Summary
Citrus "vergroening" is een bijzonder destructieve ziekte die citrusvruchten wereldwijd. Hier gepresenteerd is een eenvoudige methode om met behulp van PCR en genomic DNA-extractie van citrus blad weefsel voor de nauwkeurige en precieze identificatie van het pathogeen citrus vergroening, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, is een destructieve citrus ziekte teistert citrus bedrijven wereldwijd. Deze ziekte veroorzaakt asymmetrische geel blad patroon, ader vergeling, naald-of bladverlies, root verval en uiteindelijk de dood van de citrus plant. Wanneer septisch, de citrus planten groei hebben onvolgroeide en produceren bloemen buiten het seizoen. Deze bloemen opbrengst zelden fruit, en die kleine, bittere, onregelmatig gevormde citrusvruchten die opbrengst zijn niet wenselijk. Deze ziekte wordt verspreid door de Aziatische citrus psyllid, Diaphorina citri, en door het enten van geïnfecteerde citrus weefsel. Het pathogene agens heeft een lange en variabele incubatietijd binnen de citrus plant — soms jaren voordat de symptomen verschijnen. Pogingen om deze pathogenen in vitro cultuur zijn mislukt, mogelijk vanwege de lage en ongelijke concentratie van het pathogene agens binnen citrus weefsel besmet, of omdat het moeilijk is om te repliceren de milieu dat bevorderlijk is voor groei van voorwaarden het pathogene agens oplevert. Het is erg moeilijk om de ziekte identificeren voordat het heeft verspreid, als gevolg van de lange incubatietijd en onderzoekers onvermogen om de cultuur van het pathogene agens oplevert. Dientengevolge, blijkt de ziekte alleen na plotseling citrus akkerbouwer de gehele oogst te vernietigen. Hier gepresenteerd is een methode voor de detectie van het nauwkeurig en specifiek voor de citrus vergroening pathogen, Candidatus liberibacter spp. met behulp van een genomic DNA-extractie kit en PCR. Deze methode is eenvoudig, efficiënt, kosteneffectief en aanpasbaar voor kwantitatieve analyse. Deze methode kan worden aangepast voor gebruik op elke citrus weefsel; het is echter mogelijk beperkt door de hoeveelheid pathogen in het weefsel aanwezig. Echter zal deze methode toelaten citrus boeren eerder identificeren van besmette citrus planten, en beteugelen van de verspreiding van deze destructieve ziekte voordat het verder kan verspreiden.
Introduction
Citrus "greening", ook bekend als huanglongbing, heeft geleid tot een aanzienlijk verlies van citrusbomen. Één vertegenwoordiger geval is Florida, waar de ziekte is voorspelde een 70% daling in de productie van Florida oranje dozen van 244 miljoen dozen in het seizoen 1997-1998 te bezorgen 70 miljoen dozen vanaf het seizoen 2016-20171. Meer dan 90% van citrusbomen in Florida zijn geïnfecteerde2, en geschat wordt dat de Florida citrus industrie ongeveer een miljard dollar per jaar als gevolg van citrus ziekten verliest, waarin citrus "vergroening" een belangrijke rol-3 speelt. Citrus groener wordt verspreid voornamelijk door de invasieve Aziatische citrus psyllid Diaphorina citri, maar kan ook worden verspreid door enting van geïnfecteerd weefsel. De ziekte veroorzaakt geelverkleuring van de aderen, asymmetrische geel blad patroon, voortijdig naald-of bladverlies, takje zullen verdwijnen, root verval en dood van de plant. Belangrijk is dat veroorzaakt de ziekte de citrus plant produceren bloemen buiten het seizoen, die zelden fruit produceren. Het fruit dat wordt geproduceerd door geïnfecteerde citrus planten zijn onvolwassen, groen en bittere proeven4.
Het doel van deze methode is om nauwkeurig en precies identificeren de motile bacterie Candidatus liberibacter spp., de verwekker van citrus vergroening, wonen in het floëem van besmette citrusbomen5. Genomic DNA wordt geëxtraheerd uit het hele blad weefsel, waarin de levende bacteriën. Deze uitgepakte genomic DNA wordt gebruikt als een sjabloon voor conventionele PCR, waar oligonucleotides aanvulling op van de bacterie 16S rDNA volgorde worden gebruikt om te versterken deze volgorde. Oligonucleotides complementair aan een citrus FBOX -gen worden gebruikt als een versterking van de interne controle. We kozen voor deze methode, omdat het heeft bewezen succesvol te zijn in vorige onderzoek6.
Deze methode heeft het duidelijk voordeel dat ze kunnen worden uitgevoerd in een normaal uitgeruste biochemie-lab, eenvoudig en relatief goedkoop. Daarnaast blijft de PCR de nauwkeurigste en meest nauwkeurige methode voor het opsporen van deze pathogenen, als gevolg van de moeilijkheid van het kweken van deze ziekteverwekker7, en het pathogene agens van vermogen om te overleven en te reproduceren voor jaren binnen een asymptomatische host8. Veel verschillende specialiteit PCR testen zijn gebruikt om met succes het detecteren van deze pathogene agens oplevert; conventionele PCR blijft echter de eenvoudigste bepaling voor de accurate en specifieke detectie, vooral binnen de asymptomatische hosts8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isoleer Genomic DNA uit weefsel van de Plant met behulp van een Genomic extractie Kit
- Citrus blad weefsel verkrijgen door te snijden een hele vers blad van een citrus boom met behulp van schone schaar, en plaats het blad in een schone plastic sandwich zak.
Opmerking: De zak met het weefsel blad moet worden geplaatst in een koelkast 4 ° C of op ijs in een geïsoleerde container zo spoedig mogelijk na het verzamelen te voorkomen van bederf. - Voeg een kleine hoeveelheid vloeibare stikstof om te relaxen een mortier en een stamper. Terwijl ze zijn koelen, gebruik schaar te knippen uit een klein stukje blad weefsel, ongeveer 1 vierkante inch in grootte. Plaats het gesneden weefsel in de mortel direct om het te bevriezen. Voeg meer vloeibare stikstof, indien nodig.
Opmerking: Geïsoleerde handschoenen moeten altijd gedragen worden tijdens het verwerken van vloeibare stikstof. - Snel de plant weefsel vermalen tot een fijn poeder met behulp van de mortel. Blijven slijpen totdat de vloeibare stikstof volledig verdampt, en een fijn groene poeder blijft.
- Kort een metalen spatel in vloeibare stikstof voor 10-15 s chill en schep de grond weefsel binnen de mortel in een 1,5 mL microcentrifuge buis, met behulp van de spatel.
- Voeg 600 µL van kernen Lysis van de oplossing (Zie Tabel van materialen) met behulp van een 1000 µL Pipetteer en vortex het monster voor 1-3 s, vervolgens broeden in een waterbad van 65 ° C gedurende 15 minuten.
- 3 µL van RNase oplossing aan de lysate met behulp van een pipet 10µL toevoegen, omkeren van de buis 2 - 5 keer te mengen, Incubeer bij 37 ° C in een kabinet incubator voor 15 min.
Opmerking: Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verdergaat. - 200 µL van eiwit neerslag oplossing, vortex op hoge snelheid voor 20 s en centrifuge voor 3 min op 13.000 x g vormen een stevige pellet toevoegen. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, 600 µL van kamertemperatuur isopropanol aan een verse 1,5 mL microcentrifuge buis toevoegen.
- Met behulp van een pipet 1000 µL, verwijder voorzichtig de bovendrijvende vloeistof uit het gecentrifugeerde monster, over te dragen aan de microcentrifuge-tube van verse 1,5 mL met isopropanol. De pellet kan nu worden verwijderd.
Opmerking: Vermijd verontreiniging van het supernatans dat met eiwit door het verlaten van een minuscule hoeveelheid supernatant boven de pellet. - Omkeren van de buis, tot het DNA zichtbaar als een massa van de draad-achtige strengen wordt en centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren, 600 µL van 70% ethanol toevoegen aan de pellet, omkeren van de buis meerdere malen te wassen van het DNA, en centrifugeer bij 13.000 x g voor 1 min.
- Zorgvuldig gecombineerd de ethanol, waardoor de losse DNA pellet, open en omkeren van de buis, rustend op absorberend papier. Lucht droog bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg 100 µL van DNA rehydratie oplossing aan de gedroogde DNA pellet en Incubeer het DNA in een waterbad van 65 ° C gedurende 1 uur, tijdens het mixen periodiek door te tikken op de buis.
- Plaats 1 µL van het gezuiverde water op een microcuvette, en plaatst u deze in een spectrofotometer moet worden gebruikt als een leeg. Bereken de concentratie van DNA aanwezig door 1 µL van het monster op de microcuvette te plaatsen en invoegen in de spectrofotometer. DNA-concentratie (ng/µL) kan worden berekend als (een260- een320) × verdunning factor × 50 ng/µL.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster kan worden achtergelaten bij 4 ° C.
2. uitvoeren van PCR op Genomic DNA-monsters
- Combineren van 10 µL 2 x PCR Master Mix (Zie tabel van materialen), 1 µL voorste primer (10 pM/µL), 1 µL reverse primer (10 pM/µL) (Zie tabel 2 voor primer sequenties), 100 ng van genomic DNA uit het monster geëxtraheerd en gezuiverd water (maximaal 20 µL eindvolume) een 50 µL PCR buis, flick te mengen, en kort centrifuge.
- De PCR-buis invoegen de thermocycler en dienovereenkomstig worden uitgevoerd (Zie tabel 1).
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Indien nodig slaan monster bij 4 ° C, nadat de reactie voltooid is.
3. het versterkte DNA in een Agarose Gel electrophorese
- Weeg 0.4 g agarose poeder en samen met 1 x TAE buffer toevoegen aan een schoon 200 mL conische kolf, vullen van maximaal 50 mL.
- Magnetron op hoog voor 1.5 min, schudden elke 30 s, tot agarose is volledig opgelost.
Opmerking: Geïsoleerde handschoenen moeten gedragen worden tijdens het verwerken van vloeibare agarose Voorkom brandwonden. - 2.5 µL van 10 mg/mL ethidiumbromide toevoegen aan de vloeibare agarose hermetisch en schud om te mixen, dan giet het vloeibare agarose gel in een mal niveau gel. Snel invoegen standaard 12-tooth gel kammen na het gieten.
- Laat de gel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur afkoelen, dan verwijderen van de gel kammen, en plaats de gel in een niveau gel doos gevuld met 1 x TAE buffer.
- Met behulp van een micropipet, laad het totale versterkte DNA-monsters in putten. Voeg toe 5 µL van DNA ladder (Zie Tabel van materialen) in een aparte put uit uw monsters.
- Electrophorese de monsters gedurende 35 min. bij een constant 90 V, dan verwijderen van de gel en plaats in een UV-transilluminator.
- Fotograferen en analyseren van de gel "banding" patroon tijdens het gebruik van UV transillumination op 302 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een positief resultaat levert een duidelijke band overeenkomt met 500 bp voor Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, en/of een duidelijke band overeenkomt met 700 bp voor Laa2/Laj5, een insert in de 16S ribosomal β operon9. De versterking van de interne controle band moet ook worden opgegeven bij 400 bp. Deze band komt overeen met de versterking van de citrus FBOX gene10, en moet worden weergegeven voor een resultaat om als geldig beschouwd (Figuur 1 en Figuur 2). Gebrek aan beide 500 bp en 700 bp bands terwijl een 400 bp band aanwezig is vertegenwoordigt een negatief resultaat. Uitvoeren van PCR op gezonde monsters kan opleveren sommige aspecifieke banding patronen rond 700 bp en 400 bp; slechts een enkele vette band overeenkomt met deze molecuulgewichten blijkt evenwel een positief resultaat (Figuur 1).
| Operatie | Temp. | Tijd | Cycli |
| Eerste denaturatie | 95 ° C | 3 - 5 min | 1 |
| Denaturatie | 95 ° C | 30 sec | 35 |
| Gloeien | 55 ° C | 30 sec | |
| Rek | 72 ° C | 40 sec | |
| Definitieve rek | 72 ° C | 10 min | 1 |
Tabel 1. Thermocycler instellingen gebruikt om te vergroten doelgenen 16S rDNA en citrus FBOX.
| Naam van Primer | Volgorde | Referentie | |
| LAA2_F | 5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3' | Hocquellet, et al.., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3' | Hocquellet, et al.., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG GAA ACT CTT TCG CCA CT-3' | Deze test | |
| FBOX_R | 5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG ACT G-3' | Deze test | |
| LSS_F | 5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3' | Fujikawa, et al.., 2012 | |
| LSS_R | 5'-ACC CAA KAT CTA GGT AAA AAC C-3' | Fujikawa, et al.., 2012 | |
Tabel 2. Naam van inleidingen, hun opeenvolging van DNA, en de referentie.
Figuur 1. Analyse van conventionele PCR voortvloeit uit vier weefselmonsters van besmette citrus blad en twee Heide monsters als negatieve controles gebruikt. 'gDNA' geeft een genomic DNA monster geëxtraheerd uit citrus blad weefsel. Monsters gDNA 1 en gDNA 4 zijn van niet-geïnfecteerde citrus blad monsters; gDNA 2, 3, 5 en 6 zijn Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) besmet monsters. DNA werd uitgepakt zoals geschreven staat in het protocol. PCR werd uitgevoerd met behulp van het uitgepakte genomic DNA als een sjabloon, per het protocol (Zie tabel 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, en FBOX verwijzen naar de primer ingesteld dat wordt gebruikt (Zie tabel 2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Volledige gel foto van drie monsters van de versterkte gDNA. Voorbeeld 1 is gezond citrus weefsel; monsters 2 en 3 zijn Clas geïnfecteerd weefselmonsters. Deze voorbeelden komen overeen met de gDNA 1, 2 en 3, zoals te zien in Figuur 1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het is van cruciaal belang dat alle maatregelen worden gevolgd als u precies wilt bereiken van optimale proefomstandigheden. Hele blad weefsel werd gebruikt tijdens deze demonstratie; het protocol kan echter worden gewijzigd theoretisch tot elk soort weefsel van de plant. Eerder, hebben de onderzoekers genomic DNA geëxtraheerd uit blad ader weefsel, in plaats van hele blad weefsel, en bereikt soortgelijke resultaten11. Indien de band die overeenkomt met de citrus FBOX -gen niet verschijnt, het resultaat is ongeldig, en kunnen er een of meer van de verschillende technische fouten in de werkwijze. Veelvoorkomende fouten omvatten: met behulp van besmette of onjuist gesteriliseerd water, micropipet tips, of microcentrifuge buizen; niet toevoegen van een of meer componenten die nodig zijn in de PCR-mix of tijdens genomic DNA-extractie; niet handhaven van de juiste thermocycler voorwaarden; met behulp van reagentia of andere ingrediënten die voorbij hun vervaldatum; niet toevoegen van ethidium vlek bromide (en) of een andere DNA aan de agarose gel; electrophoresing van de versterkte DNA met een spanning van te hoog of te lang; en met behulp van oude of onjuist gemengde TAE-buffer, of gewoon met behulp van water in plaats van TAE-buffer te vullen van het gel-vak.
Inleidingen LAA2_F en LAJ5_R werden gekozen uit het vorige onderzoek als gevolg van hun succes op het identificeren van Candidatus Liberibacter asiaticum en africanum. Deze inleidingen versterken subunit ribosomal genen rplA en rplJ, een versterkte 669 bp fragment opbrengst van ca. l. africanum of een 703 bp fragment uit C. l. asiaticum9. Inleidingen, LSS_F en LSS_R werden gekozen voor deze assay uit eerder onderzoek als gevolg van hun gevestigde lage vals negatieve snelheid, nauwkeurigheid en specificiteit voor C. l. asiaticum. De LSS primer set versterkt een 500 bp reeks in alle drie 16S rDNA genen aanwezig in C. l. asiaticum6. De inleidingen FBOX werden geconstrueerd voor gebruik als een versterking van de interne controle en versterken van een 400 bp reeks gevonden in citrus planten. Vorige onderzoek toont aan dat FBOX stabiel wordt uitgedrukt in citrus planten, en zou een grote kandidaat voor gebruik als een referentie-gen bij de aanpassing van deze assay voor RT-qPCR10.
Deze bepaling kan worden aangepast om te worden gebruikt voor elk type van citrus weefsel, en kan worden aangepast voor gebruik met extra PCR-gebaseerde testen, zoals RT-qPCR. De beperkingen van deze test zijn weinig, en de meeste zijn inherent aan conventionele PCR. Deze factoren beperken omvatten: de aanwezigheid van ethanol of andere remmende chemische stoffen in het mengsel van PCR, het gebrek aan kwantificatie zonder het uitvoeren van een meer geavanceerde test, de behoefte aan een thermocycler in kleinere labs, en de aanwezigheid van DNA besmetting.
Terwijl de specificiteit van deze test niet rechtstreeks met de meer specifieke RT-qPCR methoden vergeleken is, deze test is nuttig voor wetenschappers verrichten onderzoek op liberibacter Candidatus , en boeren willen diagnostiseren potentieel besmet citrus bomen in hun velden, vooral als meer specifieke methoden niet beschikbaar of rendabel zijn. Inderdaad, is het denkbaar dat een enkele citrus kweker of onderzoeker kan snel en goedkoop assay verscheidene honderden monsters in een paar dagen, met behulp van meerkanaals pipetten gecombineerd met verschillende 96-wells-platen, zonder de aanschaf van een dure thermocycler RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Huan Chen, Ian Arthur Palmer Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu en Zheng Qing-Fu verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Conceptualisering, H.C. en Z. v. F.; Onderzoek, H. C., J. C en Z. Q. F; Middelen, Z. v. F.; Schrijven - originele ontwerp, I. A. P.; Schrijven – Review & bewerken, I. A. P., J. C. H. C., S. L. T. en Z. v. F.; Visualisatie, H. C.; Toezicht, Z. v. F.; Financiering van de overname, Z. Q. F en F. v. L.
Project ondersteund door een South Carolina verbetering leraar kwaliteit hogeronderwijs staat subsidie getiteld verbetering van middelste rangen Science Teachers kennis van de processen van de Plant, structuren en functies door middel van betrokkenheid in wetenschappen plantenonderzoek (Plant Science)
Fondsen die zijn toegekend door de Verenigde Staten ministerie van onderwijs (CFDA nummer 84.367B)
De auteurs bedank Dr. Nian Wang van de Universiteit van Florida voor het verstrekken van genomic DNA-monsters besmet uit Citrus sinensis Valencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
- UICEP. Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
