Summary
ونقدم هنا طريقة سريعة وسهلة ومنخفضة التكلفة لاختلاق قوالب مخصصة بولي دايمثيل سيلوكسان التي يمكن استخدامها لإنتاج الأنسجة المهندسة المستندة إلى المائية مع هندستها المعقدة. بالإضافة إلى ذلك يصف لنا نتائج التقييمات الميكانيكية وغذائها أجريت على أنسجة القلب هندسيا المنتجة باستخدام هذه التقنية.
Abstract
كما واصلت مجال هندسة الأنسجة الناضجة، كان هناك اهتمام زيادة في طائفة واسعة من المعلمات الأنسجة، بما في ذلك الشكل الأنسجة. التلاعب في شكل الأنسجة على الميكرومتر إلى مقياس سنتيمتر يمكن مباشرة محاذاة الخلية وتغيير خصائص ميكانيكية فعالة ومعالجة القيود المتصلة بنشر المواد المغذية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن نقلها السفينة التي يعد فيها أنسجة القيود الميكانيكية في الأنسجة، أسفر عن حقول الإجهاد التي يمكن أن تؤثر كذلك هيكل الخلية ومصفوفة على السواء. الأنسجة على شكل مع أبعاد استنساخه بشدة أيضا أن يكون أداة لفحوصات في المختبر في العينة التي يتم الأبعاد الحرجة، مثل تحليل الأنسجة كله الميكانيكية.
هذه المخطوطة يصف أسلوب تصنيع بديلة تستخدم قوالب رئيسية سلبية أعدت من اﻷكريليك الليزر المحفور: هذه القوالب أداء جيدا مع بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، ويسمح بالتصاميم مع الأبعاد على مقياس سنتيمتر وميزة أحجام أصغر من 25 ميكرون، ويمكن سرعة مصممة وملفقة بتكلفة منخفضة ومع الحد الأدنى من الخبرة. الحد الأدنى من الوقت وتكاليف متطلبات السماح لقوالب الليزر المحفور أن يتحرك سريعاً عند حتى يتحدد تصميم أمثل، ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب أي مقايسة المصالح، بما في ذلك تلك التي تتجاوز مجال هندسة الأنسجة.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، الطباعة الحجرية الناعمة وقد استخدمت على نطاق واسع كأسلوب تصنيع لدعم البحث العلمي، ولا سيما في ميادين ميكروفلويديكس وبحوث المواد والأنسجة الهندسة1،2، 3. صب النسخ المتماثلة، الذي يتم إنشاء كائن مع شكل المطلوب من العفن رئيسية سلبية، يوفر طريقة مريحة ومنخفضة التكلفة لإنتاج إيجابية PDMS وإنشاء نسخ متماثلة التي يمكن استخدامها لصب على شكل الهلاميات المائية. ومع ذلك، قوالب رئيسية سلبية المطلوبة عادة ما يتم إنتاجها باستخدام تقنيات ميكروفابريكيشن التي مكلفة، وتستغرق وقتاً طويلاً، محدودة الحجم، وتتطلب مساحة غرفة نظيفة ومعدات متطورة. بينما يوفر 3D الطباعة كبديل محتمل، فائدته محدودة نوعا ما بسبب حدود القرار الطابعات أقل تكلفة والتفاعلات الكيميائية بين المشتركة طابعة 3D البوليمرات و PDMS التي يمكن أن تحول دون علاج.
نظم الليزر كتر قادرة على كل القطع والنقش مواد مثل البلاستيك والخشب، والزجاج، والمعدن أصبحت مؤخرا جذريا أقل تكلفة وذلك أيسر منالاً لاختلاق أدوات البحث. تقطيع ليزر الصف التجارية قادرة على اختﻻق الأشياء بمقياس سنتيمتر مع الحد الأدنى من الميزات أقل من 25 ميكرون، وكذلك تتطلب الحد الأدنى من التدريب والخبرة، والوقت لاستخدام. بينما التذرية الليزر من PDMS وقد استخدمت سابقا في تصنيع أجهزة ميكروفلويديكس، لا مخطوط معرفتنا قد وصف عملية التي ملليمتر والسنتيمتر يمكن ملفقة قوالب الجدول من الليزر قطع القوالب السلبية الرئيسية4 .
أننا استخدمنا هذا الأسلوب أساسا للتعامل مع الشكل هندسة الأنسجة بغية تحسين نشر العناصر المغذية، ومحاذاة الخلوية، والخصائص الميكانيكية5،،من67. ومع ذلك، براعة هذا الأسلوب يسمح للاستخدام في أي مجال حيث مصبوب الهلاميات المائية ذات الأهمية، مثل المخدرات التسليم ومواد العلوم البحث8. مع الوصول إلى قاطع ليزر، يمكن جعل PDMS replicates العفن لما يقرب من أي هندسة دون يتدلى (التي سوف تمنع إزالة دون العفن متعددة أجزاء، وخارج نطاق هذه المخطوطة) والتي تتناسب مع أبعاد السرير الليزر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنشاء التصاميم العفن ناقلات الشكل الرئيسي
- تجميع هندسة العفن المرجوة في مكافحة ناقلات الشكل باستخدام برنامج رسومات المتجهات (انظر المواد والمعدات، والبرمجيات الجدول). حدد ملف | جديد وإنشاء لوحة قماشية الأبعاد المناسبة مع تنسيق الألوان RGB. إنشاء هندسة المطلوب باستخدام أدوات الشكل في اللوحة اليسرى: إدخال الأبعاد المطلوب في الجزء العلوي من النافذة (انقر فوق الزر تحويل أعلى إذا لم تكن مرئية في البداية) تحدد بدقة حجم الشكل.
ملاحظة: الهندسات العفن ينبغي أن تسمح حدود 6 مم على الأقل بين الحافة الميزات الأبعد وقطع الخط للسماح باقتطاع غضروف PDMS بعد صب العفن. سيسمح هذا العفن الانتهاء لتخطيط تدفق في الجزء السفلي من صحن الثقافة. علاوة على ذلك، ينبغي أن تراعي الهندسات العفن النظر في القيود المرتبطة بنموذج كتر الليزر التي سيتم استخدامها، بما في ذلك عرض الشق والحجم ميزة الحد الأدنى. الليزر المستخدمة للعمل الموصوف هنا (انظر المواد والمعدات، والبرمجيات الجدول) المميز بعرض الشق 0.2 مم وحجم ميزة محفوراً الحد أدنى 25 ميكرومتر (الحد الأقصى DPI 1000). ويمكن اختيار أبعاد العفن لاستيعاب سفينة ثقافة المطلوبة، مثل طبق 10 سم، أو لوحات 6-أو 24 جيدا. - فتح منتقي الألوان في الركن الأيمن العلوي من النافذة وتعريف حوامل اللون الجديد متوافق مع برنامج كتر الليزر.
ملاحظة: نحن نستخدم الأحمر (RGB 255, 0, 0) لقطع والأزرق (RGB 0، 0، 255) للنقش. ويمكن تعريف حوامل إضافية تبعاً لمتطلبات التصميم (على سبيل المثال، إذا كان المطلوب هو عمق الحفر أكثر من واحد).- تعيين هذه الألوان حامل لمسارات القطع بتحديد المسار ثم تحديد قطع الحامل للون المسار [بلا] للون التعبئة من منتقي الألوان.
- وبالمثل، تعيين حامل الألوان للنقش مسارات بتحديد الكائن ثم تحديد مسار النقش بلون التعبئة [بلا] للون المسار من منتقي الألوان.
- حفظ النماذج كتنسيقات الملفات or.pdf either.ai، اعتماداً على ناقلات الرسومات البرنامج والليزر كتر التوافق (الشكل 1A وملف تكميلي).
2-الليزر قطع قوالب ماستر اﻷكريليك
- حدد مواد سلبية رئيسية العفن.
ملاحظة: ربع بوصة سميكة اﻷكريليك مناسبة تماما لهذا التطبيق بسبب توافقه مع قطع الليزر، والتكلفة المنخفضة نسبيا، وسمك الذي يسمح لميزات تصل إلى ~ 5.5 ملم في الطول. ومع ذلك، قد تستخدم المواد الأخرى التي تفي بالشروط التالية كذلك: (ط) عدم رد الفعل مع علاج PDMS؛ (ثانيا) عدم-مسامية/بقوة لاصقة ل PDMS علاجه؛ (ثالثا) التخفيضات و etches نظيفة مع قطع ليزر؛ (رابعا) يحافظ زجاجي الدولة تصل إلى 60 درجة مئوية؛ (ت) من سمك متوافقة مع الارتفاع ميزة الحد الأقصى المطلوب. - إعداد كتر الليزر للقطع طبقاً لمواصفات الشركة المصنعة. ضمان أن يتم استخدام التهوية الكافية، وأن ارتفاع سرير هو معايرة بشكل صحيح إلى سمك المواد المختارة العفن رئيسية سلبية.
- فتح ملف التصميم في برنامج رسومات متجهات على جهاز الكمبيوتر متصلاً مقص الليزر، وانقر فوق الملف | طباعة. التأكد من أن القاطع ليزر يتم تعيين كالطابعة، وأن "لا مقياس" محدداً في تحجيم إسقاط إلى أسفل القائمة لمنع تشويه التصميم قبل النقر فوق الزر "طباعة" في الجزء السفلي من مربع الحوار طباعة.
- في الأداة المساعدة طباعة كتر الليزر، انقر فوق الزر " إعدادات " في الزاوية اليمنى السفلي. تعيين القوة والسرعة والبقول كل بوصة (PPI) الإعدادات لكل من الألوان المختارة مسبقاً لتعيين معلمات قص/أحفر لجميع ميزات التصميم.
ملاحظة: هنا، كتر الليزر مزودة بالليزر 75 واط (انظر المواد والمعدات، والبرمجيات الجدول)، الإعدادات المستخدمة ما يلي: الطاقة 100%، وسرعة 1%، و 000 1 PPI يخترق نظيفة ¼ "اﻷكريليك؛ الطاقة 100% وسرعة 8% 500 نقطة في البوصة etches إلى عمق 2.75 مم في اﻷكريليك؛ وسرعة الطاقة 100%، 5%، اتشيس 500 نقطة في البوصة إلى عمق 3.50 ملم في اﻷكريليك. إذا كان غير معروف لتكوين كتر الليزر أو المواد، يمكن تحديد هذه المعلمات تجريبيا من خلال التجربة والخطأ مع قطعة اختبار. - انقر فوق الزر الأخضر الكبير في البرنامج كتر الليزر لليزر حفر وقطع قوالب رئيسية سلبية.
- إعداد قوالب رئيسية سلبية لصب PDMS بإزالة أي حطام القطع المتبقية مع فرش صغيرة و/أو الهواء المضغوط (الشكل 1B).
3-إعداد قوالب PDMS للخلية أو زراعة الأنسجة
- إعداد مزيج صب PDMS وفقا لمواصفات الشركة المصنعة لها. إعداد 0.35 مل/سم2 للقالب الرئيسي؛ هذا وسوف تختلف استناداً إلى الميزات العفن والارتفاع.
- ديغا PDMS المعدة في فراغ غرفة متصل بخط فراغ مختبر قياسية (< 500 ملم زئبق) لح 1، أو حتى أزيلت جميع الفقاعات.
- الشريط الحافة الخارجية للقالب مع الفينيل أو إخفاء الشريط (تسمية الملونة الشريط يعمل جيدا) أن يمتد الشريط > 3 مم فوق الوجه المحفور من العفن رئيسية سلبية. اضغط على الشريط بحزم ضد الجانب من القالب لمنع تسرب في وقت لاحق.
ملاحظة: إذا كان القالب الرئيسي اﻷكريليك يتميز من خلال الثقوب، قد يكون من الضروري تطبيق الشريط على الجزء السفلي من العفن، وكذلك (الشكل 1). - صب PDMS ديجاسيد على الوجه المحفور من العفن رئيسية سلبية.
ملاحظة: يمكن جعل الهدف سمك PDMS سوف تعتمد على التطبيق، على الرغم من العفن PDMS سميكة وقيعان التصوير صعبة. سمك الحد أدنى من ~ 1.5 مم توازناً جيدا بين التصوير الاعتبارات وسهولة إزالة العفن. - ضع القالب الرئيسي السلبية المغلفة PDMS في فراغ غرفة وديغا مرة أخرى لح 1، أو حتى أزيلت جميع الفقاعات.
- ضع القالب الرئيسي السلبية ديجاسيد PDMS المغلفة في فرن 60 درجة مئوية لعلاج لضمان أن الفرن الرف هو المستوى على الأقل 6 ﻫ.. بدلاً من ذلك، تسمح PDMS لعلاج عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، أو في درجة حرارة الغرفة ل ~ ح 72.
- إذا تم تحويل قوالب متعددة على نفس القالب الرئيسي السلبية، استخدام ريزربليد لقطع هذه القوالب عن بعضها البعض في حين أنها لا تزال على القالب الرئيسي السلبية. ثم قشر كل العفن PDMS الخروج من القالب الرئيسي السلبية. ضمان جمع قوالب PDMS ببطء وبعناية لمنع ميزة العفن تمزق أثناء جمع.
- باستخدام شفرة حلاقة، تقليم قبالة المناطق مع غضروف من الصب، مما يؤدي إلى منع العفن من المواد المسطحة، فضلا عن أي فائض الكذب أو الحطام (الشكل 1).
- إذا لزم الأمر، بإعداد قوالب لصب خلية/الأنسجة بالتعقيم.
4-يلقي بالكولاجين والأنسجة المائية فيبرينوجين
ملاحظة: استخدم إجراء العقيم سليم للحفاظ على العقم.
- تلتزم قوالب إلى الجزء السفلي من السفينة المطلوب. تلتزم قوالب جديدة إلى أسفل لوحة المعالجة غير زراعة الأنسجة عن طريق الضغط بشدة العفن ضد البلاستيك غير المعالجة (بسبب hydrophobicity PDMS).
ملاحظة: ومع ذلك، إذا تعامل زراعة الأنسجة البولي لاستخدامها، أو في حالة إعادة استخدام قوالب، التي تميل إلى الالتزام أقل شدة، غراء الطبيعية أو الاصطناعية (مثل تسرب فيبرينوجين أو سيليكون الشفاء بين عشية وضحاها) يمكن استخدامها لضمان الحجز. - إعداد الفيبرينوجين، ثرومبين، والكولاجين معادلتها الصب حلول مثل أنه يتحقق التركيز المطلوب لكل الأنسجة المدلى بها. الحفاظ على الكولاجين على الجليد حتى الصب.
ملاحظة: الفيبرينوجين وثرومبين لا ينبغي خلط حتى قبل الصب مباشرة. إذا لزم الأمر، يمكن أيضا أن الحلول الفيبرينوجين وثرومبين مبردة لزيادة الوقت البلمرة. وقد استخدمنا تركيز الفيبرينوجين نهائي بين 0-8 ملغ/مل، وتركيز ثرومبين نهائية بين 10-100 يو/مليلتر، وتركيز الكولاجين نهائي بين 0.8-2.0 ملغ/مل (الشكل 2). لانسجة القلب هندسيا، ونحن غالباً ما تستخدم cardiomyocytes في 12 × 106 خلايا/مل مع 1.6 ملغ/مل والفيبرينوجين 4 مغ/مل 20 يو/مليلتر ثرومبين (يتم إضافة ثرومبين قبل الصب مباشرة). وينبغي تحديد التركيزات المثلى (حتى خارج هذه النطاقات المقترحة) تجريبيا. - حصاد الخلايا عقب البروتوكولات القياسية وريسوسبيند بتركيز مناسب لتحقيق كثافة الخلايا الأولية المطلوب في الأنسجة المدلى بها.
ملاحظة: تم حصادها cardiomyocytes المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent كما هو موضح في ليان et al. 9 الحفاظ على الخلايا المقطوع على الجليد. وينبغي أن تحسب حجم الخلية عند إعداد تعليق خلية. وقد استخدمنا خلية تركيزات تتراوح بين 9-18 × 106 خلايا/مل، على الرغم من نطاقات الأمثل من المتوقع أن تختلف مع الخلية السكان (الشكل 2). - تجمع الفيبرينوجين، والكولاجين معادلتها وتعليق خلية (راجع الخطوة 4، 2 على سبيل مثال) لإنشاء مزيج صب. الاحتفاظ بهذا المزيج الصب على الجليد.
ملاحظة: درجات الحرارة الفيبرينوجين وثرومبين وتركيزات ستحدد حركية البلمرة؛ بغية منع البلمرة أثناء الصب، قد يكون من الضروري إعداد دفعات منفصلة من هذا المزيج الصب تبعاً لعدد وحجم من بنيات التي سيتم الإدلاء بها. - معالجة أسطح القالب الذي سوف يتعرض لهذا المزيج الصب للتخفيف من PDMS hydrophobicity (PDMS hydrophobicity زيادة البروتين الامتزاز وصعوبة الصب).
- تحقيق تعديل السطح ماء بعلاج مع البلازما الأوكسجين، كما هو الحال مع مولد المحمولة عالية تردد (مثلاً، BD-20A من انجالس الهندسية). فضح كل الأسطح من العفن اتصل الخليط خلية/هلام لعلاج البلازما ل s 3-5، وحوالي 5 دقائق قبل الصب.
- وبدلاً من ذلك تعامل مع خافض للتوتر السطحي، مثل F-127 بلورونيك (1% w/v)10. تنفيذ المعالجة السطحية بالقرب من وقت الصب قدر الإمكان، كما تغير قطبية سوف يتدهور مع مرور الوقت.
- فورا قبل الصب، إضافة ثرومبين إلى مزيج الصب ومزيج دقيق بيبيتينج صعودا وهبوطاً دون إدخال فقاعات.
- العمل بسرعة، "الماصة؛" مزيج الصب في القوالب، واستخدام الرعاية لإيداع هذا المزيج في جميع الزوايا والشقوق من العفن. تجنب قذف ماصة خارج المحطة الأولى لمنع تشكيل فقاعة داخل بنيات.
- كرر الخطوتين 4.6 و 4.7 حسب الضرورة لأي دفعات إضافية من مزيج الصب.
- مكان السفينة زراعة الأنسجة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. إذا لم يتم هوميديفيد الحاضنة جيدا، إيداع خلية الإعلام حول القوالب قبل الحضانة لمنع التجفاف بناء.
ملاحظة: نوع الوسائط المحمولة سوف تعتمد على نوع الخلية، ولكن لانسجة القلب هندسيا بنيات نستخدم RPMI 1640 + الملحق B27. - بعد 45 دقيقة، العودة بنيات إلى هود والغطاء مع الخلية وسائل الإعلام قبل العودة إلى الحاضنة.
- تغيير الوسائط خلية كل ح 48-72 حسب الحاجة للخلية وبناء نوع.
ملاحظة: ينبغي التخطيط وفقا للإرشادات الموصى بها التي يوفرها المورد لضمان صحة الخلية أقصى تغيير الوسائط. استخدم العناية عند تغيير وسائل الإعلام لتجنب الإخلال بنيات. ونحن لم تشهد مشاكل مع بنيات العائمة، ولكن إذا حدث هذا، فإنه يمكن منع عن طريق إضافة وظائف طويل القامة تصميم القالب التي تتجاوز مستوى وسائل الإعلام. - بعد الاستخدام، يغسل العفن التتابع مع التبييض 10%، 70% إيثانول، وماء مقطر. ثم الهواء الجاف، والاوتوكلاف لإعادة استخدام يصل إلى ~ 10 مرات.
5-تحليل التقنيات: انضغاط الأنسجة
ملاحظة: الضغط الناجم عن إعادة عرض مصفوفة هو مؤشر لسلامة الأنسجة والتنمية التي يمكن قياسها بسهولة من خلال التحليل المجهري والصورة الضوئية.
- جمع الصور الضوئية مجهرية من بنيات في قوالب الوقت زيادات تتراوح بين 2 ح 96 ساعة بعد الصب.
ملاحظة: بسبب انخفاض درجة التكبير المطلوبة، مجهر تشريح مع جبل كاميرا مناسبة تماما لهذا التطبيق. - تتبع منطقة بنية مرئية في جناح تحليل صورة مثل إيماجيج (مفتوحة المصدر، imagej.nih.gov/ij/).
- تحليل معدل والدرجة النهائية من الضغط (الشكل 2).
6-تحليل التقنيات: اختبار الشد
ملاحظة: كلا ميكانيكا النشطة (قوات أو السلالات التي تولدها هندسة أنسجة بسبب نشاط الخلية) وميكانيكا السلبي (قوات أو السلالات التي تم إنشاؤها في استجابة للضغوط المطبقة أو قوات) هي الخصائص الوظيفية الحيوية العديد من إجراء هندسة عكسية الأنسجة، وهذا صحيح بصفة خاصة لهندسة الأنسجة القلبية. ويرد وصف محلل ذبابة المستخدمة للتحليلات في الجدول للمواد. يمكن تطبيق أجهزة التجارب الميكانيكية الأخرى وبالمثل على افتراض أنها تسمح باختبار رطب وقادرون على التحكم في طول وقوة القياسات على نطاقات والقرارات ذات الصلة للأنسجة. للأنسجة، ومع المناطق مستعرضة يقارب ميليمتر مربع واحد وستيفنيسيس بناء على أمر من عشرات من الجيش الشعبي الكوري خلية تحميل 5 mN مناسباً. أكبر وأشد المواد يتطلب خلية تحميل أكبر. قبل الاختبار، والتأكد من أن كلا من محول طاقة القوة وتحكم طول هي محسوبة بشكل صحيح.
- قم بتشغيل وحدة تحكم طول، قوة محول طاقة ومولد النبض، ودرجة الحرارة.
- ملء الحوض اختبار الميكانيكية مع الحل في تيرودي (1.8 مم كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم 1.0 مم وكلوريد البوتاسيوم 5.4 مم، كلوريد الصوديوم 140 ملم، فوسفات الصوديوم 0.33 ملم، 10 مم حبيس والجلوكوز 5 ملم في ddH2س، عدلت إلى 7.4 درجة الحموضة) هندسة الأنسجة القلبية. ضبط الحرارية مثل درجة حرارة حمام 37 درجة مئوية ويتحقق.
- تحميل بروتوكول اختبار ميكانيكية لجمع بيانات انكماش النشطة.
ملاحظة: يمكننا تقييم ميكانيكا الهوس النشط باستخدام عقد بروتوكول خطوة طول بأي طول الخطوات في سلالة 5% بزيادة تصل إلى 30% من أجل 120 ثانية لتقييم تأثير الضغط على انكماش القوة (الشكل 3A). بالإضافة إلى ذلك، ونحن قد تقييم الخصائص الميكانيكية السلبي من خلال بروتوكول سحب لكسر إجهاد في الدقيقة 10% (الشكل 3B) بمعدل ضغط مستمر. كل من هذه البروتوكولات قد تخدم كنقطة انطلاق جيدة لتحليل الميكانيكية الإيجابي والسلبي. - تحت نطاق تشريح، فصل بعناية في بناء الأنسجة المهندسة من العفن PDMS، حيث أنه يتحرك بحرية.
ملاحظة: سيلولاريزيد بنيات التي خضعت لضغط الأنسجة سوف يرجح أن الفعل تكون منفصلة عن السطوح الداخلية العفن، وفي تلك الحالات التلاعب بالحد الأدنى المطلوب.- إذا لم يتسبب الضغط في بناء على إطلاق سراح، استخدام الملقط لفصل بنية بلطف من الجانبين والجانب السفلي من القالب لتجنب إتلاف الأنسجة.
- استخدام الملقط، تلتقط في البناء برفق ونقلها إلى الحمام اختبار الميكانيكية.
- عرض البناء من خلال مجهر تشريح، جبل حد سواء بناء على خطاطيف تعلق على محول طاقة القوة وذراع رافعة.
- ضبط موضع ذراع رافعة تستخدم في ميكرومانيبولاتور حتى يتم وضع بنية دون إجهاد التطبيقية. الصفر التحكم بطول وقوة تحكم.
- الصورة في البناء من خلال نطاق التشريح حيث أنه يمكن قياس أبعاد بناء عن طريق تحليل الصور.
- الشروع في البروتوكول قوة نشطة وحفظ في جمع البيانات بمجرد البروتوكول قد أكملت (الشكل 3).
- إذا كانت البيانات السلبية الميكانيكية مطلوبة كذلك، ضبط ذراع رافعة مرة أخرى حتى يكون هناك صفر سلالة التطبيقية. صفر الطول وقوة وحدات تحكم والصورة في بناء ثانية الوقت قبل تحميل وبدء البروتوكول ميكانيكا السلبي (الشكل 3). حفظ البيانات التي تم جمعها.
7-تحليل الأسلوب: علم الأنسجة البارافين وإيمونوهيستوتشيميستري
ملاحظة: قد كان لدينا أكبر نجاح في التصوير أقسام هندسة الأنسجة باستخدام كتل البارافين حيث مورفولوجيا الأنسجة هو الحفاظ على أفضل وجه. يجب أن تعتبر جميع الخطوات العملية بعناية ومصممة خصيصا للأنسجة هندسيا، بما في ذلك تجهيز عينات دون فراغ أو الضغط وتجريبيا تحديد أساليب استرجاع مستضد المناسبة، والمعايرة جسم الأولية التركيز. قد تتطلب أساليب أخرى، مثل استخدام كتل مجمدة لإعداد الشرائح، أقل من الوقت والنفقات حين تسفر عن نتائج كافية اعتماداً على التطبيق المقصود.
- تحت نطاق تشريح، فصل بعناية في بناء الأنسجة المهندسة من العفن PDMS استخدام الملقط انزلق بين بناء و PDMS فصل بلطف PDMS، حيث أنه يتحرك بحرية. نقل هذه الثوابت لأنبوب ميكروسينتريفوجي للتثبيت.
ملاحظة: ثوابت الهشة أو تلك التي تكون ثابتة تحت ظروف الإجهاد ثابتة المقدمة من العفن نفسه يمكن إصلاح في القالب بتغيير الحلول في الثقافة جيدا وإزالة البناء من العفن بعد التثبيت. - فورا إصلاح الأنسجة المهندسة بغمر في بارافورمالدهيد 4% (PF) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تقدير لا يزيد عن 1 ح كل 1 مم سمك النسيج؛ لا تصلح الإفراط.
- شطف الأنسجة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- حفظ الأنسجة الرطب، ضع قطره ثم على أنها لوصمة عار من الوردي ل s 10-30 ومن ثم شطف مع الإيثانول 70%.
ملاحظة: اللون الوردي يساعد على التعرف عليه في كتلة البارافين لتمزيقها لاحقاً وسوف تكون جرفت خلال ديبارافينيزيشن. - التفاف الأنسجة في ورقة عدسة ومكان في كاسيت علم الأنسجة. استخدام منصات رغوة في الكاسيت حسب الحاجة للحفاظ الأنسجة المسطحة.
- تغرق في الكاسيت في 70% EtOH ومخزن في 4 درجات مئوية حتى على استعداد لتجهيز البارافين.
- معالجة الأنسجة بالتجفيف في زيادة تركيزات إيثانول (2 × 30 دقيقة كل من 70 و 95 و 100%). ثم يستحم عينات في ثلاثة حمامات زيلين نفط متسلسلة لكل 30 دقيقة.
- غمر العينات في ثلاثة حمامات البارافين متسلسلة لكل 30 دقيقة.
- الاحماء أشرطة الكاسيت، بعناية تتكشف وإزالة الأنسجة الملطخة ويوزين من الورقة العدسة، وتضمين الأنسجة مخترقة من البارافين في كتلة بارافين. كن حذراً لوضع العينة شقة في الجزء السفلي من القالب لتمكين سهولة تمزيقها.
- قسم الأنسجة باستخدام مبضع النحو المطلوب (5-8 ميكرومتر سميكة) ووصمة عار باستخدام إجراءات معيارية الأمثل لهندسة الأنسجة (الشكل 4).
ملاحظة: بديل للمقاطع البارافين استخدام كتل مجمدة، على الرغم من أن علم التشكل العينة قد تتعرض للخطر. وضع بنيات ثابتة في السكروز 30% في برنامج تلفزيوني عن ح 3 أو حتى العينة متوازن (مثلاً، بين عشية وضحاها). تبادل الحل مع السكروز 30% v/v 50/50 ودرجة حرارة القطع الأمثل (OCT) تجميد المتوسطة لمكان حاء – 1 بنيات إلى كتل مجمدة مع أكتوبر تجميد المتوسطة باستخدام 70 في المائة EtOH مع ملاط الثلج الجاف لكتلة السريع التجميد في علب بلاستيكية. قسم القطع مع كريوستات إلى 10-50 ميكرومتر سميكة المقاطع.
8-تحليل الأسلوب: محاذاة الخلية
ملاحظة: التلاعب في شكل الأنسجة وحقول الإجهاد الداخلي يمكن أن تعدل محاذاة الخلية، سمة المميزة للعديد من الأنسجة الأصلية.
- إعداد بنيات هندسة الأنسجة في قوالب PDMS مع هندستها للفائدة.
- في نهاية فترة الثقافة، يغسل بنيات في برنامج تلفزيوني، الإصلاح في 4% PF (راجع الخطوة 7، 2) والحصاد بنيات للتحضير للتصوير بتمزيقها وعلم الأنسجة (راجع القسم 7) أو جبل كله تلطيخ.
ملاحظة: جبل كله تلطيخ يتبع خطوات مماثلة لعلم الأنسجة/إيمونوهيستوتشيميستري لكنه يتطلب وقتاً أطول من فترات حضانة، وسوف عمق الاختراق من الأصباغ، والأجسام المضادة، وأي تقنيات التصوير (مثل عمق تغلغل الضوء في بنيات) تحتاج يتحدد تجريبيا لتكوين بنية. - توجيه أقسام الأنسجة في الطائرة الأفقي (الموازية لطائرة أسفل العفن) ووصمة عار لعلامة الخلية للفائدة. استخدام على تسمية و أكتين، مثل فالويدين، وضع علامة على ألياف الأكتين الإجهاد لمعظم أنواع الخلايا. وبدلاً من ذلك، استخدم علامة خلية محددة.
ملاحظة: في حالة أنسجة القلب هندسيا، كان قرر التوجه ساركوميريس الملون مع α-أكتينين. - تقييم محورها الرئيسي لكافة الخلايا أو الأنوية في المنطقة لمصلحة يدوياً أو باستخدام تحليل أداة (مثلاً، إيماجيج، MATLAB).
ملاحظة: قد يكون من المفيد لتصنيف مناطق مختلفة من البناء نفسه، اعتماداً على الهندسة مثل (المناطق "عقده" و "حزمة" في شبكة مثل الهندسة، أو "الأساسية") و "ايدج" في هندسة دائرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بصريات كتر الليزر سيؤدي المناطق المحفورة قد انخفض قليلاً جداً أبعاد كزيادة عمق الحفر، والنتائج في العفن الجدران مع المجسم مشطوف الحواف دقيق جداً، يرجع إلى مستدق من شعاع الليزر. وهذا سيساعد في تسهيل إزالة قوالب PDMS المدلى بها، ولكن ينبغي النظر بعناية إذا كان محفوراً عميقا جداً قوالب رئيسية سلبية (> 6 مم) هي المطلوبة (الشكل 1).
على مر الزمن في الثقافة، سيتم ضغط سيلولاريزيد بنيات سبب مصفوفة يعيد البناء، على الرغم من أن معدل ومدى الذي يحدث هذا سوف يعتمد على تكوين سقالة، تحميل الخلية، واستزراع الظروف.
إعادة عرض مصفوفة يمكن أن يحدث من خلال إعادة التنظيم وتدهور المحيطة بها مصفوفة (فضلا عن ترسب المصفوفة الجديدة)، ولكن يرتبط عادة مع زيادة صلابة ميكانيكية بسبب الانخفاض في مساحة مقطعية. مع ثوابت الكولاجين فقط وتتألف من الكولاجين 1.6 ملغ/مل و 12 × 106 كارديوميوسيتيس/mL، نرى ثوابت الاتفاق إلى 19.7% 2.8 ± بهم العرض الأولية على مدى الأربعة أيام بعد الصب (الشكل 2) عن طريق فحص الضغط. أثناء هذا الفحص يعطي تقريب 2D ممثل من عملية ثلاثية الأبعاد، سهولة جمع البيانات وطبيعة غير مدمرة جعلها أداة قوية لدراسة عملية التنمية بناء. علما أن ظروف ثقافة الخلية، حتى في حالة عدم وجود خلايا، ميكانيكا الكولاجين يمكن أن تتغير بمرور الوقت نظراً لكل التجميع الذاتي و العابرة للربط11. فيبرينوجين يمكن أن يتحلل سريعاً من fibrinolysis في فيفو و في المختبر إذا كان عدم حضور أنتيفيبرينوليتيك، مثل حمض أبروتينين أو أمينوكابرويك12على حد سواء. ولذلك، ينبغي النظر في تأثير مكونات سقالة على التنمية طويلة الأجل الأنسجة، وليس مجرد تشكيل النسيج، عند اختيار صيغة بناء. إذا كان حجم الأنسجة النهائية الهامة لتطبيق معين، الضغط يجب النظر أيضا في تصميم القالب وتجريبية مصممة استناداً إلى تكوين خلية نوع (أنواع) ومصفوفة. لاحظ أن ضغط الأنسجة يمكن أن يستحث أيضا حقول الإجهاد داخل الأنسجة، التي يمكن التلاعب في بنيات سيلولاريزيد لتشجيع محاذاة الخلية (الشكل 4).
مجموعة واسعة من تركيزات البوليمر سقالة والخلية الأولى بذر الكثافة قد استخدمت لإنشاء هندسة الأنسجة في الأدب، وهذا يمكن أن يعزى أساسا إلى الاحتياجات المتباينة لمختلف أنواع الخلايا، وخطوط الخلية، والتطبيقات. يستند عملنا مع cardiomyocytes المستمدة من هيبسك، ونعتقد أن تركيز الكولاجين 1.25 ملغ/مل وكثافة بذر ~ 15 مليون خلايا/مل هو نقطة انطلاق جيدة13. وبدلاً من ذلك، فيبرينوجين يستخدم على نطاق واسع كمواد سقالة أنسجة قلبية كذلك، عادة في المجموعة من 3-4 مغ/مل14. يمكن تحديد الخلية البذر كثافة استناداً إلى عدد من العوامل اعتماداً على التطبيق، ولكن كثافة خلايا الأنسجة الأصلية توفر نقطة مرجعية جيدة. تنظر أيضا في أن الحلول خلية مركزة للغاية يمكن أن يصبح تحديا للعمل مع، خاصة بالنسبة للكميات الصغيرة. لعدد سكان خلية معينة، يمكن ضبطها في صياغة سقالة؛ عموما زيادة تركيز البوليمر عند الأنسجة هشة للغاية، أو كسر عند الضغط، وزيادة تركيز البوليمر عند الأنسجة هي قاسية جداً أو تفشل ضغط15.
قبل القيام بتحليل الميكانيكية الكامن في أي وقت نقطة خلال الثقافة، قد يكون من المناسب ميكانيكيا مسبق العينة بناء. حدد من البوليمر الطبيعي الهلاميات المائية وهندسة الأنسجة ستزيد إمكانية تكرار نتائج نتيجة الاختبار بسبب فيسكولاستيسيتي المواد وتوفر مؤشرا أفضل للخصائص التي سوف يحمل بنية في سريرية التطبيق. نحن نستخدم 8 دورات من سلالة 10% في الموجي ثلاثي بمعدل 10% سلالة/دقيقة قبل البدء بتقييم الميكانيكية (الشكل 3).
يمكن تقييم مورفولوجيا الأنسجة والخلايا من نوع معين عن طريق الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري بالطرق التقليدية. ومع ذلك، وجدنا أن الاستغلال الأمثل لما يقرب من جميع الخطوات البارافين التجهيز، التضمين وتمزيقها واسترجاع مستضد، وتلطيخ كان ضروريا لانسجة القلب هندسيا بالمقارنة مع مطلي بالخلايا أو مقطوع الأصلية الأنسجة (الشكل 4).
الشكل 1 : مخطط تفصيلي للعملية لتصميم وإعداد قوالب PDMS من الليزر قطع سادة اﻷكريليك. (أ) قالب تصميم أعدت في تنسيق رسومات المتجهات. الليزر تنظف (ب) ماجستير السلبية اﻷكريليك محفوراً. (ج) PDMS يلقي ظلالا على سطح القالب الرئيسي اﻷكريليك مسجلة. (د) PDMS الناتجة عن العفن وجاهزة للتعقيم قبل زراعة الأنسجة. داخلي: عرض أعلى، نفس المقياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : بناء الضغط على مر الزمن في الثقافة- (أ) صور من بنيات مستطيلة أعدت في ضغط ثلاث على مر الزمن في الثقافة. تراكبات الخضراء تمثل الأقنعة المستخدمة لحساب مجال بناء مرئية لتحليل الصور. (ب) الأرض لبناء منطقة (مقياس ثنائي الأبعاد لبناء ضغط) على مر الزمن. خطوط أفقية تمثل القيم الوسطية وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحراف المعياري. لجميع الفئات، n = 3 و * يشير إلى ف < 0.05 حسب تقييمه بواسطة ANOVA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : آثار الخام لتحديد الخصائص الميكانيكية لانسجة القلب هندسيا. عرض insets أثر انكماش نشل ممثل واحد (نفس المحاور كمؤامرة الرئيسية). (أ) النشطة الاستجابة الميكانيكية الناتجة عن الخطوات السريعة تليها يحمل في زيادات سلالة 5%. (ب) السلبي الاستجابة الميكانيكية الناتجة عن اختبار سحب لكسر بمعدل 10% سلالة/دقيقة. تم تحليل جميع العينات في حمام 37 درجة مئوية من الحل تيرودي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : البارافين كتلة الصور علم الأنسجة لانسجة القلب هندسيا بنيات من التصاميم المختلفة. البارافين كتلة الأنسجة الصور لانسجة القلب هندسيا بنيات لمختلف التصاميم ملطخة توضع (A) وويوزين، (ب) ديامينوبينزيديني (المضادة القلب تروبونين تي، براون)، وتوضع كونتيرستين النووية، (ج ) بيكروسيريوس الأحمر وصمة عار للكولاجين مع كونتيرستين هيولى الخضراء سريعة، والماوس (د) مكافحة-α-أكتينين جسم (الأخضر) و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) كونتيرستين النووي (أزرق). ويختلف محاذاة الخلية نتيجة لضغط التصميم والأنسجة وبناء. شريط مقياس في ألف تنطبق أيضا على ب وج. اقحم في د يظهر striated cardiomyocytes. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهندسات العفن PDMS المخصصة التي تتوافق مع نسيج الثقافة لها فائدة كبيرة في ضبط خصائص الأنسجة هندسيا هاما، مثل محاذاة الخلية، ومعدل انتشار، وصلابة فعالة. بالإضافة إلى ذلك، هذه القوالب مفيدة جداً لإعداد الأنسجة لتحليل تطبيقات الهندسة التي هامة، مثل اختبار الميكانيكية16،17. إعداد هذه الأجهزة من الليزر قطع عروض قوالب الرئيسية السلبية طريقة سريعة وسهلة، والتكلفة المنخفضة لاستخدام هذه الأدوات، وبخاصة عند مقارنتها بالوقت والتكلفة المرتبطة ميكروفابريكيشن التقليدية. قطع ليزر يسمح أيضا العفن الحد أقصى أكبر حجماً، محدودة فقط من حجم السرير لالة القطع. أننا استخدمت بنجاح هذه قوالب متعددة لتنفيذ طائفة واسعة من الدراسات مع المهندسة أنسجة القلب، بما في ذلك رسم الخرائط البصرية لإكثار إمكانات العمل، وتقييم خصائص القوة الميكانيكية الإنتاج الإيجابي والسلبي، وغرس في نموذج الفئران من احتشاء عضلة القلب13،18. نحن نسلم أن تتجاوز مكانة بحوث الهندسة التجدد القلب والأوعية الدموية، التطبيقات لهندسة الأنسجة الحقول وإيصال الأدوية، والمواد البحثية الواسعة.
بينما هناك بعض الخطوات تحديا من الناحية التقنية في تصنيع قوالب أنفسهم، هناك عدد من الخطوات الحاسمة التي تشارك في إنشاء أنسجة وظيفية. إذا فشلت بنيات لضغط المصفوفة المحيطة بها بعد 24 ساعة، أولاً تأكيد بقاء الخلية من خلال استمرارية تلطيخ الأنسجة المهندسة. إذا كانت الخلية صلاحية عالية، تنظر في تغيير التركيبة بناء للمجموعة التالية من الأنسجة. في حين أن النتائج سوف تختلف اختلافاً كبيرا تبعاً للسكان الخلية، لاحظنا زيادة الضغط المرتبطة بارتفاع كثافة البذر وتركيزات أقل من الكولاجين. وأخيراً، قد تكون أيضا مفيدة لتكملة السكان خلية المصنف مع نوع خلية مناسبة تماما لإعادة عرض مصفوفة، مثل الخلايا الليفية، تشجيع الضغط.
حد واحد من هذه القوالب هي إمكانية PDMS الجسميات الصغيرة الجزيئات مسعور. بينما لطلباتنا وهذا لم يكن مشكلة، قد يكون للقلق في فحوصات حساسة جداً لفقدان هذه الجزيئات. وفي هذه الحالات، يمكن تخفيف PDMS البروتين الامتزاز من خلال العلاج مع عامل المضادة للحشف على السفن مثل بوليهيدروفيليك أو بوليزويتيريونيك المواد19. بدلاً من ذلك، يمكن إعداد قالب PDMS معقمة كسيد سلبية (من العفن إيجابية محفوراً الليزر) للعفن ثقافة أن يلقي في مواد أخرى، غير الممتزة، مثل [اغروس].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب نعترف بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة R00 HL115123 وبراون جامعة كلية للهندسة. أنهم ممتنون أيضا لورشة التصميم براون وبول كريس للتدريب والدعم مع ليزر زورق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
