Summary
감귤 류 녹화는 세계적으로 감귤 류 작물에 영향을 미치는 특히 파괴적인 질병 이다. 여기에 제시 된 간단한 방법을 사용 하는 PCR 및 감귤 잎 조직이의 게놈 DNA 추출 감귤 류 녹화 병원 체, Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 정확한 식별에 대 한
Abstract
감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 세계적으로 감귤 류 농장을 ravaging 파괴적인 감귤 류의 질병 이다. 이 질병 원인과 비대칭 노란 잎 mottling, 정 맥 yellowing, defoliation, 루트 부패, 궁극적으로, 감귤 류 식물의 죽음. 감염, 감귤 류 식물 성장 저하는 고 시즌에서 꽃을 생산. 이 꽃 거의 항복 과일, 그리고 그 작은, 쓴, 불규칙 모양의 감귤 항복 할 바람직하지 않다. 이 질병은 감염 된 감귤 직물의 접목 하 여 아시아 감귤 류 psyllid, Diaphorina citri에 의해 확산. 병원 체는 감귤 류 식물 내에서 길고 가변 인큐베이션 기간-가끔 년 전에 증상이 나타납니다. 이 병원 균에서 체 외에서 배양 하려고 낮은으로 인해 성공 했습니다 하 고 내 병원 체의 고르지 못한 농도 감귤 류 조직, 감염 또는 환경 복제 하기 어렵기 때문에 조건의 성장에 도움이 병원 체입니다. 전에 그것은, 그것의 긴 잠복기와 병원 체 문화 연구원 못하는 질병을 식별 하기 위해 매우 어렵습니다. 그 결과, 질병만 된다 명백한 후 갑자기 감귤 류의 농부의 전체 수율을 파괴. 여기에 제시 된 감귤 류 녹화 병원 체, 게놈 DNA 추출 키트 및 PCR를 사용 하 여 Candidatus liberibacter 종의 정확 하 고 구체적인 검색 방법이입니다. 이 메서드는 간단 하 고, 효율적, 비용 효과, 고 정량 분석에 대 한 적응. 이 메서드는 모든 감귤 류의 조직;에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 잠재적으로 조직에 병원 체의 양에 의해 제한 됩니다. 그럼에도 불구 하 고,이 메서드 이전, 감염 된 감귤 류 식물을 식별 하는 감귤 류의 농민을 허용 하 고 더욱 확산 될 수 있습니다 전에이 파괴적인 질병의 확산을 억제.
Introduction
감귤 류 녹화, 일컬어 huanglongbing, 감귤 나무의 상당한 손실이 발생 했습니다. 한 대표적인 케이스는 플로리다, 질병을 70% 감소를 플로리다 오렌지 박스의 생산에 244 백만 상자에서 1997-1998 시즌에 2016-2017 시즌1월 70 백만 상자 전망 이다. 플로리다에서 감귤 나무의 90% 이상 감염된2, 고 플로리다 감귤 산업 손실 약 1 십억 달러 감귤 류 녹화3중요 한 역할 담당 하는 점에서 감귤 류의 질병으로 인해 매년 추정 된다. 감귤 류 녹화 침략 적 아시아 감귤 류 psyllid Diaphorina citri 에 의해 주로 전염 됩니다 그러나 또한 감염 된 조직. 의 접목 하 여 확산 될 수 있습니다. 질병 정 맥, 비대칭 노란 잎 mottling, 조 defoliation, 나뭇가지 dieback, 루트 부패 및 식물의 죽음의 황 변 발생 합니다. 중요 한 것은, 질병 거의 과일을 생산 하는 시즌에서 꽃을 생산 하는 감귤 류 식물을 발생 합니다. 감염 된 감귤 류 식물에 의해 생산 되는 과일은 미 숙, 녹색, 및 쓴 맛4.
이 방법의 목적은 정확 하 게 하는 것입니다 하 고 정확 하 게 운동 박테리아 Candidatus liberibacter 종, 감귤 류 녹화, 감염 된 감귤 나무5의 체 관 부 내 생활의 원인이 되는 에이전트를 식별 합니다. 게놈 DNA는 살아있는 박테리아를 포함 하는 전체 잎 조직에서 추출 됩니다. 이 추출 된 게놈 DNA oligonucleotides 세균의 16S rDNA 시퀀스에 보완를이 순서를 증폭 하는 데 사용 됩니다 기존의 PCR에 대 한 템플릿으로 사용 됩니다. 감귤 류의 FBOX 유전자 보완 oligonucleotides 내부 증폭 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 이전 연구6에서 성공 하려면 입증 되었습니다 때문에이 방법을 사용 하 여 선택 했습니다.
이 메서드는 간단 하 고, 상대적으로 저렴 한, 어떤 일반적으로 갖춘된 생화학 실험실에서 수행할 수 있는 명확한 이점이 있다. 또한, PCR이 병원 체7, 그리고 생존과 이내 asymptomatic 호스트8년 재현 병원 체의 능력 배양의 어려움으로 인해이 병원 체를 탐지 하기 위한 가장 정확 하 고 정확한 방법에 남아 있다. 많은 다른 전문 PCR 분석 실험 성공적으로;이 병원 체를 검출 하는 데 사용 되었습니다. 그러나, 기존의 PCR 무 증상 호스트8내 특히 정확 하 고 특정 검색에 대 한 간단한 분석 결과 남아 있습니다.
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Protocol
1. 격리 Genomic DNA 게놈 추출 키트를 사용 하 여 식물 조직에서
- 감귤 류의 잎 조직이 절단 전체 신선한 깨끗 한가 위를 사용 하 여 감귤 나무에서 잎 그리고 깨끗 한 플라스틱 샌드위치 봉지에 잎을 배치 하 여 얻을.
참고: 잎 조직이 포함 된 가방 두어야 한다 또는 절연된 용기에 얼음에 4 ° C 냉장고에 변질을 피하기 위해 컬렉션 후 가능한 한 빨리. - 박격포와 유 봉 진정 액체 질소의 작은 금액을 추가 합니다. 그들은 재미는 하는 동안 잎 조직, 약 1 평방 인치 크기에서의 작은 조각을 잘라가 위를 사용 합니다. 장소는 박격포에서 컷된 조직 즉시 동결. 필요한 경우 더 많은 액체 질소를 추가 합니다.
참고: 절연된 장갑 항상 액체 질소를 처리 하는 동안 착용 한다. - 신속 하 게 박격포를 사용 하 여 정밀한 분말으로 식물 조직을 갈아. 액체 질소가 완전히 증발 하 고 좋은 녹색 분말 남아 때까지 연 삭 계속.
- 짧게 진정에 대 한 10-15, 액체 질소에 금속 주걱 다음 주걱을 사용 하 여 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 박격포 내부 지상 조직 특 종.
- 핵 세포 솔루션의 600 µ L 추가 (참조 테이블의 재료)를 사용 하 여 1000 µ L 플라스틱 및 소용돌이 1-3 s에 대 한 샘플 다음 15 분 동안 65 ° C 물 욕조에 품 어.
- 그것을 혼합 하 여 15 분 동안 캐비닛 인큐베이터에서 37 ° C에서 품 어 튜브 2-5 번 반전, lysate 10µL 피 펫 사용을 RNase 솔루션의 3 µ L를 추가 합니다.
참고: 계속 하기 전에 실내 온도에 냉각 하는 혼합물을 허용 한다. - 회사 펠 릿 형태로 13000 x g에 단백질 강 수 솔루션, 고속 20 s, 다음 3 분 동안 원심 분리기에서 소용돌이의 200 µ L를 추가 합니다. 샘플은 centrifuged 되 고, 하는 동안 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 실 온 소 프로 파 놀의 600 µ L를 추가 합니다.
- 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여, 조심 스럽게 소 프로 파 놀을 포함 하는 신선한 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하는 centrifuged 샘플에서는 상쾌한 제거. 펠 릿 지금 삭제 수 있습니다.
참고: 펠 릿 위에 상쾌한의 조금만 금액을 남겨 두어서 단백질으로 상쾌한을 오염 하지 마십시오. - DNA 가닥 스레드-처럼의 질량으로 표시 될 때까지 튜브를 반전 한 다음 실 온에서 1 분 13000 x g에서 원심.
- 상쾌한 가만히 따르다, 펠 릿을 70% 에탄올의 600 µ L를 추가, 여러 번 세척 하는 DNA 고 1 분 13000 x g에서 원심 튜브를 반전.
- 조심 스럽게 발음 에탄올, 느슨한 DNA 펠 릿을 떠나 다음 열고 관, 흡수 성 종이 반전. 15 분 동안 실 온에서 건조 공기.
- 튜브를 활용 하 여 주기적으로 혼합 하는 동안 1 시간에 대 한 65 ° C 물 욕조에 DNA를 품 어 다음 말린된 DNA 펠 릿을 DNA Rehydration 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다.
- Microcuvette에 순화 된 물의 1 µ L을 놓고 빈으로 사용할 분 광 광도 계에 그것을 삽입 합니다. Microcuvette에 1 µ L의 샘플을 배치 하는 분 광 광도 계에 삽입 하 여 현재의 DNA의 농도 계산 합니다. DNA 농도 (ng / µ L) × (260-320)로 계산 된 희석 요소 × 50 ng / µ L를 될 수 있습니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 샘플 4 ° c.에 저장 될 수 있다
2. Genomic DNA 견본에 PCR을 수행 합니다.
- 결합 10 µ L 2 x PCR 마스터 믹스 ( 재료의 표참조), 1 µ L 앞으로 뇌관 (10 오후 / µ L), 1 µ L 반전 뇌관 (10 오후 / µ L) (뇌관 순서 표 2 참조), 100 게놈 DNA의 ng는 샘플에서 추출 하 고 물 (최대 20 µ L 최종 볼륨)에서 정화 한 50 µ L PCR 튜브, 혼합, 영화와 짧게 원심 분리기.
- thermocycler에 PCR 튜브를 삽입 하 고 적절 하 게 실행 ( 표 1참조).
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. 필요한 경우, 반응이 완료 된 후 4 ° C에서 예제를 저장 합니다.
3. electrophorese는 Agarose 젤에 증폭 된 DNA
- 그리고 무게 0.4 g agarose 분말 1 x TAE 버퍼 함께 깨끗 한 200 mL 삼각 플라스 크, 최대 50 mL 작성에 추가할.
- 모든 30 떨고 1.5 분 높은 전자 렌지 s, agarose는 완전히 녹아 때까지.
참고: 절연된 장갑 화상을 방지 하기 위해 액체 agarose를 처리 하는 동안 착용 한다. - 레벨 젤 금형에 액체 agarose 젤을 부 어 다음 액체 agarose를 흔들어 혼합, 10 mg/mL ethidium 평범한 사람의 2.5 µ L를 추가 합니다. 신속 하 게 붓는 후 표준 12-치아 젤 빗을 삽입 합니다.
- 실 온에서 20 분을 기다린 다음 제거 젤 빗, 젤 허용 고 젤 수준 젤 상자 1 x TAE 버퍼 가득 합니다.
- 웰 스에 총 증폭된 DNA 샘플을 로드 하는 micropipette를 사용 하 여. DNA의 5 µ L 사다리 ( 재료의 표참조)을 샘플에서 별도 잘에서 추가 합니다.
- 35 분 90, 상수에 대 한 샘플을 electrophorese 다음 젤을 제거 하 고 UV transilluminator에.
- 사진 하 고 302에서 UV transillumination를 사용 하는 동안 패턴 밴딩 젤 분석 nm.
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Representative Results
긍정적인 결과 수익률 500 해당 고유 밴드 Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, 및/또는 독특한 밴드 700 해당 bp bp Laa2/Laj5, 16S ribosomal β에 삽입에 대 한 오 페론9. 내부 증폭 제어 밴드 또한 400에 표시 되어야 합니다 혈압. 이 밴드는 감귤 류의 FBOX 유전자10, 증폭에 해당 하며 유효 하기 결과 대 한 표시 되어야 합니다 (그림 1 및 그림 2). 두 500의 부족 혈압과 700 bp 밴드는 400 bp 밴드는 존재 하는 동안 부정적인 결과 나타냅니다. 몇 가지 일반적인 밴딩 패턴 약 700 얻을 수 있습니다 건강 한 샘플에 PCR을 수행 혈압과 400 혈압; 그러나, 이러한 분자 무게에 해당 단일 굵은 밴드만 긍정적인 결과 (그림 1)을 나타냅니다.
| 작업 | 임시입니다. | 시간 | 사이클 |
| 초기 변성 | 95 ° C | 3-5 분 | 1 |
| 변성 | 95 ° C | 30 초 | 35 |
| 어 닐 링 | 55 ° C | 30 초 | |
| 신장 | 72 ° C | 40 초 | |
| 최종 신장 | 72 ° C | 10 분 | 1 |
표 1입니다. Thermocycler 설정 대상 16S rDNA 유전자와 감귤 FBOX 증폭 하는 데 사용.
| 뇌관의 이름 | 시퀀스 | 참조 | |
| LAA2_F | 5'-문신 AAA GGT TGA CCT TTC 개 그 TTT-3' | Hocquellet, 외 알., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA GCA GAA ATA GCA CGA ACA A-3' | Hocquellet, 외 알., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG GAA 법 CTT TCG CCA CT-3' | 이 분석 결과 | |
| FBOX_R | 5'-AGC AGA CCT GGC 문신 문신 ACG 법 G-3' | 이 분석 결과 | |
| LSS_F | 5'-GGA 개 그 GTG AGT GGA ATT CCG A-3' | 후지카와, 외 알., 2012 | |
| LSS_R | 5'-ACC CAA 고양이 CTA GGT AAA AAC C-3' | 후지카와, 외 알., 2012 | |
표 2입니다. 뇌관, DNA 순서, 및 참조의 이름을.
그림 1입니다. 4 감염 된 감귤 잎 조직 샘플 및 부정적인 컨트롤로 사용 하는 두 개의 heathy 샘플에서 기존의 PCR의 분석 결과. 'gDNA' 감귤 잎 조직에서 추출 하는 genomic DNA 샘플을 나타냅니다. GDNA 1 및 gDNA를 샘플링 4는에서 감염 되지 않은 감귤 잎 샘플; 2, 3, 5, 및 6 gDNA Candidatus liberibacter asiaticum (Cla) 감염 샘플이 있습니다. 프로토콜에서 작성 된 DNA 추출 했다. PCR은 프로토콜 (참조 표 1) 당 서식 파일로 추출한 게놈 DNA를 사용 하 여 수행 되었다. LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, 및 FBOX 뇌관 세트 사용 ( 표 2참조)를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 3 개의 증폭된 gDNA 샘플의 완전 한 젤 사진. 예제 1은 건강 한 감귤 류의 조직; 예제 2 및 3 클 라스 감염 조직 샘플이 있습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이이 샘플 gDNA 1, 2, 및 3에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그것은 중요 한 최적의 실험 조건 달성 하기 위해 정확 하 게 모든 단계는 따 랐 다입니다. 전체 잎 조직;이 데모 중에 사용 된 그러나, 이론적으로 식물 조직의 모든 종류를 포함 하는 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 이전, 연구 전체 잎 조직, 보다는 오히려 잎 정 맥 조직이, genomic DNA를 추출 있고 비슷한 결과11를 달성. 감귤 류의 FBOX 유전자에 해당 하는 밴드를 하지 못하면 표시 결과 유효 하지 않습니다, 그리고 하나 이상의 절차에 몇 가지 기술적 오류가 있을 수 있습니다. 일반적인 오류 포함: 오염 또는 부적절 하 게 멸 균 물, micropipette 팁, 또는 microcentrifuge 튜브;를 사용 하 여 게놈 DNA 추출; 하는 동안 또는 PCR 혼합에 필요한 하나 이상의 구성 요소를 추가 하는 실패 적절 한 thermocycler 조건; 유지 하기 실패 시 약 또는 그들의 만료 날짜; 다른 재료를 사용 하 여 브로민 추가 실패 브롬 또는 다른 DNA 얼룩 agarose 젤; electrophoresing 증폭 된 DNA는 너무 높은 전압에서 또는 너무 오랫동안; 오래 된 또는 잘못 혼합 태 버퍼를 사용 하 여 또는 단순히 물을 사용 하 여 태 버퍼 대신 젤 상자를 채우기 위해.
프라이 머 LAA2_F 및 LAJ5_R Candidatus Liberibacter asiaticum와 africanum에서 그들의 성공으로 인해 이전 연구에서 선정 됐다. 이 뇌관 증폭 ribosomal 소 단위 유전자 rplA rplJ, c. 에서 증폭된 669 bp 조각 저조한 l. africanum 또는 c. 에서 703 bp 조각 l. asiaticum9. 프라이 머 LSS_F와 LSS_R c. 에 대 한 그들의 설립된 낮은 허위 부정적인 속도, 정확도, 및 특이성 이전 연구에서이 분석 결과 대 한 선정 됐다 l. asiaticum입니다. 모든 3에 16S rDNA 유전자 c. 에 있는 500 bp 순서를 증폭 하는 LSS 뇌관 세트 l. asiaticum6. FBOX 뇌관 내부 증폭 제어로 사용을 위해 건설 하 고 감귤 류 식물에서 발견 400 bp 시퀀스를 증폭. 이전 연구 FBOX 감귤 류 식물에서 안정적으로 표현 때 적응이 분석 결과 실시간 정량10참조 유전자로 사용 하기 위해 좋은 후보를 만들 것입니다 보여줍니다.
이 분석 결과 적응 감귤 직물의 모든 종류에 사용할 수 있으며 실시간 정량 등 추가 PCR 기반 분석 함께 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 이 분석 결과의 한계는 몇 가지, 그리고 대부분은 기존의 PCR에 내재. 이러한 제한 요소 포함: 에탄올 또는 PCR 혼합에 다른 금지 화학 물질, 분석 결과 더 많은 고급, 더 작은 실험실에서 thermocycler DNA 오염 물질의 존재에 대 한 필요 하지 않고 정량의 부족의 존재.
이 시험의 특이성 하지 직접 자세한 실시간 정량 Pcr 방법에 비해 되어, 하는 동안이 분석 결과 Candidatus liberibacter에 연구를 수행 하는 과학자에 대 한 유용 하 고 잠재적으로 진단 하고자 하는 농민 감염 감귤 류 좀 더 구체적인 메서드는 사용할 수 또는 비용 효율적인 경우에 특히 그들의 분야에 있는 나무. 사실, 그것은 그 단일 감귤 류 재배 또는 연구원 수 신속 하 고 저렴 하 게 시험 몇 백 샘플 몇 일에 비싼 실시간 정량 thermocycler를 구입 하지 않고도 여러 96 잘 접시와 함께 하는 멀티 채널 펫을 사용 하 여 생각할 수 있는.
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Disclosures
Huan 첸,이 안 아서 팔 머, Jian 첸, 명 장, 스티븐 L. 톰슨, Fengquan Liu와 청 청 푸 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
H.C. 개념과 Z. Q. F.; 조사, H. C., 제이 C, 그리고 Z. Q. F; 리소스, Z. Q. F.; 쓰기-원래 초안, I. A. P.; 쓰기-검토 및 편집, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. 그리고 Z. Q. F.; 시각화, H. C.; 감독, Z. Q. F.; 자금 수집, Z. Q. F와 F. Q. l.
사우스 캐롤라이나 개선 교사 품질 등 교육 상태 부여 라는 프로젝트, 강화 중간 학년 과학 교사 ' 지식 공장 과정, 구조 및 기능을 통해 참여 식물 과학 연구 (공장에서 과학)
미국 Sates의 교육부 (CFDA 번호 84.367B)에 의해 수 여 하는 자금
게놈 DNA 샘플 제공에 대 한 플로리다의 대학 박사 Nian 왕 감사 하 고 싶습니다 저자에서 감염 감귤 나무 발렌시아.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
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- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
- UICEP. Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
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- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
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