Summary
여기 우리는 복잡 한 형상의 설계 조직 히드로-기반 생산에 사용할 수 있는 사용자 지정입니다 금형 날조를 위한 신속 하 고, 손쉬운, 고 저가 방법 제시. 우리는 또한이 기술을 사용 하 여 생산 조작된 심장 조직에서 실시 하는 기계 및 조직학 평가 결과 설명 합니다.
Abstract
조직 공학의 분야는 계속 함 성숙에, 다양 한 조직 형태를 포함 한 조직 매개 변수에에서 대 한 관심 증가 되었습니다. 센티미터 규모 마이크로미터에 조직 형태를 조작 수 있습니다 직접 셀 정렬, 효과적인 기계적 특성을 변경 고 주소 영양 보급에 관련 된 제한 사항. 또한, 조직 준비는 선박 수 기계적 제약 조건을 셀 및 매트릭스 구조에 더 영향을 미칠 수 있는 스트레스 필드 결과로 조직에가 르 친다. 높은 재현성 크기와 모양의 조직 또한 생체 외에서 분석 실험을 샘플 크기는 전체 조직 기계적 분석 등 중요 한 유틸리티가 있다.
이 원고 레이저 에칭 아크릴에서 준비 하는 부정적인 마스터 금형을 이용 하는 다른 제조 방법에 설명 합니다: 이러한 금형입니다 (PDMS)와 함께 잘 수행, 센티미터 규모와 기능에 크기와 디자인을 허용 25 µ m 보다 작은 크기와 수 있습니다 빠르게 설계 및 조작 하는 최소한의 전문성과 저렴 한 비용. 최소한의 시간 및 비용 요구 사항을 빠르게 최적의 디자인을 결정 때까지 따라 반복 될을 넘어 조직 공학의 분야 들을 포함 한 관심의 모든 분석 결과 맞게 쉽게 적용할 레이저 에칭 금형에 대 한 허용.
Introduction
지난 2 년간 소프트 리소 그래피 사용 되었습니다 제조 기법으로 광범위 하 게 마이크로, 재료 연구, 및 조직 공학1,2의 분야에서 특히 과학 연구를 지원 하기 위해 3. 네거티브 마스터 몰드에서 만든은 원하는 모양으로 개체가 복제 성형 편리 하 고 저렴 한 비용의 방법 생산 긍정적인 PDMS는 복제 캐스팅 hydrogels 모양에 사용할 수 있습니다 제공 합니다. 그러나, 필요한 부정적인 마스터 금형은 일반적으로 비싼, 시간이 걸리는, 크기, 제한 된 제작 기술을 사용 하 여 생산과 클린 룸 공간 및 정교한 장비를 필요. 잠재적인 대안을 제공 하는 3D 인쇄, 자사의 유틸리티 저렴 프린터 및 일반적인 3D 프린터 고분자 및 치료 하는 것을 억제할 수 있는 PDMS 사이의 화학 상호 작용의 해상도 제한으로 인해 다소 제한 됩니다.
레이저 절단기 시스템 모두 절단 하 고 플라스틱, 나무, 유리, 그리고 금속 등 재료를 에칭 최근 획기적으로 저렴 하 고 따라서 더 연구 도구를 날조를 위한 접근 되고있다. 상업 학년 레이저 절단기 센티미터 규모 최소 기능 25 µ m 보다 작은 개체를 날조 할 수 있다 고 추가 필요 최소한의 교육, 전문 지식, 그리고 사용 하는 시간. PDMS의 레이저 절제 이전 마이크로 소자의 제조에 사용 되었습니다, 하는 동안 우리의 지식 없이 원고 프로세스는 밀리미터와 센티미터 규모 금형 레이저 부정적인 마스터 금형4 컷에서 날조 될 수 있다 설명 했다 .
영양 보급, 셀룰러 맞춤 및 기계적 성질5,,67을 개량 하기 위하여 설계 조직 형태를 조작 하는 주로이 방법을 사용 했습니다. 그러나,이 기술은 성형된 hydrogels 약물 전달 및 재료 과학 연구8등 관심 있는 모든 분야에서 활용에 대 한 수 있습니다. 레이저 커터에 대 한 액세스, PDMS 몰드 복제는 (그 것이이 논문의 범위를 벗어납니다 다중 파트 형 없이 제거 억제) 돌출부 없이 거의 모든 형상에 대 한 만들 수 있습니다 그리고 그 레이저 침대의 크기에 맞는.
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Protocol
1. 벡터 형식 마스터 몰드 디자인 만들기
- 벡터 그래픽 프로그램을 사용 하 여 벡터 형식에 원하는 형 기 조립 ( 재료, 장비, 및 소프트웨어 테이블참조). 파일을 선택 | 새로운 RGB 색상 형식으로 적절 한 크기의 캔버스를 만듭니다. 왼쪽 패널에서 모양 도구를 사용 하 여 원하는 형상을 생성: 창 (맨 처음 표시 되는 경우 변환 버튼 클릭)의 상단에 원하는 크기를 입력 모양 크기를 정확 하 게 정의 하.
참고: 금형 형상 PDMS 초승달 모양의 몰드 캐스팅 다음 트리밍을 허용 하도록 기능을 바깥쪽의 가장자리와 커팅 라인 사이 적어도 6 m m 테두리에 대 한 허용 해야 합니다. 이것은 플러시 문화 접시의 바닥을 완료 형 수. 있습니다 또한, 금형 형상 고려 제한, 사용 되는 레이저 커터 모델와 관련 된 절단 폭과 최소 기능 크기를 포함 하 여 고려 한다. 작품 설명에 사용 되는 레이저 여기 0.2 m m 절단 폭과 최소 에칭된 기능 크기 25 µ m (1, 000의 최대 DPI)의 기능 ( 재료, 장비, 및 소프트웨어 테이블참조). 금형 크기는 10 cm 접시 또는 6 또는 24 잘 플레이트 등 원하는 문화 그릇에 맞게 선택할 수 있습니다. - 윈도우의 상단 왼쪽 모서리에 색상 피커 열고 정의 새 색상 견본 레이저 커터 소프트웨어와 호환.
참고: 우리 레드 (RGB 255, 0, 0)를 사용 하 여 절단 및 파랑 (RGB 0, 0, 255) 에칭에 대 한. (예를 들어 하나 이상의 에칭 깊이 원하는 경우) 디자인에 대 한 요구 사항에 따라 추가 견본을 정의할 수 있습니다.- 경로 선택한 다음 색상 피커 경로 색상 컷된 견본 및 [없음] 채우기 색을 선택 하 여 이러한 견본 색상 절단 경로를 할당 합니다.
- 마찬가지로, 개체를 선택한 다음 색상 피커 채우기 색에 대 한 에칭 경로 및 [없음] 경로 컬러를 선택 하 여 경로 에칭 하 견본 색상을 할당 합니다.
- 디자인 벡터 그래픽 프로그램 및 레이저 커터 호환성 (그림 1A 및 보조 파일)에 따라 either.ai or.pdf 파일 형식으로 저장 합니다.
2입니다. 레이저 커팅 아크릴 마스터 형
- 네거티브 마스터 몰드 소재를 선택 합니다.
참고: 분기-인치 두꺼운 아크릴 레이저 절단, 상대적으로 저렴 한 비용와 호환성 때문에이 응용 프로그램에 적합 하다 고 기능에 대 한 최대 허용 두께 ~ 높이 5.5 m m. 그러나, 다음과 같은 요구 사항을 충족 하는 다른 자료도 사용할 수 있습니다: (i) PDMS 치료;와 비 반응성 (ii) 비-다공성/강력 접착제 치료 PDMS; (iii) 인하와 레이저 커터; 깔끔하게 파 놓 았 (4) 유지는 유리 상태 최대 60 ° C; (v)의 두께 원하는 최대 기능 높이와 호환. - 제조업체의 사양에 따라 절단을 위해 레이저 커터를 준비 합니다. 충분 한 환기 되 고 침대 높이 선택한 부정적인 마스터 몰드 재료의 두께를 보정 제대로 확인 하십시오.
- 레이저 커터에 연결 된 컴퓨터에 벡터 그래픽 프로그램에서 디자인 파일을 열고 파일을 클릭 | 인쇄. 레이저 커터는 프린터로 설정 되어 있는지 및 비율 에서 "규모 할"을 선택 드롭 다운 메뉴의 인쇄 대화 상자 하단에 있는 인쇄 단추를 클릭 하기 전에 디자인의 왜곡을 방지 하기 위해.
- 레이저 절단기 인쇄 유틸리티에서 하단 오른쪽 모서리에 있는 설정 버튼을 클릭 합니다. 모든 디자인 기능에 대 한 매개 변수 잘라내기/엣지를 설정 이전에 선택한 색상의 각각 힘, 속도, 및 인치 (PPI) 설정 당 펄스를 할당 합니다.
참고: 여기, 레이저 커터 장착 75 W 레이저 ( 재료, 장비, 및 소프트웨어 테이블참조), 다음의 사용된 설정: 100% 전원, 1% 속도, 및 1000 PPI ¼"아크릴; 통해 깔끔하게 인하 PPI는 아크릴;에서 2.75 m m의 깊이를 파 놓 았는 100% 전원, 8% 속도, 및 500 그리고 100% 전원, 5% 속도, 500 PPI 아크릴에 3.50 m m의 깊이를 파 놓 았. 레이저 커터 구성 또는 자료에 대 한 알 수 없는 경우 이러한 매개 변수 테스트 조각으로 시행 착오를 통해 경험적으로 확인할 수 있습니다. - 레이저 레이저 커터 소프트웨어에 큰 녹색 버튼 엣지와 부정적인 마스터 금형을 잘라내기를 클릭 하십시오.
- 작은 브러쉬 또는 압축 공기 (그림 1B) 어떤 잔여 절단 파편을 제거 하 여 PDMS 캐스팅에 대 한 부정적인 마스터 금형을 준비 합니다.
3. 세포 또는 조직 문화에 대 한 PDMS 금형 준비
- 제조업체의 사양에 따라 PDMS 캐스팅 믹스를 준비 합니다. 0.35 mL/cm2 마스터 형;의 준비 이 금형 기능 및 높이에 따라 달라 집니다.
- 드 진공 챔버에 준비 된 PDMS가 표준 실험실 진공 라인에 연결 (< 500 mmHg) 1 시간, 또는 모든 거품 제거 되었습니다 때까지.
- 테이프 확장 되도록 비닐 또는 마스킹 테이프 (컬러 라벨 테이프 작품 잘) 몰드의 외부 가장자리를 테이프 > 부정적인 마스터 형의 에칭된 얼굴 위에 3 m m. 나중에 누수를 방지 하기 위해 금형의 측에 대하여 확고 하 게 테이프를 누릅니다.
참고: 아크릴 마스터 형 구멍을 통해 기능을 하는 경우 그것은 해야 뿐만 몰드 (그림 1C)의 하단에 테이프를 적용 하 합니다. - Degassed PDMS 부정적인 마스터 형의 에칭된 얼굴 붓는 다.
참고: 비록 두꺼운 PDMS 몰드 바닥 PDMS 두께 응용 프로그램에 따라 달라 집니다 대상 도전 이미징 할 수 있습니다. 최소 두께 ~ 1.5 m m 이미징 고려 사항 및 곰 팡이 제거의 용이성 사이의 균형을 파업. - 진공 챔버에 PDMS 코팅 부정적인 마스터 몰드를 놓고 1 시간, 또는 모든 거품 제거 되었습니다 때까지 다시 드.
- 적어도 6 h. 오븐 선반 수준은 확인에 대 한 치료를 60 ° C 오븐에 degassed PDMS 코팅 부정적인 마스터 몰드를 놓습니다. 또는, 37 ° C, 또는 온도 대 한 치료 PDMS 허용 ~ 72 h.
- 여러 금형 같은 부정적인 마스터 형에 캐스팅 됐다는 razorblade 부정적인 마스터 형에 아직도 있는 동안 이러한 금형을 떨어져 잘라 사용. 그런 다음, 각 PDMS 몰드 부정적인 마스터 몰드의 껍질. PDMS 몰드는 천천히, 그리고 신중 하 게 수집 보장 형 기능 컬렉션 동안 찢을 방지 하기 위해.
- 면도날을 사용 하 여, 거짓말 플랫, 뿐만 아니라 어떤 과잉 물자 또는 파편 (그림 1D)에서 형을 방지 하는 캐스팅에서 초승달 모양 영역을 손질.
- 필요한 경우, 압력가 마로 소독 하 여 세포/조직 주조 금형을 준비 합니다.
4. 캐스팅 콜라겐과 섬유 소 히드로 조직
참고: 적절 한 무 균 절차를 사용 불 임을 유지 합니다.
- 원하는 그릇의 바닥에 금형 준수. (PDMS의 hydrophobicity) 때문에 치료 되지 않는 플라스틱에 대 한 금형을 단단히 눌러 조직 문화 치료 접시의 바닥에 새로운 형을 준수 합니다.
참고: 그러나, 조직 문화 취급 하는 경우 폴 리 카보 네이트 사용 될 것 이다 또는 덜을 확고 하 게 준수 하는 경향이, 재사용된 금형의 경우 (예: 섬유 소 또는 실리콘 실 란 트 치료 하룻밤) 천연 또는 합성 접착제 부착을 위해 사용할 수 있습니다. - 준비 fibrinogen, 트 롬 빈, 그리고 각각의 원하는 농도 캐스트 조직에 유발 될 것입니다 솔루션을 주조 중화 콜라겐. 캐스팅까지 얼음에 콜라겐을 유지.
참고: Fibrinogen 및 트 롬 빈 해야 수 없습니다 캐스팅 직전까지 혼합. 필요한 경우, fibrinogen 및 트 롬 빈 솔루션 중 합으로 차게 또한 수 있습니다. 우리는 0-8 사이의 최종 fibrinogen 농도 사용 mg/mL, 10-100 U/mL, 0.8-2.0 mg/mL (그림 2) 사이 마지막 콜라겐 농도 사이 마지막 트 롬 빈 농도. 설계 된 심장 직물, 우리 자주 사용 cardiomyocytes 12 x 106 셀/mL 1.6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinogen 및 20 U/mL 트 롬 빈에 (트 롬 빈 캐스팅 직전 추가 됩니다). (심지어이 제안된 범위) 이외의 최적 농도 실험적으로 결정 되어야 합니다. - 표준 프로토콜에 따라 세포를 수확 하 고 주조 조직에서 원하는 초기 세포 밀도 달성 하기 위해 적절 한 농도에 resuspend.
참고: 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 cardiomyocytes 리안 외 에 설명 된 대로 수확 했다 9 계속 얼음에 수확된 셀. 세포 현 탁 액을 준비할 때에 대 한 셀 볼륨을 차지 한다. 우리 비록 최적의 범위 셀 인구 (그림 2)와 다를 것으로 예상 된다 106 셀/mL, x 9-18에서 배열 하는 세포 농도 사용 했습니다. - 만들 주조 혼합 fibrinogen, 중화 콜라겐과 세포 현 탁 액 (예제 4.2 단계 참조)를 결합. 얼음에 주조 혼합을 하십시오.
참고: Fibrinogen 및 트 롬 빈 온도 및 농도 결정 중 합 속도 론; 캐스팅 중 합을 방지 하기 위하여 주조 혼합 수에 따라 별도 일괄 처리 및 볼륨의 캐스팅 될 것 이다 구문이 준비가 필요할 수 있습니다. - PDMS hydrophobicity를 완화 하기 위해 주조 혼합에 노출 될 금형의 표면 처리 (PDMS hydrophobicity 것 이다 단백질 흡착을 증가 하 고 어렵게 캐스팅).
- 으로 하 여 산소 플라즈마와 같은 휴대용 높은 주파수 생성기 (예를 들어, Litton 엔지니어링에서 BD-20A)와 친수성 표면 개 질을 얻을 수 있습니다. 플라즈마 처리에 셀/젤 혼합물 3 5 s, 캐스팅 하기 전에 약 5 분에 대 한 문의 금형의 모든 표면에 노출.
- 또는 Pluronic F-127 (1 %w / v)10과 같은 계면 활성 제와 치료. 극성에 변화는 시간이 지남에 저하 됩니다로 거의 가능, 캐스팅 시간으로 표면 처리를 수행 합니다.
- 캐스팅, 직전 추가 트 롬 빈 캐스팅 믹스 및 믹스를 철저 하 게 위아래로 거품 소개 없이 pipetting으로 합니다.
- 주조 혼합 플라스틱 신속 하 게, 작업, 금형에 모든 구석과 틈새의 금형으로 혼합 입금 처리 사용 하 여. 구문 안에 거품 형성을 방지 하기 위해 첫 번째 막 넘어 피 펫 방출을 하지 마십시오.
- 4.6와 4.7 캐스팅 믹스의 모든 추가 일괄 처리에 대해 필요에 따라 단계를 반복 합니다.
- 45 분 동안 37 ° C 배양 기에서 조직 문화의 그릇을 놓습니다. 인큐베이터 잘 습도 하지 하는 경우에, 구조 탈수를 방지 하기 위해 부 화 하기 전에 금형 주위 셀 미디어 입금.
참고: 셀 미디어 유형의 셀 형식에 따라 달라 집니다 하지만 조작된 심장 조직 구조에 대 한 우리 RPMI 1640 + B27 보충 사용. - 45 분 후 인큐베이터에 반환 하기 전에 후드와 셀 미디어와 표지를 구문 반환 합니다.
- 변경 셀 미디어 셀에 대 한 필요한 모든 48-72 h 하 고 형식을 생성 합니다.
참고: 미디어 변경 최대 셀 건강을 보장 하기 위해 공급 업체에서 제공 하는 권장된 지침에 따라 계획 되어야 합니다. 구문 방해를 피하기 위해 주의 미디어를 변경할 때 사용 합니다. 우리는 부동, 구문 문제를 경험 하지 않았다 하지만이 경우, 그것은 미디어 수준을 넘어 확장 하는 금형 설계에 키가 게시물을 추가 하 여 막을 수 있습니다. - 사용 후, 10% 표 백제, 70% 에탄올으로 순차적으로 금형 세척 및 증류수. 다음 최대 건조, 그리고 재사용에 대 한 고압 공기 ~ 10 번.
5. 분석 기법: 조직 압축
참고: 매트릭스 개장에서 발생 하는 압축 조직 생존 능력 및 개발 광학 현미경 및 이미지 분석을 통해 쉽게 측정할 수 있는 지표 이다.
- 금형 주조 후 96 h 2 h에서 배열 하는 시간 간격에서 구문의 광학 현미경 이미지를 수집 합니다.
참고: 낮은 정도의 요구 확대로 인해 카메라 마운트 해 부 현미경은이 응용 프로그램에 적합 합니다. - ImageJ 같은 이미지 분석 제품군 표시 구성 영역 추적 (오픈 소스, imagej.nih.gov/ij/).
- 속도 압축 (그림 2)의 최종 학위를 분석 합니다.
6. 분석 기법: 인장 시험
참고: 모두 활성 역학 (힘 또는 세포 활동으로 인해 설계 조직에 의해 생성 된 긴장) 수동 역학 (힘 또는 긴장 응답 적용된 긴장 또는 힘으로 생성 된)는 설계 많은 중요 한 기능적 특성 조직, 그리고이 사실이 특히 설계 된 심장 조직에 대 한입니다. Micromechanical 분석기는 분석에 사용 되는 재료의 테이블에에서 설명 되어 있습니다. 다른 기계 테스트 기구 적용할 수 있습니다 마찬가지로 그들은 수 화 된 테스트에 대 한 허용 길이 제어 할 수 있다 및 범위와 해상도 관련 조직에 대 한 측정을 강제로. 횡단면 지역 단일 평방 밀리미터의 순서와 수십 kPa 순서 stiffnesses 조직, 5 미네소타 로드 셀 잘 맞는입니다. 더 큰 고 엄격한 재료 더 큰 부하 셀이 필요 합니다. 테스트, 이전 힘 변환기와 길이 컨트롤러 올바르게 보정 확인 합니다.
- 길이 컨트롤러, 변환기, 펄스 발생기, 및 온도 컨트롤러를 강제로.
- Tyrode의 솔루션 (1.8 m m 염화 칼슘, 염화 마그네슘 1.0 m m, 5.4 m m 염화 칼륨, 140 m m 염화 나트륨, 인산 나트륨 0.33 m m, 10 mM HEPES, 및 ddH2O, pH 7.4에 조정에서 5 mM 포도 당)에 대 한 기계적 테스트 여 물 채우기 심장 조직 설계. 목욕 온도 37 ° C의 유발은 열전대를 조정 합니다.
- 활성 수축 데이터를 수집 하기 위한 기계적 테스트 프로토콜을 로드 합니다.
참고: 우리 활성 수축 기계를 사용 하 여 길이에 5% 변형 단계 최대 30%까지 증가 하는 길이 단계 프로토콜 120 개최 됩니다 평가 수축 힘 (그림 3A)에 긴장의 영향을 평가 하는 s. 또한, 우리는 10% 스트레인/min (그림 3B)의 일정 한 변형 율에서 풀 브레이크 프로토콜 통해 동적 기계적 특성을 평가 했습니다. 이러한 프로토콜은 모두 능동 및 수동 기계 분석에 대 한 좋은 시작 지점이 될 수 있습니다. - 절 개 범위에서 자유롭게 떠 있는 그런 조심 스럽게 PDMS 몰드에서 설계 된 조직 구조를 분리 합니다.
참고: 조직 압축 받은 Cellularized 구문 가능성이 이미 분리 될 인테리어 금형 표면에서 하 고 그 경우에 게 최소한의 조작 필요 합니다.- 압축 해제 구문 발생 한 하지, 집게를 사용 하 여 부드럽게 측면과 조직 손상을 방지 하려면 몰드의 하단에서 구조 분리.
- 집게를 사용 하 여, 부드럽게 구조를 선택 하 고 전송 기계 테스트 목욕 하.
- 해 부 현미경을 통해 구조를 보기를 힘 변환기 및 레버 팔에 연결 하는 고리 구조 끝을 탑재 합니다.
- 될 때까지 구조는 적용된 부담 없이 micromanipulator를 사용 하 여 레버 팔 위치를 조정 합니다. 0 길이 컨트롤러 및 컨트롤러 합니다.
- 이미지 분석을 통해 구성의 크기를 측정할 수 있도록 절 개 범위를 통해 구조를 이미지.
- 활성 힘 프로토콜을 시작 하 고는 수집 된 저장 데이터 프로토콜 되었습니다 완료 (그림 3).
- 수동 기계 데이터 뿐만 아니라 필요한 경우, 조정 레버 팔 다시 제로 적용된 긴장 될 때까지. 0 길이 컨트롤러를 강제로 및 두 번째 구문 이미지 로드 및 수동 역학 프로토콜 (그림 3)를 시작 하기 전에 시간. 수집 된 데이터를 저장 합니다.
7. 분석 기술: 파라핀 조직학 및 Immunohistochemistry
참고: 우리는 조직 형태는 가장 잘 보존 된 있도록 파라핀 블록을 사용 하 여 설계 된 조직 단면도 영상에서 큰 성공을 했다. 프로세스의 모든 단계를 신중 하 게 고려 하 고 진공 또는 압력 없이 샘플을 처리, 경험적으로 적절 한 항 원 검색 방법을 결정 하 고 1 차적인 항 체를 titrating를 포함 하 여 설계 조직에 맞게 조정 해야 합니다. 농도입니다. 냉동된 블록을 사용 하 여 슬라이드를 준비 하기 위한 다른 기술을 의도 된 응용 프로그램에 따라 충분 한 결과 생성 하는 동안 적은 시간과 비용을 요구할 수 있습니다.
- 절 개 범위에서 자유롭게 떠 있는 그런 부드럽게 PDMS, 구분 구문 및 PDMS 간에 미끄러져 집게를 사용 하 여 PDMS 몰드에서 설계 조직 구조 분리 신중 하 게. 고정을 위한 microcentrifuge 관에 이러한 구조를 전송 합니다.
참고: 깨지기 쉬운 구문 또는 금형 자체에 의해 제공 하는 정적 스트레스 조건 하에서 고정 될 수 있습니다 해결할 수 금형에서 잘 문화에서 솔루션을 변경 하 고 고정 후 금형에서 구조를 제거 하 여. - 바로 물속에 넣고 실 온에서 10 분 동안 4 %paraformaldehyde (PF)에 의해 설계 된 조직 수정. 조직 두께;의 1 m m 당 1 h 더 이상 추정 -수정 하지 마십시오.
- 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 조직 린스.
- 유지 하는 조직, 장소 그것 10-30 s, 분홍색 얼룩을 70% 에탄올으로 씻어 다음에 오신의 드롭.
참고: 핑크 색상 나중 단면에 대 한 파라핀 블록에 그것을 식별 하는 데 도움이 그리고 deparaffinization 동안에 멀리 세척 될 것 이다. - 조직학 카세트에 렌즈 종이에 조직과 장소를 포장. 사용 하 여 거품 패드 카세트에서 필요에 따라 조직 평면 유지.
- 파라핀 처리에 대 한 준비까지 70 %EtOH 4 ° C에서 저장소에 카세트를 잠수함.
- 에탄올 (2 x 30 분 각 70, 95, 100%)의 농도 증가에 탈수 하 여 조직을 처리 합니다. 다음 샘플 30 분 각 3 순차 자일 렌 온천에 목욕.
- 30 분 동안 3 순차 파라핀 욕조에 샘플 잠수함
- 카세트를, 신중 하 게 전개 하 고 렌즈 종이에서 오신 스테인드 조직을 제거 따뜻하고 파라핀 침투 조직을 파라핀 블록에 포함. 쉽게 단면 수 있도록 금형의 하단에 샘플을 주의 해야 합니다.
- 섹션 (5-8 µ m 두께)을 원하는 톰을 사용 하 여 조직 하 고 설계 조직 (그림 4)에 대 한 최적화 하는 표준 절차를 사용 하 여 얼룩.
참고: 파라핀 섹션 대신 냉동된 블록을 사용 하는 샘플의 형태를 손상 될 수 있지만입니다. 30% 자당 PBS에 3 h 또는 표본은 equilibrated (예를 들어, 하룻밤) 때까지 고정된 구조를 놓습니다. 50/50 v/v 30% 자당 및 최적의 절삭 온도 (10 월) 솔루션 1 헤 10 월 70%를 사용 하 여 보통 동결과 냉동된 블록 구문 장소에 대 한 매체를 동결 교환 EtOH 플라스틱 쟁반에서 동결 빠른 블록에 대 한 드라이 아이스 슬러리와. 섹션 10-50 µ m 두께 섹션 cryostat와 블록.
8. 분석 기술: 셀 맞춤
참고: 조직 모양 및 내부 스트레스 필드 조작 셀 맞춤, 많은 네이티브 조직의 정의 기능 조절 수 있습니다.
- PDMS의 형상의 금형에 설계 된 조직 구조를 준비 합니다.
- 문화 기간의 끝에, PBS에 구문 세척, 4%에서 수정 PF (단계 7.2 참조) 및 구조 단면 및 조직학 (섹션 7 참조)에 의해 영상에 대 한 준비를 수확 또는 전체 얼룩을 탑재.
참고: 전체 마운트 얼룩 조직학/immunohistochemistry 비슷한 단계를 다음과 같이 하지만 긴 부 화 기간, 필요 그리고 염료, 항 체, 및 어떤 이미징 기술 (와 같은 구문으로 빛이 침투 깊이)의 침투 깊이 구성 성분에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가 있다. - 조직 섹션 (금형 바닥의 평면에 평행한) 수평 평면에 동양 고 관심의 셀에 대 한 마커 얼룩. F-말라 레이블, phalloidin, 같은 사용 하 여 대부분 세포 유형의 말라 스트레스 섬유 표시. 또는 셀 특정 마커를 사용 하 여.
참고: 설계 된 심장 직물의 경우 방향 sarcomeres α-actinin으로 물에 의해 결정 되었다. - 수동으로 모든 셀 또는 관심 영역에 핵의 주요 축 평가 하거나 (예를 들어, ImageJ, MATLAB) 도구를 사용 하 여 분석 합니다.
참고: (메쉬-같은 형상이 나 "핵심"에 "노드" 및 "번들" 지역) 및 "가장자리" 원형 형상에 같은 형상에 따라 같은 구성의 다른 영역을 분류 하는 것은 유용할 수 있습니다.
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Representative Results
레이저 절단기의 광학에 아주 약간 깊이 증가, 에칭으로 크기 감소 에칭된 영역 원인과 결과에 금형 레이저 광선의 가늘게 하 매우 미묘한 경사 벽으로 인해. 이 캐스트 PDMS 금형의 제거를 촉진 하는 데 도움이 됩니다 하지만 매우 깊이 부정적인 마스터 금형 에칭 경우 주의깊게 고려 되어야 한다 (> 6 m m)는 필수 (그림 1).
시간이 지나면서 문화에, cellularized 구조 매트릭스 개장, 비록 속도 범위는이 비 계 구성, 셀 부하에 따라 달라 집니다 발생 및 경작 조건 때문 압축 것입니다.
개장 하는 매트릭스 개편와의 주변 매트릭스 (새로운 매트릭스의 증 착), 저하를 통해 발생할 수 있지만 일반적으로 관련 된 기계적 강성 단면적에 있는 감소 때문에 증가. 콜라겐 전용 구문 1.6 mg/mL 콜라겐과 12 x 106 cardiomyocytes/mL의 구성, 우리 참조 구문 캐스팅 (그림 2) 압축 분석 결과 통해 다음 4 일 동안 그들의 초기 너비의 19.7 ± 2.8% 콤팩트. 이 분석 결과 3D 프로세스의 대표적인 2D 근사를 산출, 하는 동안 데이터 수집 및 비 파괴적인 자연의 용이성 하기가 구조 개발 과정 공부를 위한 강력한 도구. 조건 셀 문화, 셀의 부재에도 콜라겐 역학 수 변경 때문에 둘 다 시간이 지나면서 각자 집합 그리고 상호11. 섬유 소는 fibrinolysis에 의해 급속 하 게 저하 될 수 있습니다 모두 vivo에서 그리고 생체 외에서 경우 하지 존재 antifibrinolytic, aprotinin 또는 aminocaproic 산 성12등. 따라서, 장기 조직 개발 및 조직 형성 뿐 아니라 비 계 부품의 영향 구조 수립을 선택할 때 고려 되어야 한다. 최종 조직 크기는 특정 응용 프로그램에 대 한 중요 한 경우에, 압축 또한 고려해 야 금형 설계 및 실험적으로 결정 셀 파트와 매트릭스 구성에 따라. 그 조직을 압축 셀 맞춤 (그림 4)을 장려 하기 위해 cellularized 구문에서 조작할 수 있습니다 있는 조직 내의 스트레스 필드를 유도 또한 수 있습니다 note.
다양 한 비 계 폴리머 농도 밀도 시드 초기 셀 문학, 설계 조직 만드는 데 있다 고이 다양 한 세포 유형, 셀 라인, 및 응용 프로그램에 대 한 서로 다른 요구 사항에 주로 기 인할 수 있다. HiPSC 파생 cardiomyocytes와 우리 자신의 작품을 바탕으로, 우리가 믿는 1.25 mg/mL의 시드 밀도의 콜라겐 농도 ~ 15 백만 셀/mL은 좋은 시작 지점13. 또는, 섬유 소는 널리 사용 심장 조직 비 계 물자 뿐만 아니라로 일반적으로 3-4 mg/mL14의 범위에. 응용 프로그램에 따라 요인의 숫자에 따라 셀 밀도 시드를 선택할 수 있습니다 하지만 좋은 기준점을 제공 하는 네이티브 조직의 세포 밀도. 또한 농축된 셀 솔루션 작업, 특히 작은 볼륨에 대 한 도전 될 수 있다 고려 하십시오. 주어진된 세포 인구에 대 한 비 계 배합 조정 될 수 있다; 일반적으로 의해 증가 폴리머 농도 때 조직을 너무 깨지기 또는 압축, 그리고 조직 너무 뻣 뻣 한 또는15를 압축 하려면 실패 때 폴리머 농도 증가 시 휴식.
언제 든 지 수동 기계 분석을 수행 하기 전에 문화 중 포인트, 그것은 기계적으로 구성 샘플 precondition 적절 한 있을 수 있습니다. 천연 폴리머 hydrogels의 늘어진 그리고 설계 조직 점 탄성 소재 때문에 테스트 결과의 재현성을 증가 하 고 구조는 임상에서 전시 하는 속성의 더 나은 표시를 제공 응용 프로그램입니다. 우리는 기계 평가 (그림 3)를 시작 하기 전에 10% 스트레인/min의 속도로 삼각형 파형에 10% 스트레인의 8 주기를 사용 합니다.
조직 및 세포 형 특정 형태 전통적인 방법으로 조직학 및 immunohistochemistry 통해 평가 될 수 있습니다. 그러나, 우리는 파라핀 처리, 포함, 단면, 항 원 검색, 얼룩 되었습니다 필요한 조작된 심장 조직에 비해 셀을 도금 또는 네이티브 구분의 거의 모든 단계를 최적화 발견 조직 (그림 4).
그림 1 : 설계 및 레이저에서 PDMS 몰드를 준비 하는 과정의 개요 아크릴 마스터 컷. (A) 금형 디자인 벡터 그래픽 형식으로 준비. (B) 치료 레이저 에칭된 아크릴 부정적인 마스터. (C) PDMS 캐스팅 테이프 아크릴 마스터 몰드의 표면에. (D) 결과 PDMS 금형 살 균 이전에 조직 문화에 대 한 준비. 삽입: 평면도, 같은 규모. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 압축 문화에서 시간이 지남에 구축. (A) 직사각형 구조 문화에 시간이 지남에 triplicate 압축에서의 이미지. 녹색 오버레이 이미지 분석에 대 한 표시 구성 영역을 계산 하는 데 사용 하는 마스크를 나타냅니다. 시간이 지남에 구축 영역 (구조 압축의 2 차원 통계)의 (B) 줄거리. 수평 라인 평균값 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 모든 그룹, n = 3와 * p 를 나타냅니다 < 0.05로 ANOVA에 의해 평가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 설계 된 심장 직물의 기계적 특성에 대 한 원시 추적. 인세트 단일 대표 경련 수축 추적 (동일한 축 메인 플롯으로)를 표시합니다. (A) 활성 기계적 응답 보유 5% 부담 증가에 따른 빠른 단계에서 발생. (B) 수동 기계 응답 10% 스트레인/min의 속도로 풀 브레이크 테스트 결과. 모든 샘플은 Tyrode의 솔루션의 37 ° C 목욕에 분석 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 파라핀 블록 다양 한 디자인의 설계 된 심장 직물 구조를 위한 조직학 이미지. 다양 한 디자인의 설계 심장 조직 구조에 대 한 파라핀 블록 조직학 이미지 (A) 되며 고 오신, (B) diaminobenzidine (안티 심장 분 T, 갈색), 그리고 되며 핵 counterstain, (C 물 ) 빠른 녹색 세포질 counterstain, 및 (D) 마우스 안티-α-actinin 항 체 (녹색) 및 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstain (블루) 콜라겐에 대 한 picrosirius 빨간 얼룩. 셀 정렬 구조 설계 및 조직 압축의 결과로 다릅니다. 눈금 막대 A에 B와 C에도 적용 됩니다. D에서 인세트 紋 cardiomyocytes를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
조직 문화와 호환 되는 사용자 지정 된 PDMS 몰드 형상 조정 셀 정렬, 확산 속도, 효과적인 강성 같은 중요 한 설계 조직 속성에 훌륭한 유틸리티가 있다. 또한, 이러한 금형은 티슈를 준비 하 고 있는 기하학은 기계적 테스트16,17같은 중요 한 분석 응용 프로그램에 대 한 매우 유용 합니다. 전통적인 소와 관련 된 비용과 시간에 비해 할 때 특히 이러한 도구를 활용 하 여, 손쉬운, 빠르고 저렴 한 비용 방법 부정적인 마스터 금형 제공 잘라 레이저에서 이러한 장치를 준비. 레이저 절단은 또한 더 큰 최대 형 크기, 커터의 침대 크기에 의해서만 제한 허용합니다. 우리는 성공적으로 사용 이러한 다양 한 금형 설계 심장 조직, 활동 전위 전파의 광학 매핑, 힘과 생산 및 기계적 특성, 및 주입의 평가 포함 하 여 연구의 광범위 한 실행 심근 경색13,18쥐 모델. 우리는 심혈 관 재생 공학 연구 틈새, 넘어 분야 조직 공학, 약물 전달 및 재료 연구에 대 한 응용 프로그램은 광대 한 것 인식.
자신 금형의 제작에 몇 가지 기술적으로 도전적인 단계 동안, 거기 몇 가지 중요 한 단계를 기능 조직 생성에 관련 된 있습니다. 구문을 하지 않을 경우 24 시간 후 주변 매트릭스를 압축, 먼저 생존 설계 된 직물의 얼룩이 지를 통해 세포 생존 능력을 확인 합니다. 세포 생존 능력 높은 경우에 조직의 다음 세트에 대 한 구문을 구성 변경 하는 것이 좋습니다. 결과 셀 인구 크게 변화할 것 이다, 하는 동안 우리는 더 높은 시드 밀도 낮은 콜라겐 농도 증가 압축 관찰. 마지막으로, 그것은 또한 압축 장려 하 셀 형식이 매트릭스 개장, 섬유 아 세포 등 적합 시드 셀 인구를 보완 하기 위해 유용할 수 있습니다.
이러한 금형의 한계가 작은 소수 성 분자를 흡착 하는 PDMS에 대 한 가능성은. 우리의 응용 프로그램에 대 한이 문제가 되지 않았습니다, 그것은 이러한 분자의 손실에 매우 민감한 분석 실험에 관심 있을 수 있습니다. 이러한 경우에, PDMS 단백질 흡착은 polyhydrophilic 또는 polyzwitterionic 자료19등 antifouling 에이전트와 치료를 통해 완화할 수 있습니다. 또는, agarose 등 다른, 비 흡착 제 자료에 캐스팅 될 문화 몰드 (레이저 에칭 긍정적인 형)에서 부정적인 마스터 소독된 PDMS 몰드를 준비 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 NIH R00 HL115123 및 브라운 대학 공학에서 자금을 인정 합니다. 그들은 또한 교육에 대 한 크리스 황소와 브라운 디자인 워크샵에 게 감사는 고 레이저 커터와 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
