку, например Фаллоидин, используйте для обозначения напряжений волокон актина большинства типов клеток. Альтернативно используйте маркер конкретные ячейки.
Примечание: В случае инженерии сердечной ткани, ориентация определяется sarcomeres, окрашенных с α-актинина. - Оценить главной оси всех ячеек или ядер в регионе интереса вручную или с помощью анализа инструмент (например, ImageJ, MATLAB).
Примечание: Это может быть полезным для классификации различных регионах же конструкции, в зависимости от геометрии («узел» и «пакет» регионы в геометрии сетки как, или «основные») и «край» в круговой геометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оптика лазерный резак приведет к травлению районы для очень немного уменьшились размеры как травление глубина увеличивается, и результаты в плесени стены с очень тонкий рельеф, должное к сужающийся лазерного луча. Это поможет облегчить удаление плесени PDMS литой, но следует тщательно рассмотреть, если очень глубоко выгравированы негативные мастер формы (> 6 мм), требуется (рис. 1).
Со временем в культуре из-за матрицы ремоделирования, хотя темпы и степень, в которой это происходит, будет зависеть от состава эшафот, ячейки нагрузки и культивирования условий будет компактный cellularized конструкции.
Ремоделирование матрица может произойти путем реорганизации и деградации окружающих матрица (а также осаждения новой матрицы), но обычно ассоциируется с увеличением механическая жесткость обусловлено сокращением площади поперечного сечения. С коллагена только конструкции состоит из коллагена 1,6 мг/мл и 12 x 106 кардиомиоцитов/мл, мы видим конструкции компактных до 19,7 ± 2,8% их первоначальной ширины в течение четырех дней после литья (рис. 2) через уплотнение assay. Хотя этот assay дает представитель 2D приближение процесса 3D, простота сбора данных и неразрушающего природы сделать это мощный инструмент для изучения процесса развития конструкции. Обратите внимание, что в условиях культуры клеток, даже в отсутствие клеток, коллаген механики могут со временем изменяться из-за оба самосборки и cross-linking11. Фибрин может быть быстро деградируют к фибринолиза как в естественных условиях , так и в пробирке если не в присутствии antifibrinolytic, например Апротинин или Аминокапроновая кислота12. Таким образом воздействие компонентов эшафот на долгосрочной перспективе развития тканей и не только образование ткани, следует рассматривать при выборе конструкции формулировку. Если размер окончательного ткани имеет важное значение для конкретного приложения, уплотнения должны рассматриваться также в формы дизайна и эмпирически определяется на основании ячейки матрицы и тип(ы) композиции. Обратите внимание, что уплотнение ткани также может вызвать стресс поля внутри ткани, которой можно манипулировать в cellularized конструкции для поощрения выравнивание ячеек (рис. 4).
Широкий спектр эшафот концентрации полимера и первоначальная клеточная посева плотности были использованы для создания инженерии тканей в литературе, и это может объясняться главным образом для различных требований для различных типов клеток, клеточных линий и приложений. Основываясь на нашей собственной работе с hiPSC производные кардиомиоцитов, мы считаем, что коллаген концентрация 1,25 мг/мл и посева плотность ~ 15 миллионов клеток/мл является хорошей отправной точкой13. Кроме того фибрина широко используется в качестве материала леска сердечной ткани также, обычно в диапазоне 3-4 мг/мл14. Клеток, заполнение плотности могут выбираться на основе целого ряда факторов, в зависимости от приложения, но плотность клеток родной тканей обеспечивают хорошей отправной точкой. Также считают, что решения высокой концентрации клеток может стать сложным, чтобы работать с, особенно для небольших объемов. Для населения в данной ячейке могут быть настроены эшафот формулировки; как правило, повышение концентрации полимера когда тканей являются слишком хрупкими или перерыв после уплотнения и увеличение концентрации полимера, когда ткани слишком жесткой или не компактный15.
До выполнения пассивной механический анализ в любое время на этапе культура, это может быть целесообразным механически предварительных условий выборки конструкции. Литраж природных полимерных гидрогелей и инженерии тканей увеличит воспроизводимость результатов тестирования из-за материала вязкоупругости и лучше указать свойства, которые конструкции представят в клинических приложения. Мы используем 8 циклов 10% деформации в треугольной формы сигнала в размере 10% деформации/мин до начала механической оценки (Рисунок 3).
Ткани и клетки тип конкретных морфология может оцениваться гистологии и иммуногистохимии с традиционными методами. Однако, мы обнаружили, что оптимизация почти все этапы парафин обработки, встраивание, секционирование, антиген поиска и пятнать были необходимые для инженерии сердечной ткани, по сравнению с покрытием клетки или секционного родной ткани (Рисунок 4).
Рисунок 1 : План процесса проектирования и подготовки PDMS формы от лазерного вырежьте акриловая мастерами. (A) плесень дизайн, подготовленный в формате векторной графики. Очищен от вирусов (B) Лазерные травленная акриловые негативные мастер. (C) PDMS бросили на поверхности тесьмой акриловые главной формы. (D) результирующий PDMS плесень готов для стерилизации до культуры ткани. Вставка: вид сверху, же масштаба. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Построить уплотнения со временем в культуры. (A) образы прямоугольной конструкции, подготовленный в трех экземплярах при сжатии с течением времени в культуре. Зеленые пометки представляют маски, используемые для расчета площади видна конструкция для анализа изображений. (B) Площадь участка конструкции (двумерный метрики конструкция уплотнения) с течением времени. Горизонтальные линии представляют собой средние значения и погрешностей указать стандартное отклонение. Для всех групп, n = 3 и * указывает p < 0,05 по оценке ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Raw следы для механических характеристик инженерии сердечной ткани. Вставками отображать трассировку одного представителя дергаться сужением (одинаковые оси как основной сюжет). (A) активные механические результате быстрые шаги последовали держит нагрузку 5% с шагом в ответ. (B) пассивной механической ответ результате теста тянуть перерыв в размере 10% деформации/мин. Все образцы были проанализированы в ванне с 37 ° C Tyrode в решения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Парафин блока изображения гистологии для инженерии сердечной ткани конструкций различных конструкций. Парафин блок изображения гистологии для инженерии сердечной ткани конструкций различных конструкций витражи с (A) гематоксилином и эозином, Диаминобензидин (борьбы с сердечными тропонина T, коричневый) и гематоксилином ядерной изображение (B), (C ) picrosirius красное пятно на коллаген с быстро зеленый цитоплазматических изображение и (D) мыши анти α-актинина антитела (зеленый) и 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ядерных изображение (синий). Результате дизайн и ткани уплотнения конструкции отличается выравнивание ячейки. Линейки в A относится к B и C также. Врезные в D показывает полосатый кардиомиоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Заказной PDMS плесень геометрии, которые совместимы с тканевой культуры имеют большое утилита настройки важных инженерных ткани свойства, такие как выравнивание ячеек, скорость диффузии и эффективной жесткость. Кроме того эти формы являются очень полезными для подготовки ткани для анализа приложений, в которых важно геометрии, например механических испытаний16,17. Подготовка этих устройств от лазерного сократить негативные формы мастер предлагает быстрым, легким и лоу кост метод использования этих средств, особенно по сравнению с время и затраты, связанные с традиционными микротехнологий. Лазерная резка позволяет также больший размер максимальной плесень, ограничено только размер кровати резак. Мы успешно использовали эти универсальные формы для выполнения широкого ряда исследований с инженерии сердечной ткани, включая оптический сопоставления действий потенциал распространения, оценки силой производства и пассивного механических свойств и имплантации в мышиной модели инфаркт миокарда13,18. Мы признаем, что за пределами ниши исследования сердечно-сосудистой системы рекуперативного инженерии, приложения для поля тканевой инженерии, доставки лекарств и материалов исследований подавляющее.
Хотя есть несколько технически сложные шаги в изготовление пресс-форм, себя, есть целый ряд важных шагов в создании функциональных тканей. Если конструкции не компактный окружающие матрицы после 24 ч, сначала подтвердите жизнеспособность клеток через жизнеспособности пятнать инженерии тканей. Если жизнеспособность клеток является высоким, рассмотрите возможность изменения конструкции состава для следующего набора тканей. Хотя результаты будут варьироваться в зависимости от популяции клеток, мы наблюдали увеличение уплотнения, связанные с более высокой плотности посева и более низкой концентрации коллагена. Наконец она также может быть полезно дополнить населенности клетки в сеяный с типом ячейки, хорошо подходит для реконструкции матрицы, например фибробластов, поощрять уплотнения.
Одно ограничение этих форм имеет потенциал для PDMS адсорбировать небольшие гидрофобные молекулы. В то время как для наших приложений это не было проблематичным, он может быть озабоченность в анализов очень чувствительны к потере этих молекул. В этих случаях PDMS белка адсорбции можно смягчить путем обращения с агентом необрастающие, такие как polyhydrophilic или polyzwitterionic материалы19. Кроме того стерилизованные PDMS плесень может быть подготовлен как отрицательный мастер (с лазером позитивные формы) для культуры плесень бросить в другой, не адсорбент материал, например агарозы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают, финансирование из низ R00 HL115123 и Браун университета школа инженерии. Они также благодарны Браун Дизайн семинар и Крис Bull для профессиональной подготовки и поддержки с лазерной резки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
