Summary
במסמך זה אנו מציגים שיטה מהירה, נתיישב ועלות נמוכה בדיית בתבניות polydimethylsiloxane מותאם אישית יכול לשמש לייצור המבוסס על הידרוג רקמות מהונדסים עם לסימולציה. בנוסף, אנו מתארים תוצאות הערכות מכני, היסטולוגית שנערכו על רקמות הלב מהונדסים המיוצר בעזרת טכניקה זו.
Abstract
כמו בתחום של הנדסת רקמות המשיכה להבשיל, היו עניין גדל במגוון רחב של פרמטרים רקמות, כולל רקמות צורה. מניפולציה רקמות צורה מיקרומטר לקנה המידה סנטימטר יכול לכוון יישור תא, לשנות תכונות מכניות יעיל, והכתובת מגבלות הקשורות דיפוזיה מזין בנוסף, הכלי שבו טישו מוכן להקנות אילוצים מכני על הרקמה, וכתוצאה מכך הלחץ ששדות נוספים יכולים להשפיע על מבנה התא והן מטריקס. בצורת רקמות עם ממדים מאוד לשחזור יש גם כלי עזר עבור במבחנה מבחני באיזו דגימה מידות הם קריטיים, כגון ניתוח מכני כל רקמות.
כתב יד זה מתאר שיטה חלופית פבריקציה נוספת ניצול שלילי בתבניות הבסיס שהוכנו אקריליק חרוט בלייזר: בתבניות אלה לבצע היטב עם polydimethylsiloxane (PDMS), היתר עיצובים עם ממדים על סולם סנטימטר, תכונה מידות קטנות יותר 25 מיקרומטר, ולא במהירות של מפוברק בעלות נמוכה ועם מומחיות מינימלי. זמן מינימלי ודרישות עלות מאפשרים חרוט בלייזר בתבניות כדי להיות במהירות iterated על עד עיצוב אופטימלי של נקבעת, ניתן להתאים בקלות בהתאם וזמינותו בכל עניין, כולל אלה מעבר בתחום של הנדסת רקמות.
Introduction
בשני העשורים האחרונים, הדפס אבן רכה שימש בהרחבה כמו טכניקה פבריקציה נוספת כדי לתמוך מחקר מדעי, במיוחד בתחומים של מיקרופלואידיקה חומרי מחקר, רקמות הנדסה1,2, 3. לכייר של עותק משוכפל, שבו נוצר אובייקט עם הצורה הרצויה תבנית בסיס שלילי, מציע במחיר נמוך ונוח שיטה לייצר חיובי ש-PDMS משכפל זה יכול לשמש הליהוק בצורת hydrogels. אולם, התבניות נדרש בסיס שלילית בדרך כלל מיוצרים בטכניקות מיקרו-מלאכותית כי הם יקרים, זמן רב, שגודל, מוגבל, נדרש שטח חדר נקי וכן ציוד מתוחכם. הדפסה תלת-ממדית מציעה חלופה פוטנציאלית, השירות שלה מוגבל במקצת בשל המגבלות ברזולוציה של מדפסות בעלות נמוכה, הגומלין הכימית בין פולימרים במדפסת תלת-ממד נפוצות PDMS זה יכול לעכב ריפוי.
מערכות לייזר חותך מסוגל גם חיתוך וגם תחריט חומרים כגון פלסטיק, עץ, זכוכית, מתכת הפכו לאחרונה באופן דרסטי פחות יקר, לכן לנגישה יותר עבור בדיית כלי מחקר. מסחרי כיתה לייזר מסוגלים בדיית אובייקטים בסולם סנטימטר עם מינימום שתכונות הקטנות מ מיקרומטר 25 ועוד יותר דורשים הכשרה מינימלית, המומחיות, הזמן להשתמש. בעוד לייזר אבלציה של PDMS בעבר שימש בייצור המכשירים מיקרופלואידיקה, לידע שלנו תיאר כתב היד לא תהליך על ידי איזה מ מ וסנטימטר בתבניות בקנה מידה יכול להיות מפוברק של לייזר לחתוך בתבניות בסיס שלילי4 .
השתמשנו בטכניקה זו בעיקר כדי לשנות את הצורה של רקמות מהונדסים על מנת לשפר את פיזור חומר מזין, יישור הסלולר ו תכונות מכניות5,6,7. עם זאת, הרב-גוניות של טכניקה זו מאפשרת הניצול בכל תחום היכן עי hydrogels של עניין, כמו סמים משלוח והחומרים המדע המחקר8. עם גישה בחותך לייזר, משכפל עובש PDMS יכול להתבצע עבור כמעט כל שינוי של גאומטריה ללא המסוכך (זה לעכב את הסרת ללא תבנית מרובה חלקים, אשר מעבר להיקף של כתב יד זה), זה מתאים לממדים של המיטה לייזר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. יצירת עיצובים עובש מאסטר בפורמט וקטורי
- להרכיב את הגיאומטריה עובש הרצוי בפורמט וקטורי באמצעות תוכנית גרפיקה וקטורית (ראה חומרים, ציוד, תוכנת בטבלה). בחר קובץ | חדש וליצור בד של ממדים המתאימים בעיצוב צבע RGB. יצירת הגיאומטריה הרצוי באמצעות כלי הצורה בלוח השמאלי של: הזן את הממדים הרצויים בחלק העליון של החלון (לחץ על לחצן ' שינוי צורה ' בראש אם אינם גלויים בתחילה) להגדיר במדויק את גודל הצורה.
הערה: עובש גיאומטריות צריך לאפשר לפחות 6 מ מ גבול בין הקצה של התכונות החיצוני את קו החיתוך להתיר זמירה של מניסקוס PDMS בעקבות עובש הליהוק. זה יאפשר כייר סיים להניח מיושר עם התחתית לצלחת תרבות. יתר על כן, עובש גיאומטריות כדאי להתחשב התחשבות מגבלות המשויכים למודל קאטר לייזר זה ישמש, כולל kerf רוחב וגודל מינימלי תכונה. הלייזר המשמש עבור העבודה המתוארים במסמך זה (ראה חומרים, ציוד, תוכנת בטבלה) מוצעים kerf 0.2 מ מ רוחב וגודל תכונה חרוט מינימלי של 25 מיקרומטר (DPI מרבי של 1,000). מידות עובש יכולה להיבחר כדי להכיל כלי התרבות הרצויה, כגון תבשיל ס מ-10 או 6 או 24-ובכן צלחות. - לפתיחת דוגם הצבע בפינה השמאלית העליונה של החלון ולהגדיר דוגמיות צבע חדש תואם את התוכנה קאטר לייזר.
הערה: אנו משתמשים אדום (255 RGB, 0, 0) לחיתוך, כחול (RGB 0, 0, 255) עבור חריטה. ניתן להגדיר את דוגמיות נוספות בהתאם לדרישות על העיצוב (לדוגמה, אם חריטה אחד או יותר עומק רצוי).- הקצאת צבעים אלה דוגמית לנתיבים חיתוך על-ידי בחירת הנתיב ולאחר מכן בחירת דוגמית הצבע שנגזרו עבור צבע נתיב, [ללא] עבור צבע המילוי מתוך דוגם הצבע.
- באופן דומה, להקצות צבעים דוגמית תצריב נתיבים על-ידי בחירה באובייקט ולאחר מכן בחירת הנתיב איכול עבור צבע המילוי, [ללא] של הצבע נתיב צבע מדוגם הצבע.
- שמירת עיצובים either.ai or.pdf תבניות קובץ, בהתאם וקטור גרפיקה תוכנית לייזר חותך ותאימות (איור 1A ו הקבצים המשלימים).
2. לייזר לחתוך התבניות אקריליק מאסטר
- בחר חומר עובש בסיס שלילי.
הערה: אקרילי בעובי מתאים יישום זה עקב התאימות שלו לחיתוך לייזר, עלות נמוכה יחסית, רבע אינץ ', עובי המאפשר תכונות עד ~ 5.5 מ מ גובה. עם זאת, חומרים אחרים המקיימים את הדרישות הבאות יכול לשמש גם: (i) ללא-תגובתי עם PDMS ריפוי; (ii) Non-נקבובי/חריפה דבק PDMS נרפא; (iii) חותך ו חורט נקיה בחותך לייזר; (iv) שומר על מזוגגות של המדינה עד 60 ° צלזיוס; (v) של עובי תואם גובה תכונה המרבי הרצוי. - להכין את החותך בלייזר לחיתוך בהתאם למפרט היצרן. ודא כי מספיק אוורור משמש כי גובה המיטה כראוי מכויל כדי עובי של החומר שבחרת עובש בסיס שלילי.
- פתח את הקובץ עיצוב בתוכנית גרפיקה וקטורים במחשב מחובר את החותך לייזר ולחץ על קובץ | הדפסה. ודא כי החותך לייזר מוגדרת כמדפסת כי "לעשות סולם לא" נבחר את קנה הנפתחת התפריט כדי למנוע עיוות של העיצוב לפני לחיצה על לחצן ' הדפס ' בתחתית תיבת הדו-שיח ' הדפסה '.
- השירות קאטר לייזר להדפסה, לחץ על הלחצן ' קביעות ' בפינה הימנית התחתונה. להקצות כוח, מהירות, פולסים לכל סנטימטר (PPI) הגדרות לכל אחד הצבעים שנבחרו קודם לכן כדי להגדיר את הפרמטרים לחרוט/גזור עבור כל התכונות עיצוב.
הערה: כאן, החותך לייזר מצוידים עם לייזר 75 וואט (ראה חומרים, ציוד, תוכנת בטבלה), בשימוש בהגדרות הבאות: 100% כוח, מהירות 1% ואת 1,000 PPI עוברת נקיה ¼" אקריליק; 100% 8% מהירות, והכוח 500 PPI חורט עד לעומק של 2.75 מ מ אקריליק; 5% 100% כוח, מהירות, 500 PPI חורט עד לעומק של 3.50 mm באקריליק. אם לא ידוע עבור לייזר חותך תצורה או חומר, פרמטרים אלה ניתן לקבוע מדעית באמצעות ניסוי וטעייה עם חתיכת מבחן. - לחץ הכפתור הירוק גדול בתוכנה קאטר לייזר לייזר לחרוט ולחתוך תבניות בסיס שלילי.
- להכין תבניות בסיס שלילי הליהוק PDMS על-ידי הסרת כל פסולת חיתוך שיורית עם מברשות קטנות ו/או באוויר דחוס (איור 1B).
3. מכינים את התבניות PDMS עבור תא או תרביות רקמה
- להכין תערובת הליהוק PDMS על פי מפרט היצרן שלה. להכין 0.35 מ ל/cm2 עובש האב; זה משתנים בהתאם תכונות עובש והגובה.
- דגה PDMS מוכן בתוך תא ואקום חיבור לקו ואקום מעבדה סטנדרטיים (< 500 מ מ כספית) 1 h, או עד כל הבועות חוסלו.
- קלטת את הקצה החיצוני של העובש עם ויניל או המסיכה קלטת (תווית בצבע קלטת טוב עובד) כך מרחיב הקלטת > 3 מ מ מעל הפנים חרוט של העובש בסיס שלילי. הקש את הקלטת בתקיפות כנגד הצד של העובש כדי למנוע דליפות בהמשך.
הערה: אם כייר בסיס אקרילי כולל דרך חורים, ייתכן צורך להפעיל טייפ לתחתית התבנית גם כן (איור 1C). - שופכים את PDMS degassed הפנים חרוט של העובש בסיס שלילי.
הערה: המטרה PDMS עובי תלויות היישום, למרות PDMS עבה עובש תחתית באפשרותך לבצע הדמיה מאתגר. עובי מינימלי של ~ 1.5 מ מ מכה איזון טוב בין שיקולים הדמיה קלות להסרת עובש. - מקום מצופים PDMS שלילי מאסטר העובש לתא ואקום, דגה שוב 1 h, או עד כל הבועות חוסלו.
- מניחים degassed מצופים PDMS שלילי מאסטר העובש לתוך תנור 60 ° C כדי לרפא במשך לפחות 6 ח' ודא המדף התנור אינו רמה. לחילופין, לאפשר את PDMS לרפא ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או בטמפרטורת החדר במשך ~ 72 h.
- אם בתבניות מרובות טרומיות דרוכות כייר באותו בסיס שלילי, השתמש מוריס שיחתכו בתבניות אלה כאשר הם עדיין על העובש בסיס שלילי. לאחר מכן, לקלף כל עובש PDMS את העובש בסיס שלילי. להבטיח כי PDMS בתבניות נאספים לאט ובזהירות כדי למנוע עובש תכונה קורע במהלך האיסוף.
- בעזרת סכין גילוח, לקצץ את אזורים עם מניסקוס ממחלקת הליהוק, שימנעו כייר חומר שטוח, כמו גם בכל עודפי שקרן או פסולת (איור 1D).
- במידת הצורך, להכין בתבניות לליהוק תא/רקמות על-ידי autoclaving.
4. הטלת קולגן ורקמות הידרוג פיברין
הערה: השתמש aseptic הליך ראוי לשמור על עקרות.
- דבקים התבניות לתחתית הכלי הרצוי. דבקים בתבניות חדשות בתחתית צלחת שטופלו תרביות רקמה בהקשת בחוזקה כייר נגד פלסטיק ללא טיפול (עקב hydrophobicity של PDMS).
הערה: עם זאת, אם מטופל תרביות רקמה פוליקרבונט כדי לשמש, או במקרה של שימוש חוזר בתבניות, אשר נוטים לדבוק פחות בחוזקה, דבק טבעי או סינתטי (כגון פיברין או סיליקון איטום נרפא במשך הלילה) יכול לשמש כדי להבטיח קובץ מצורף. - להכין פיברינוגן תרומבין, קולגן ינוטרלו השלכת פתרונות כך הריכוז הרצויה של אחד תושג ברקמה יצוקה. לשמור קולגן על הקרח עד הליהוק.
הערה: פיברינוגן ו תרומבין אסור לערבב עד מיד לפני היציקה. במידת הצורך, פתרונות פיברינוגן תרומבין יכול גם להיות צונן כדי להאריך את זמן הפילמור. השתמשנו ריכוז פיברינוגן הסופי בין 0-8 mg/mL, ריכוז תרומבין הסופי בין 10-100 U/mL, ריכוז קולגן הסופי בין 0.8 - 2.0 mg/mL (איור 2). עבור רקמות הלב מהונדסים, אנו מרבים להשתמש cardiomyocytes ב 12 x 106 תאים למ"ל עם 1.6 מ"ג/מ"ל, פיברינוגן 4 מ"ג/מ"ל של תרומבין U/mL 20 (תרומבין יתווסף מיד לפני היציקה). ריכוזים מיטביים (אפילו מחוץ לטווחים אלו המוצע) צריך להיקבע מדעית. - קציר תאים בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, resuspend-ריכוז המתאים להשיג צפיפות תא הראשונית הרצוי בתוך הרקמה יצוקה.
הערה: cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה האנושי נבצרו כפי שמתואר ליאן. et al. 9 לשמור את התאים שנקטפו על קרח. נפח התאים צריכים להיות אחראים בעת הכנת התליה תא. השתמשנו ריכוזים תא הנע בין 9-18 x 106 תאים למ"ל, למרות טווחים אופטימלית צפויים להשתנות עם אוכלוסיית תאים (איור 2). - לשלב את פיברינוגן ינוטרלו קולגן, תא ההשעיה (ראה שלב 4.2 לדוגמה) כדי ליצור תערובת הליהוק. שמור את התמהיל הליהוק על קרח.
הערה: טמפרטורות פיברינוגן ו תרומבין וריכוזי יקבע הפילמור קינטיקה; על מנת למנוע הפילמור במהלך הליהוק, ייתכן צורך להכין קבוצות נפרדות של המיקס הליהוק בהתאם למספר ונפח של המבנה זה יעברו המרה. - לטיפול של משטחי כייר אשר יהיו חשופים לתערובת הליהוק כדי להמתיק PDMS hydrophobicity (PDMS hydrophobicity להגדיל את החלבון ספיחה, להקשות את הליהוק).
- להשיג הידרופילית שינוי פני השטח על ידי טיפול עם חמצן פלזמה, כגון באמצעות גנרטור כף יד בתדירות גבוהה (למשל, BD-20A של הנדסה ליטון). לחשוף את כל המשטחים של העובש לפנות את התערובת תא/ג'ל לטיפול פלזמה עבור 3-5 s, בערך 5 דקות לפני הליהוק.
- לחלופין לפנק עם חומרים פעילי שטח, כמו Pluronic F-127 (1% w/v)10. ביצוע הטיפול משטח כמו קרוב לזמן הליהוק ככל האפשר, כמו שינוי קוטביות יחריף לאורך זמן.
- מיד לפני היציקה, להוסיף את תרומבין הליהוק לערבב, לערבב ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה בלי היכרות עם בועות.
- עובד מהר, pipette את המיקס הליהוק לתוך התבניות, באמצעות טיפול להפקיד את התערובת לתוך כל הפינות של מגרעות של העובש. הימנע פיפטה הוצאה מעבר התחנה הראשונה כדי למנוע היווצרות בועה בתוך המבנה.
- חזור על שלבים 4.6 ו- 4.7 ככל הדרוש עבור כל קבוצות נוספות של הליהוק ערבוב.
- מקם את הכלי תרביות רקמה חממה 37 º C למשך 45 דקות. אם החממה לא humidified טוב, להפקיד תא התקשורת סביב התבניות לפני הדגירה כדי למנוע התייבשות לבנות.
הערה: סוג המדיה הנייד יהיה תלוי סוג התא, אך עבור בונה מהונדסים ברקמת הלב אנו משתמשים RPMI 1640 + תוספת B27. - אחרי 45 דקות, לחזור בונה את הוד, לכסות עם המדיה הנייד לפני שחזר החממה.
- שנה המדיה הנייד בכל 48-72 שעות לפי הצורך עבור התא, לבנות סוג.
הערה: מומלץ לתכנן מדיה שינוי בהתאם להוראות המומלצת שסופקו על-ידי הספק כדי להבטיח בריאות המרבי. פעל בזהירות בעת שינוי בתקשורת כדי שלא להפריע למטופלים את המבנים. אנחנו לא חוו בעיות עם מבנים צפים, אך במקרה זה, ייתכן ניתן למנוע אותה על-ידי הוספת הודעות גבוה בעיצוב עובש שבולטים מעבר לרמה מדיה. - לאחר השימוש, התבניות ברצף עם אקונומיקה 10%, 70% אתנול, וקונטה מים מזוקקים. ואז אוויר יבש, החיטוי לשימוש חוזר עד ~ 10 פעמים.
5. ניתוח טכניקות: דחיסת רקמת
הערה: דחיסת הנובע מטריקס שיפוץ הוא מחוון של רקמות הכדאיות ופיתוח הניתן למדידה בקלות דרך מיקרוסקופ אופטי וניתוח התמונה.
- איסוף תמונות מיקרוסקופ אופטי של המבנה בתוך התבניות ב בפרקי זמן החל 2 h 96 h אחרי הליהוק.
הערה: בשל מידת ההגדלה הנדרש נמוך, מיקרוסקופ הקרע עם הר המצלמה היא מתאימה ליישום זה. - לאתר אזור לבנות גלוי בחבילת ניתוח תמונה כגון ImageJ (פתוח, imagej.nih.gov/ij/).
- לנתח את קצב ואת התואר הסופי של דחיסה (איור 2).
6. ניתוח שיטות: בדיקות
הערה: שני פעילים מכניקה (כוחות או זנים שנוצרו על-ידי רקמות מהונדסים בגלל פעילות התאים) פסיבי מכניקה (כוחות או זנים שנוצרו בתגובה זנים יישומית או כוחות) הם קריטיים מאפייני פונקציונליים רבים הנדסה לאחור רקמות, וזה נכון במיוחד עבור רקמות הלב מהונדסים. במנתח micromechanical המשמש עבור הבדיקות מתוארת בטבלה של חומרים. אחרים שההדרכה הבדיקה מכני יכול להיות דומה מיושם בהנחה הם לאפשר בדיקה רטוב ולא מסוגלים לשלוט אורך ולאלץ מדידות על פני טווחים ורזולוציות שרלוונטית הרקמה. בשביל לרקמות עם חתך אזורי הסדר מילימטרים מרובעים יחיד, stiffnesses הסדר של kPa עשרות, תא המטען 5 mN הוא מתאים. חומרים גדולים יותר נוקשה ידרוש תא מטען גדול יותר. לפני בדיקה, ודא כי כוח מתמר והן אורך בקר מכוילים כהלכה.
- הפעל את הבקר אורך, בכוח מתמר מחולל הפעימה, בקר טמפרטורה.
- למלא את השוקת הבדיקה מכני עם הפתרון של Tyrode (1.8 מ"מ סידן כלורי, 1.0 מ מ מגנזיום כלוריד, 5.4 מ"מ אשלגן כלורי, 140 מ מ נתרן כלורי, 0.33 מ מ סודיום פוספט, 10 מ מ HEPES ו 5 מ מ גלוקוז ddH2O, pH להתאים ל- 7.4) עבור מתוכנן רקמות הלב. התאם את צמד תרמי כך מושגת לטמפרטורה אמבט של 37 ° C.
- לטעון את נוהל הבדיקה מכני לאיסוף נתונים פעיל התכווצות.
הערה: יש הערכנו מכניקה כויץ פעיל באמצעות פרוטוקול שלב אורך באיזה אורך השלבים ב 5% זן הוספה של עד 30% מוחזקים תמורת 120 s כדי להעריך את ההשפעה של עומס על התכווצות כוח (איור 3 א). בנוסף, אנחנו העריכו פסיבי תכונות מכאניות באמצעות פרוטוקול משיכה-כדי-break בקצב למתח קבוע של 10% זן/min (איור 3B). שני פרוטוקולים אלה עשויים לשמש כנקודות התחלה טובה עבור ניתוח מכני פעיל וסביל. - תחת טווח לנתיחה, בזהירות ניתוק הבונה רקמות מהונדסים מן העיפוש PDMS, כך היא צפה בחופשיות.
הערה: בונה Cellularized שעברו דחיסת רקמת ככל הנראה כבר להיות מנותקת את המשטחים הפנימיים עובש, במקרים אלו נדרשת מניפולציה מינימלי.- אם דחיסה לא גרמה הבונה לשחרר, להשתמש מלקחיים בעדינות להפריד הבונה הצדדים ואת התחתון של העובש כדי למנוע נזק הרקמה.
- באמצעות מלקחיים, בעדינות להרים הבונה, להעביר אותו לאמבטיה בדיקות מכניות.
- הצגת הבונה דרך מיקרוסקופ לנתיחה, הר אחד מהקצוות של הבונה ווים מחובר מתמר כוח של זרוע מנוף.
- להתאים את מיקום זרוע המנוף באמצעות את micromanipulator עד הבונה היא ממוצבת ללא מאמץ יישומית. אפס את בקר אורך וכוח בקר.
- תמונה הבונה דרך הכוונת לנתיחה כך ניתן למדוד את ממדי הבונה באמצעות ניתוח תמונות.
- . הפעל את הנוהל כוח פעיל ולשמור את שנאספו הנתונים ברגע הפרוטוקול כבר הושלמה (איור 3).
- אם, כמו גם נתונים מכני פסיבי נדרשים להתאים את זרוע מנוף שוב עד שיש אפס זן יישומית. אפס את האורך ואת כוח בקרי תמונה הבונה שנייה לפני טעינת ויזמות פרוטוקול מכניקה פסיבי (איור 3). שמור את הנתונים שנאספו.
7. ניתוח הטכניקה: שעוות פרפין היסטולוגיה ו אימונוהיסטוכימיה
הערה: היו לנו את ההצלחה הגדולה ביותר של הדמיה רקמות מהונדסים למקטעים באמצעות בלוקים הפרפין כך מורפולוגיה הרקמה נשמר בצורה הטובה ביותר. כל השלבים של התהליך חייב להיות נחשב ובזהירות המותאמים לרקמת מהונדסים, כולל עיבוד הדגימות ללא אבק או לחץ, מדעית לקביעת שיטת אחזור אנטיגן מתאימות titrating נוגדן ראשוני ריכוז. טכניקות אחרות, כגון שימוש רחובות קפוא להכנת שקופיות, עשוי לדרוש פחות זמן וכסף תוך מניב מספקת בהתאם ליישום המיועד.
- תחת טווח לנתיחה, בזהירות ניתוק הבונה רקמות מהונדסים מ כייר PDMS באמצעות מלקחיים החליקה בין המבנה לבין PDMS להפריד אותו בעדינות PDMS, כך היא צפה בחופשיות. להעביר את המבנים האלה צינור microcentrifuge עבור קיבעון.
הערה: בונה שביר או אלה יש לתקן בתנאי לחץ סטטי שמספק את התבנית עצמה ניתן לתקן ב כייר על-ידי שינוי פתרונות בתרבות טוב, הסרת הבונה התבנית לאחר קיבוע. - מיד לתקן את רקמות מהונדסים על-ידי השוקע ב 4% paraformaldehyde (PF) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מעריכים יותר מ 1 h לכל 1 מ מ עובי רקמת; אל תתקן יתר על המידה.
- יש לשטוף את הרקמות עם פוספט buffered סליין (הציבורי).
- שמירה על הרקמה רטוב, במקום טיפה של eosin על הכתם הורוד עבור s 10-30 ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול.
הערה: הצבע הורוד מסייע לזהות אותו בבלוק פרפין על חלוקתה מאוחר יותר, תשטף במהלך deparaffinization. - עוטף את רקמת העדשה נייר ומקום קלטת כפפות. להשתמש קצף רפידות בקלטת לפי הצורך כדי לשמור על הרקמה שטוח.
- להטביע את הקלטת ב 70% EtOH ו החנות ב 4 ° C עד מוכן לעיבוד פרפין.
- לעבד את הרקמה על ידי dehydrating זה להגדיל את ריכוזי אתנול (2 x 30 דקות כל של 70, 95, ו- 100%). ואז לרחוץ דגימות, שלוש אמבטיות קסילן רציף למשך 30 דקות.
- להטביע את הדגימות, שלוש אמבטיות פרפין רציף למשך 30 דקות לכל.
- לחמם את הקלטות, בזהירות נפרשים להסיר את הרקמה שהוכתמו אאוזין מהעיתון העדשה ו להטביע את הרקמה הסתננו פרפין בבלוק פרפין. יש להיזהר שכב המדגם שטוח על קרקעית התבנית כדי לאפשר חלוקתה קל יותר.
- סעיף הרקמות באמצעות מיקרוטום כפי הרצוי (5-8 מיקרומטר עבה), כתם באמצעות הליכים סטנדרטיים אופטימיזציה עבור רקמות מהונדסים (איור 4).
הערה: אלטרנטיבה פרפין מקטעים אמנם להשתמש רחובות קפוא, מורפולוגיה של המדגם עלול להיות בסכנה. מקום המבנה קבוע 30% סוכרוז ב- PBS עבור 3 שעות או עד הדגימה equilibrated (למשל, בין לילה). להחליף את הפתרון עם v 50/50/v 30% סוכרוז וטמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) קפוא בינונית עבור ח' 1 למקם את המבנים רחובות קפוא עם OCT קפוא בינוני באמצעות 70% EtOH עם קרח יבש slurry לבלוק מהירה קפוא מגשי פלסטיק. מדור אבני עם cryostat 10-50 מיקרומטר למקטעים עבה.
8. ניתוח הטכניקה: יישור תא
הערה: לתמרן את הצורה רקמות והשדות מתח פנימי יכול לווסת תא יישור, תכונה המכונן של רקמות מקומיים רבים.
- הכינו את בונה רקמות מהונדסים ב PDMS תבניות עם גיאומטריות עניין.
- בסוף תקופת תרבות, לשטוף את בונה ב- PBS, לתקן ב 4% PF (ראה צעד 7.2) ו הקציר כדי להתכונן הדמיה על ידי חלוקתה היסטולוגיה (ראו פרק 7) או כל הר מכתים.
הערה: כל הר צביעת עוקב אחר שלבים דומים כדי היסטולוגיה/אימונוהיסטוכימיה אך דורש ממושכות דגירה, עומק החדירה של צבעים, הנוגדנים לכל טכניקות הדמיה (כגון עומק החדירה אור לתוך המבנה) יהיה צריך להיקבע מדעית להרכב לבנות. - אוריינט בסעיפים הרקמה במישור האופקי (מקביל למישור התחתון עובש), כתם על סמן התא של ריבית. השתמש תווית f-אקטין, כגון phalloidin, כדי לסמן סיבי אקטין מתח רוב סוגי תאים. לחלופין, השתמש סמן התא הספציפי.
הערה: במקרה של רקמות הלב מהונדסים, התמצאות נקבע על ידי sarcomeres מוכתם α-actinin. - להעריך את ציר מרכזי של כל התאים או גרעינים באזור עניין באופן ידני או באמצעות ניתוח כלי (למשל, ImageJ, MATLAB).
הערה: זה עשוי להיות שימושי לסווג אזורים שונים של הבונה אותו, בהתאם בגיאומטריה (אזורים "צומת" ו- "חבילה" גיאומטריה כמו רשת, או "הליבה") ו "קצוות" בגיאומטריה מעגלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המערכת האופטית של החותך לייזר יגרמו חרוט למקומות מאוד מעט פחתו מידות כמו תצריב עומק בעליות, תוצאות עובש בקירות עם שפוע מאוד עדין, בשל כדי מתחדדת קרן הלייזר. זה יעזור להקל על הסרת התבניות PDMS יצוקה, אבל יש לשקול בזהירות אם עמוק חרוט בתבניות בסיס שלילי (> 6 מ מ) הם הנדרש (איור 1).
במשך הזמן בתרבות, בונה cellularized ידחוס עקב מטריקס, שיפוץ, אבל את קצב ואת במידה שבה הדבר מתרחש תיקבע בהתאם להרכב לגרדום, תא מטען, ואת culturing תנאים.
מטריקס שיפוץ יכול להתרחש באמצעות כינוסים ושיקום חברות והן השפלה של שמסביב מטריקס (וכן בתצהיר של מטריקס החדש), אך מזוהה בדרך כלל עם עלייה נוקשות מכני עקב הירידה באזור חתך הרוחב. עם בונה קולגן בלבד מורכב cardiomyocytes 12 x 10 6/mL והקולגן 1.6 מ"ג/מ"ל, אנו רואים בונה קומפקטי ל- 19.7% 2.8 ± מרוחב הראשונית שלהם מעל בארבעת הימים בעקבות הליהוק (איור 2) באמצעות דחיסת וזמינותו. בזמן הזה assay התשואות הערכה 2D נציג של תהליך תלת-ממד, להקל על איסוף נתונים והטבע הרסניות שזה כלי רב עוצמה עבור לימוד תהליך הפיתוח לבנות. שים לב לכך בתנאים התרבות תאים, גם בהיעדר של תאים, קולגן מכניקה יכול להשתנות במשך הזמן בשל שניהם הרכבה עצמית ו- cross-linking11. פיברין יכול להיות מושפל במהירות על ידי ופיברינוליזה הן ויוו והן במבחנה אם לא בנוכחות antifibrinolytic, כגון aprotinin או אמינו קפרון חומצה12. לכן, יש לשקול את השפעת רכיבי לגרדום על התפתחות רקמת לטווח ארוך, ולא רק היווצרות רקמה, בעת בחירת ניסוח לבנות. אם הגודל הסופי רקמות חשוב עבור יישום מסוים, דחיסת חייב להיות גם נחשב שבלונה, מדעית נקבע בהתבסס על הרכב מסוג ומטריקס התא. שימו לב שכי דחיסת רקמת יכול גם לגרום מתח שדות בתוך רקמת, אשר ניתן לטפל בבונה cellularized לעודד תא יישור (איור 4).
מגוון רחב של ריכוזים פולימר לגרדום ותא הראשונית זריעה צפיפויות שימשו כדי ליצור רקמות מהונדסים בספרות, זה ניתן לייחס בעיקר דרישות שונות עבור סוגי תאים, שורות תאים ויישומים שונים. מבוסס על העבודה שלנו עם cardiomyocytes נגזר hiPSC, אנו מאמינים כי ריכוז קולגן של 1.25 מ"ג/מ"ל, צפיפות זריעה של ~ 15 מיליון תאים למ"ל הוא טוב המוצא נקודת13. לחלופין, פיברין משמש כחומר ברקמת הלב לגרדום, בדרך כלל בטווח של 3-4 מ"ג/מ"ל14. תא זריעה צפיפות ייתכן נבחרה בהתבסס על מספר גורמים בהתאם ליישום, אך תא הצפיפויות של רקמות מקורי לספק נקודת ציון טוב. גם לשקול פתרונות תא מרוכז יכול להיות מאתגר כלי עבודה, במיוחד עבור אמצעי אחסון קטן. עבור אוכלוסיה תא נתון, ניתן לכוונן את ניסוח לגרדום; בדרך כלל על ידי הגדלת ריכוז פולימר, כאשר רקמות חלשים מדי או לשבור דחיסה, ועל הגדלת ריכוז פולימר כאשר רקמות קשות מדי או להיכשל קומפקטי15.
לפני ביצוע ניתוח מכני פסיבי בכל עת הצבע במהלך התרבות, זה עשויים להיות מתאימים כדי מכנית precondition המדגם לבנות. Preconditioning של פולימרים טבעיים hydrogels ואת רקמות מהונדסים להגדיל את הפארמצבטית של תוצאת הבדיקה בשל viscoelasticity גשמי, מספקים אינדיקציה טובה יותר של המאפיינים הבונה תערוכת באופן קליני יישום. אנו משתמשים 8 מחזורים של 10% זן גל משולש בשיעור של 10% זן/דקה לפני הפעלת הערכה מכני (איור 3).
מורפולוגיה ספציפיים ברקמות, סוג התא יכול להידרש דרך היסטולוגיה אימונוהיסטוכימיה עם שיטות מסורתיות. עם זאת, מצאנו ש אופטימיזציה של כמעט כל השלבים פרפין עיבוד, הטבעה חלוקתה, אחזור אנטיגן, צביעת היה צורך רקמת הלב מהונדסים בהשוואה מצופה תאים או למחלקה יליד רקמות (איור 4).
איור 1 : קווי המתאר של תהליך עיצוב והכנת PDMS בתבניות של לייזר לחתוך מאסטרים אקריליק. (א) עובש עיצוב מוכן בתבנית גרפיקה וקטורית. (B) שירותי ניקיון לייזר חרוט אקריליק בסיס שלילי. PDMS (ג) להטיל על פני השטח של העובש בסיס אקרילי מוקלט. (ד) וכתוצאה מכך PDMS עובש מוכן עבור עיקור לפני תרביות רקמה. שיבוץ: מבט מלמעלה, אותו גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : לבנות דחיסת לאורך זמן בתרבות. (א) תמונות של מבנים מלבניים המבושלות דחיסת triplicate לאורך זמן בתרבות. כיסויי ירוקים מייצגים מסכות המשמש לחישוב שטח לבנות גלוי לניתוח תמונה. (B) חלקת לבנות באזור (מדד דו-ממדית של דחיסת לבנות) לאורך זמן. קווים אופקיים המייצגים את הערכים מרושע, קווי שגיאה מציינות סטיית התקן. עבור כל קבוצות, n = 3, * מציין p < 0.05 כפי שהוערכו ANOVA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : עקבות raw עבור אפיון מכני של רקמות הלב מהונדסים. כניסות להציג מעקב התכווצות עווית נציג יחיד (באותו צירים כמו העלילה המרכזית). (א) תגובה מכני פעיל הנובע מהירה שלבים ואחריו מחזיקה ב- 5% מתח דרגות. (B) תגובה מכני פסיבי הנובע מבחן pull-כדי-break בשיעור של 10% זן/min. כל הדגימות נותחו באמבטיה 37 מעלות צלזיוס של הפתרון של Tyrode. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : פרפין לחסום היסטולוגיה תמונות עבור מבני ברקמת הלב מהונדסים בעיצובים שונים. פרפין חסום היסטולוגיה תמונות עבור בונה מהונדסים ברקמת הלב של עיצובים שונים מוכתם hematoxylin (A) ואאוזין, (B) diaminobenzidine (אנטי-הלב טרופונין T, בראון) ולאחר hematoxylin גרעיני counterstain, (C ) picrosirius אדום כתם על קולגן עם counterstain cytoplasmic ירוק, נוגדן anti-α-actinin העכבר (D) (ירוק) ו 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) גרעיני counterstain (כחול). יישור תא שונה כתוצאה דחיסת רקמת ועיצוב לבנות. סרגל קנה מידה A חל על B ו- C כמו גם. שיבוץ ברה מראה cardiomyocytes תילומית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מותאם אישית גיאומטריות עובש PDMS התואמים לתרביות רקמה יש כלי נהדר ב כוונון מאפיינים חשובים רקמות מהונדסים, כגון יישור תא, קצב דיפוזיה יעילה נוקשות. בנוסף, הדגמים האלה הם מאוד שימושי עבור הכנת רקמות עבור יישומי ניתוח שבו הגיאומטריה חשוב, כגון מכונות בדיקה16,17. הכנת התקנים אלה של לייזר לחתוך בתבניות בסיס שלילי מציע שיטה מהירה נתיישב, בעלות נמוכה של ניצול כלים אלה, במיוחד כשמשווים הזמן ואת העלות המשויכת מסורתי מיקרו-מלאכותית. חיתוך לייזר מאפשרת גם מידה עובש מרבי גדול יותר, מוגבל רק על ידי גודל המיטה החותך. אנחנו משתמשים בהצלחה בתבניות אלה רב-תכליתי לביצוע מגוון רחב של מחקרים עם רקמות הלב מהונדסים, כולל מיפוי אופטי של הפצת פוטנציאל הפעולה, הערכה של כוח הייצור והן פסיביות תכונות מכניות, ועל ההשתלה במודל של עכברים של אוטם שריר הלב13,18. אנו מכירים כי מעבר הנישה מחקר של הנדסה משובי לב וכלי דם, היישומים עבור שדות הנדסת רקמות, תרופות, חומרי מחקר הם עצומים.
אמנם ישנם מספר צעדים טכנית מאתגר בייצור של התבניות עצמן, ישנם מספר שלבים קריטיים הכרוכים ביצירת רקמות פונקציונלי. אם בונה להיכשל קומפקטי המטריקס שמסביב לאחר 24 שעות, קודם לאשר את הכדאיות תא דרך מכתים הכדאיות של רקמות מהונדסים. אם התא הכדאיות גבוה, לשקול את שינוי ההרכב לבנות על הסט הבא של רקמות. ואילו תוצאות ישתנה בהתאם האוכלוסייה תא, הבחנו דחיסת מוגברת הקשורים צפיפויות זריעה גבוה יותר ריכוז נמוך יותר של קולגן. בסופו של דבר, זה גם עשויה להיות שימושית להשלמת האוכלוסייה תא הזריעה עם סוג התא המתאים מטריקס שיפוץ, כגון fibroblasts, לעודד את הדחיסה.
מגבלה אחת של תבניות אלה הוא הפוטנציאל עבור PDMS לספוח את מולקולות הידרופוביות קטנות. בעוד ליישומים שלנו זה לא היה בעייתי, זה עשוי להיות דאגה במבחני מאוד רגיש האובדן של מולקולות אלה. במקרים אלה, יש אפשרות לפתור PDMS חלבון ספיחה דרך הטיפול עם סוכן antifouling כגון חומרים polyhydrophilic או polyzwitterionic19. לחלופין, יכול להכין תבנית PDMS סטיריליים בתור אדון שלילי (מתוך נחרטו לייזר חיובי תבנית) עבור תבנית תרבות להיות מושלך בחומר אחר, שאינו adsorbent, כגון agarose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים להכיר מימון NIH R00 HL115123, בראון אוניברסיטת בית הספר להנדסה. הם אסירי תודה גם סדנת עיצוב בראון, כריס בול הדרכה ותמיכה עם לייזר חותך.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | |||
| Bovine fibrinogen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine thrombin | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinin | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collagen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodim chloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Corning | 4019862 | PDMS Molds |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Molds |
| Acrylic, 1/4" thick | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Molds |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, powder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesium chloride hexahydrate | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Potassium chloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histology |
| Frozen block molds | VWR | 25608-916 | Histology |
| Hematoxylin | Fisher | 3530 1 | Histology |
| Eosin Y | Fisher | AC152880250 | Histology |
| Fast green FCF | Fisher | AC410530250 | Histology |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A with 5 mN load cell | Mechanical Analysis |
References
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491 (2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008 (2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
