Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

محددة و "دقيقة كشف" spp. "الحمضيات تخضير الممرض" ليبيريباكتير Candidatus استخدام PCR التقليدية على "عينات الأنسجة أوراق الحمضيات"

Published: June 29, 2018 doi: 10.3791/57240
* These authors contributed equally

Summary

تخضير الحمضيات مرض لا سيما مدمرة التي تؤثر على المحاصيل الحمضيات على الصعيد العالمي. المقدمة هنا هو طريقة بسيطة باستخدام PCR واستخراج الحمض النووي الجينومي أنسجة أوراق الحمضيات لتحديد مسببات المرض تخضير الحمضيات، Candidatus ليبيريباكتير spp. صحيحة ودقيقة

Abstract

تخضير الحمضيات، المعروف أيضا هوانجلونجبينج، مرض الحمضيات مدمرة يجتاح مزارع الحمضيات على الصعيد العالمي. يسبب هذا المرض فالفليورايد ليف أصفر غير متناظرة الوريد اصفرار وتساقط الأوراق، تسوس الجذر، وفي نهاية المطاف، موت النبات الحمضيات. عند إصابة، قد توقف نمو النباتات الحمضيات وإنتاج الزهور خارج الموسم. هذه الزهور نادراً ما تعطي ثمارها، وتلك التي تدر الحمضيات الصغيرة، والمريرة، وشكل غير منتظم على شكل غير مرغوب فيه. وينتشر هذا المرض بسيليد الحمضيات الآسيوية، سيتري ديافورينا، وتطعيم الأنسجة الحمضيات المصابة. مسببات المرض بفترة حضانة طويلة ومتغير داخل المصنع الحمضيات – أحياناً سنوات، قبل أن تظهر الأعراض. محاولات للثقافة هذا الممرض في المختبر لم تكلل بالنجاح، ربما بسبب الانخفاض وتركيز متفاوت من مسببات المرض داخل إصابة الأنسجة الحمضيات، أو لأنه من الصعب إجراء نسخ متماثل البيئية ظروف مواتية لنمو مسببات المرض. من الصعب جداً تحديد المرض قبل أن ينتشر، بسبب فترة الحضانة الطويلة وعدم قدرة الباحثين على ثقافة الممرض. نتيجة لذلك فقط يصبح المرض الظاهر بعد تدمير كامل الغلة مزارع الحمضيات فجأة. قدم هنا وسيلة للكشف عن مسببات المرض تخضير الحمضيات، Candidatus ليبيريباكتير spp. باستخدام أدوات استخراج الحمض النووي الجينومي وبكر دقيقة ومحددة. هذا الأسلوب بسيطة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكيف للتحليل الكمي. هذا الأسلوب يمكن تكييفها للاستخدام على أي أنسجة الحمضيات؛ ومع ذلك، يحتمل أن تكون محدودة بمقدار الممرض في الأنسجة. على الرغم من ذلك، هذا الأسلوب سوف تسمح لمزارعي الحمضيات على تحديد النباتات الحمضيات المصابة في وقت سابق، وكبح انتشار هذا المرض المدمر قبل فإنه يمكن زيادة انتشار.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تخضير الحمضيات، يعرف أيضا باسم هوانجلونجبينج، تسببت في خسارة كبيرة من أشجار الحمضيات. حالة ممثلة واحدة هي ولاية فلوريدا، حيث المرض ومن المتوقع أن يسبب انخفاض بنسبة 70% في إنتاج مربعات فلوريدا البرتقال من مربعات 244 مليون في الموسم 1997-1998 إلى مربعات 70 مليون حتى موسم 2016-20171. ما يزيد على 90 في المائة أشجار الحمضيات في فلوريدا المصابة2، ويقدر أن صناعة الحمضيات في فلوريدا يفقد حوالي 1 بیلیون دولار أمريكي كل عام بسبب أمراض الحمضيات، حيث يلعب تخضير الحمضيات بدور رئيسي3. تخضير الحمضيات وينتشر أساسا عن طريق بسيليد الحمضيات الآسيوية الغازية سيتري ديافورينا، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر بتطعيم الأنسجة المصابة. هذا المرض يسبب اصفرار عروق فالفليورايد ليف أصفر غير متناظرة، تساقط الأوراق قبل الأوان، وسقم غصين، تسوس الجذر والموت من المصنع. الأهم من ذلك، يتسبب المرض مصنع الحمضيات لإنتاج الزهور خارج الموسم، التي نادراً ما تنتج الفاكهة. الثمرة التي تنتجه مصانع الحمضيات المصابة غير ناضجة، والأخضر، ومريرة تذوق4.

والغرض من هذا الأسلوب هو دقة ودقة التعرف بكتيريا متحركة Candidatus ليبيريباكتير spp.، المسبّب تخضير الحمضيات، الذين يعيشون داخل لحاء أشجار الحمضيات المصابة5. يتم استخراج الحمض النووي من نبات كامل الأنسجة، والتي تحتوي على البكتيريا الحية. يتم استخدام هذا الحمض النووي المستخرج كقالب لبكر التقليدية، حيث تستخدم النوكليوتيد مكملة ل 16S المتاشب تسلسل هذه البكتيريا لتضخيم هذا التسلسل. وتستخدم كعنصر تضخيم داخلية النوكليوتيد مكملة لجين فب الحمضيات. لقد اخترنا لاستخدام هذا الأسلوب، لأنه قد ثبت نجاحها في البحوث السابقة6.

يحتوي هذا الأسلوب ميزة واضحة بسيطة وغير مكلفة نسبيا، وقادرة على القيام بها في أي مختبر الكيمياء الحيوية مجهز بشكل طبيعي. وبالإضافة إلى ذلك، يبقى PCR الأسلوب الأكثر دقة ودقيقة للكشف عن هذه العوامل الممرضة، نظراً لصعوبة استزراع هذا الممرض7، والممرض القدرة على البقاء على قيد الحياة وتتكاثر لسنوات داخل مضيف أعراض8. وقد استخدمت العديد من التخصصات المختلفة PCR فحوصات بنجاح الكشف عن مسببات هذا المرض؛ بيد أن بكر التقليدية لا تزال المقايسة أبسط للكشف دقيقة ومحددة، لا سيما داخل المضيفين أعراض8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-عزل الحمض النووي من الأنسجة النباتية باستخدام مجموعة أدوات استخراج الجينوم

  1. الحصول على أنسجة أوراق الحمضيات بقطع جديدة كل ورقة من شجرة الحمضيات باستخدام مقص نظيف، ووضع الورقة في كيس ساندويتش بلاستيكي نظيف.
    ملاحظة: يجب وضع الحقيبة التي تحتوي على أنسجة نبات في ثلاجة 4 درجة مئوية أو على الجليد في حاوية معزولة أقرب بعد جمع لتجنب التلف.
  2. إضافة كمية صغيرة من النيتروجين السائل لالبرد قذائف الهاون والمدقة. في حين أنها تقشعر لها اﻷبدان، استخدام مقص لقطع قطعة صغيرة من نسيج ليف، حوالي 1 بوصة مربعة في حجم. مكان قطع الأنسجة بقذائف الهاون لتجميدها على الفور. إضافة مزيد من النيتروجين السائل، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يجب أن تلبس قفازات معزول دائماً أثناء التعامل مع النتروجين السائل.
  3. بسرعة طحن الأنسجة النباتية إلى مسحوق ناعم باستخدام قذائف الهاون. يستمر طحن حتى يتبخر النيتروجين السائل تماما، ولا يزال أخضر مسحوق ناعم.
  4. بإيجاز البرد ملعقة معدنية في النتروجين السائل عن 10-15 ثانية، ثم حلج القطن النسيج الأرضي داخل الهاون في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، استخدام الملوق.
  5. إضافة 600 ميليلتر من "نويات تحلل الحل" باستخدام (انظر الجدول للمواد) 1000 ميليلتر "الماصة؛" ودوامه العينة s 1-3، ثم احتضانها في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  6. إضافة 3 ميليلتر من "حل رناسي" إلى ليستي باستخدام ماصة 10µL، عكس أنبوب 2-5 مرات مزجها، واحتضان في 37 درجة مئوية في حاضنة مجلس الوزراء لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: السماح الخليط ليبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل المتابعة.
  7. إضافة 200 ميليلتر من "البروتين هطول الأمطار الحل"، دوامة في عالية السرعة عن 20 ثانية، ثم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 13,000 س ز لتشكيل بيليه راسخ. وبينما هو يجري تثفيل العينة، إضافة 600 ميليلتر من الايزوبروبانول درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي طازجة 1.5 مل.
  8. استخدام ماصة 1000 ميليلتر، بعناية إزالة المادة طافية من العينة سينتريفوجيد، نقلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 الطازجة التي تحتوي على الكحول. قد يتم الآن تجاهل بيليه.
    ملاحظة: تجنب تلويث المادة طافية مع البروتين بترك كمية ضئيلة من المادة طافية فوق بيليه.
  9. عكس الأنبوب حتى يصبح مرئياً ككتلة من الخيط تشبه خيوط الحمض النووي، ثم الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. صب المادة طافية، إضافة 600 ميليلتر من الإيثانول 70% لبيليه، وعكس الأنبوبة عدة مرات يغسل الحمض النووي، والطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  11. عناية نضح الإيثانول، تاركاً بيليه الحمض النووي فضفاضة، ثم فتح وعكس الأنبوب، يستريح على ورقة ماصة. الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  12. إضافة 100 ميليلتر من "الحمض النووي الإماهة الحل" إلى بيليه الحمض النووي المجففة، ثم احتضان الحمض النووي في حمام مائي 65 درجة مئوية ح 1، بينما خلط دورياً بالتنصت على الأنبوب.
  13. ضع 1 ميليلتر لتنقية المياه في ميكروكوفيتي، وأدخله في جهاز المطياف الضوئي لاستخدامه كقرص فارغ. حساب تركيز الحمض النووي الحالي بوضع 1 ميليلتر من العينة على ميكروكوفيتي، وإدراج جهاز المطياف الضوئي. ويمكن تركيز الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) عامل تمييع المحسوب ك (260-320) × × 50 نانوغرام/ميليلتر.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينة في 4 درجات مئوية.

2-إجراء PCR على عينات الحمض النووي

  1. الجمع بين 10 ميليلتر 2 x PCR ماجستير المزيج (انظر الجدول للمواد)، 1 ميليلتر الأمام التمهيدي (10 م/ميليلتر)، 1 ميليلتر عكس التمهيدي (10 م/ميليلتر) (انظر الجدول 2 لمتواليات التمهيدي)، 100 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج من العينة، وتنقية المياه (تصل إلى 20 ميليلتر الحجم النهائي) في 50 أنبوب بكر ميليلتر، ونفض الغبار لخلط، بإيجاز أجهزة الطرد المركزي.
  2. إدراج أنبوب بكر ثيرموسيكلير وتشغيل تبعاً لذلك (انظر الجدول 1).
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. إذا لزم الأمر، تخزين العينة عند 4 درجة مئوية بعد الانتهاء من رد فعل.

3-اليكتروفوريسي تضخيم الحمض النووي في [اغروس] هلام

  1. وزن ز 0.4 [اغروس] مسحوق وإضافته جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت x TAE 1 إلى 200 مل نظيفة قارورة Erlenmeyer، ملء يصل إلى 50 مل.
  2. الموجات الصغرية عالية لمدة دقيقة 1.5، تهز كل 30 ثانية، حتى يذوب [اغروس] تماما.
    ملاحظة: يجب أن تلبس القفازات المعزولة أثناء التعامل مع سائل [اغروس] لمنع حروق.
  3. إضافة ميليلتر 2.5 10 ملغ/مل اثيديوم بروميد السائل [اغروس] ويهز لمزيج، ثم صب سائل [اغروس] هلام في جل مستوى العفن. إدراج كومز القياسية 12-الأسنان هلام بسرعة بعد سكب.
  4. السماح هلام بارد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة امشاط هلام، ووضع الجل في مربع مستوى جل مليئة بالمخزن المؤقت x TAE 1.
  5. استخدام ميكروبيبيتي، تحميل عينات الحمض النووي تضخيم مجموع الآبار. إضافة سلم 5 ميليلتر من الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) في بئر منفصلة من العينات الخاصة بك.
  6. اليكتروفوريسي العينات لمدة 35 دقيقة في ثابت 90 الخامس، ثم إزالة الجل ومكان في ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية.
  7. تصوير وتحليل هلام النطاقات نمط أثناء استخدام تضوء الأشعة فوق البنفسجية في 302 نيوتن متر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

نتيجة إيجابية تعطي فرقة مميزة المقابلة إلى 500 bp آسيوي Candidatus ليبيريباكتير، Las606/وظيفي6و/أو عصابة متميزة المقابلة إلى 700 شركة بريتيش بتروليوم ل Laa2/Laj5، إدراج في β ريبوسومال 16S مشغل9. كما يجب أن تظهر الفرقة الرقابة الداخلية التضخيم في 400 شركة بريتيش بتروليوم. هذه الفرقة تتوافق مع تضخيم الجين فب الحمضيات10، ويجب أن تظهر النتائج لأن تعتبر صالحة (الشكل 1 و الشكل 2). عدم وجود كل 500 bp و 700 العصابات bp في الوقت الحالي عصابة bp 400 يمثل نتيجة سلبية. أداء بكر على عينات سليمة قد تسفر عن بعض أنماط النطاقات غير محددة حوالي 700 400 وشركة بريتيش بتروليوم bp؛ ومع ذلك، فقط عصابة واحدة جريئة المقابلة لهذه الأوزان الجزيئية يشير إلى نتيجة إيجابية (الشكل 1).

العملية درجة الحرارة. الوقت دورات
تمسخ الأولى 95 درجة مئوية 3-5 دقيقة 1
تمسخ 95 درجة مئوية 30 ثانية 35
الصلب 55 درجة مئوية 30 ثانية
استطالة 72 درجة مئوية 40 ثانية
استطالة النهائي 72 درجة مئوية 10 دقيقة 1

الجدول 1. ثيرموسيكلير الإعدادات المستخدمة لتضخيم الجينات المتاشب الهدف 16S والحمضيات فب.

اسم الدليل التسلسل مرجع
LAA2_F 5-تأت AAA الكبد TGA CCT عقاري هفوة TTT-3 ' هوكقويليت, et al.، 1999
LAJ5_R 5-هيئة مكافحة الفساد AAA جا الائتلاف آتا CGA الائتلاف A-3 هيئة مكافحة الفساد ' هوكقويليت, et al.، 1999
FBOX_F 5-وافق به جا قانون ضريبة تحويل العملة TCG التقييم القطري المشترك CT-3 ' هذا الإنزيم
FBOX_R 5-AGC أغا CCT السواقين تأت تأت ACG قانون G-3 ' هذا الإنزيم
LSS_F 5-GGA هفوة دايمنشن AGT GGA توري سی A-3 ' فوجيكاوا, et al., 2012
LSS_R 5-لجنة التنسيق الإدارية الجهاز المركزي للمحاسبات القط كبار المستشارين التقنيين GGT C-3 AAA الجميح للسيارات ' فوجيكاوا, et al., 2012

الجدول 2. اسم الإشعال وتسلسل الحمض النووي، ومرجع.

Figure 1
رقم 1. نتائج تحليل PCR التقليدية من أربع عينات الأنسجة المصابة أوراق الحمضيات وعينتين هياثي المستخدمة كعناصر سلبية. 'جدنا' يشير إلى عينة الحمض النووي جينومي المستخرجة من أنسجة أوراق الحمضيات. عينات جدنا 1 وجدنا 4 من عينات مصابة أوراق الحمضيات؛ جدنا 2، 3، 5 و 6 Candidatus ليبيريباكتير أسياتيكوم (مؤسسة) إصابة عينات. تم استخراج الحمض النووي كما هو مكتوب في البروتوكول. تم إجراء PCR باستخدام الحمض النووي المستخرج كقالب، في البروتوكول (انظر الجدول 1). LAA2/LAJ5، LAS606/وظيفي، و فب تشير إلى مجموعات التمهيدي المستخدمة (انظر الجدول 2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. صورة جيل كامل من ثلاث عينات جدنا تضخيم. عينة 1 هو النسيج الحمضيات السليم؛ عينات 2 و 3 عينات الأنسجة مؤسسة المصابة. وتناظر هذه العينات جدنا 1 و 2 و 3، كما هو مبين في الشكل 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

من الأهمية بمكان أن يتم اتباع جميع الخطوات بالضبط لتحقيق أفضل الظروف التجريبية. تم استخدام أنسجة نبات كامل خلال هذه التظاهرة؛ ومع ذلك، يمكن تعديل البروتوكول نظرياً تضمين أي نوع من الأنسجة النباتية. سابقا، الباحثين استخراج الحمض النووي من نبات الوريد الأنسجة، بدلاً من أنسجة نبات كامل، وتحققت نتائج مماثلة11. في حال ظهور الفرقة المقابلة للجينات فب الحمضيات، النتيجة غير صحيح، وقد يكون هناك واحد أو أكثر من العديد من الأخطاء التقنية في إجراءات التشغيل. تتضمن الأخطاء الشائعة: استخدام المياه الملوثة أو معقمة، ونصائح ميكروبيبيتي، أو أنابيب ميكروسينتريفوجي؛ عدم إضافة واحد أو أكثر من المكونات الضرورية في مزيج PCR أو أثناء استخراج الحمض النووي الجينوم؛ الفشل في المحافظة على ظروف ثيرموسيكلير السليم؛ استخدام الكواشف أو المكونات الأخرى التي في الماضي تاريخ انتهاء الصلاحية؛ عدم إضافة اثيديوم بروميد أو الحمض النووي آخر وصمة عار على [اغروس] هلام؛ اليكتروفوريسينج تضخيم الحمض النووي في جهد عالية جداً، أو لفترة طويلة جداً؛ واستخدام المخزن المؤقت تاي القديمة أو مختلطة، أو ببساطة باستخدام المياه بدلاً من المخزن المؤقت تاي لملء مربع هلام.

واختيرت كبسولة تفجير LAA2_F و LAJ5_R من البحوث السابقة بسبب نجاحها في تحديد Candidatus ليبيريباكتير أسياتيكوم وأفريكانوم. كبسولة تفجير هذه تضخيم الجينات وحدة فرعية ريبوسومال ربلا و ربلج، تسفر عن جزء بلغة bp 669 تضخيم من جيم ل. أفريكانوم أو جزء bp 703 من جيم. ل. أسياتيكوم9. اختيرت كبسولة تفجير LSS_F و LSS_R لهذا التحليل من البحوث السابقة بسبب المنشأة انخفاض معدل السلبية الكاذبة، ودقتها، وخصوصية ل C. ل. أسياتيكوم. مجموعة التمهيدي وظيفي يستفيض تسلسل bp 500 في كل ثلاثة جينات المتاشب على 16S هذا في C. ل. أسياتيكوم6. شيدت لاستخدامها كعنصر تضخيم داخلية كبسولة تفجير فب وتضخيم تسلسل bp 400 وجدت في مصانع الحمضيات. وتبين البحوث السابقة أن فبوكس هو ستابلي أعرب في مصانع الحمضيات، وسيجعل مرشح كبير للاستخدام كجين إشارة عند تكييف هذا التحليل ل RT-قبكر10.

هذا التحليل يمكن تكييفها لاستخدامها لأي نوع من الأنسجة الحمضيات، ويمكن تعديلها للاستخدام مع فحوصات إضافية المستندة إلى بكر، مثل الرايت qPCR. القيود المفروضة على هذا التحليل قليلة، ومعظمها الملازمة لبكر التقليدية. وتشمل هذه العوامل تحد: وجود الإيثانول أو غيرها من المواد الكيميائية المثبطة في مزيج PCR، والافتقار إلى كوانتيتيشن دون القيام مقايسة أكثر تقدما، والحاجة ثيرموسيكلير في مختبرات أصغر، ووجود تلوث الحمض النووي.

رغم الطابع الخاص لهذا الفحص لا مقارنة مباشرة بأساليب RT qPCR أكثر تحديداً، هذا التحليل مفيد للعلماء إجراء أبحاث على ليبيريباكتير Candidatus ، والمزارعين تسعى إلى تشخيص احتمال إصابة أشجار الحمضيات الأشجار في الميادين، ولا سيما إذا كانت أساليب أكثر تحديداً لا تكون متاحة أو فعالة من حيث التكلفة. في الواقع، تصور أن إحدى مزارع الحمضيات واحدة أو الباحث يمكن بسرعة وبتكاليف زهيدة الاعتداء عدة مئات العينات في غضون بضعة أيام، باستخدام الممصات متعددة جنبا إلى جنب مع عدة لوحات 96-جيدا، ودون شراء ثيرموسيكلير قبكر RT مكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تشن هوان وإيان آرثر بالمر، وتشن جيان، تشانغ مينغ، ستيفن ل. تومسون، ليو فينجكوان وفو تشنغ تشينغ تعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وضع إطار مفاهيمي وم. ز. س. ف.؛ التحقيق وجيم حاء ج. ج. ز. س. و. الموارد، ف. س. ز.؛ كتابة-المشروع الأصلي، أولاً ألف ص؛ كتابة – المراجعة والتحرير، ص أولاً ألف وجيم ياء وجيم حاء، س. ل. ت. وز. س. ف.؛ التصور، وجيم حاء؛ الإشراف، ف. س. ز.؛ الحصول على التمويل، و س. ز. و. ل. س. ف.

مشروع يدعمه "ولاية كارولينا الجنوبية تحسين المعلم جودة التعليم العالي الدولة منحة" بعنوان وعمليات المعارف النباتية تعزيز الأوسط درجات العلوم للمعلمين، والهياكل والمهام من خلال المشاركة في "بحوث علوم النبات" (نبات العلوم)

الأموال التي تمنحها "المتحدة الولايات إدارة التعليم" (رقم كفدا 84.367B)

الكتاب أود أن أشكر الدكتور وانغ نيان من جامعة فلوريدا لتقديم عينات الحمض النووي الجينومي من إصابة فالنسيا سينينسيس الحمضيات .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120 Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen Air Products N/A
Mastercycler pro with control panel Eppendorf 6321000019
1250 W Microwave Panasonic N/A
5424 table top centrifuge Eppendorf 05-403-93
Isotemp 215 digital water bath Fisher scientific 15-462-15Q
Metal spatula Sigma-Aldrich Z283274
Mortar and pestle Sigma-Aldrich Z247464
LSE Vortex Mixer Corning 6775
2-propanol Sigma-Aldrich I9516
Sterile 10 μL tips TipOne 1161-3730
Sterile 200 μL tips TipOne 1163-1730
Sterile 1250 μL tips TipOne 1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit VWR 75788-460
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510
Agarose IBI Scientific IB70041
EDTA Thermo Fisher Scientific 17892
Acetic acid Fisher Chemical A38-212
Tris base Sigma-Aldrich 10708976001
μcuvette Eppendorf 6138000018
Stackable casting tray and combs Carolina 213655
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Mini-Sub Cell GT System Bio-Rad 1704487EDU
Biospectrometer basic Eppendorf 6135000009
0.2 mL PCR tubes Fisher scientific AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3439
2X Taq Green PCR Master Mix Promega M7122
Forward Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Reverse Primer Thermo Fisher Scientific N/A
Water, PCR grade Sigma-Aldrich 3315953001
Gel Doc XR+ Bio-Rad 1708195
1 KB+ DNA ladder Thermo Fisher Scientific 10787018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
  2. Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. EDIS (FE983) (2015).
  3. Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. University of Florida. (2012).
  4. UICEP. Pathology. (2013).
  5. Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44, (3), 379-386 (1994).
  6. Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26, (5), 194-197 (2012).
  7. Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92, (11), 1547-1550 (2008).
  8. Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). (2015).
  9. Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13, (5), 373-379 (1999).
  10. Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7, (2), e31263 (2012).
  11. Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66, (1), 104-115 (2006).
محددة و "دقيقة كشف" spp. "الحمضيات تخضير الممرض" <em>ليبيريباكتير Candidatus</em> استخدام PCR التقليدية على "عينات الأنسجة أوراق الحمضيات"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).More

Chen, H., Palmer, I. A., Chen, J., Chang, M., Thompson, S. L., Liu, F., Fu, Z. Q. Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples. J. Vis. Exp. (136), e57240, doi:10.3791/57240 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter