Summary
ירוק הדר היא מחלה הרסנית במיוחד להשפיע על גידולי הדרים באופן גלובלי. המוצג כאן שיטה פשוטה משתמש PCR, דנ א גנומי, הפקת רקמת העלה הדר לצורך זיהוי ומדויקים המחלה ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, היא מחלה הדר הרסני ravaging החוות הדרים באופן גלובלי. מחלה זו גורמת עלה הצהובים סימטרית mottling וריד הצהבה, defoliation, שורש דעיכה, בסופו של דבר, למותו של הצמח הדרים. כאשר נגוע, הצמחים הדר יש קצב גדילתם ומפיקים פרחים מחוץ לעונה. הפרחים האלה נדירות מניבים פרי, ואלו המניבים פירות הדר קטן, מריר, חריגה זה לא רצוי. מחלה זו היא התפשטה את psyllid הדר אסיאתי, Diaphorina קמחית, ועל ידי משתילים רקמת הדר נגועים. המחלה יש תקופת הדגירה ארוכה ומשתנה בתוך המפעל הדרים – לפעמים שנים, לפני הופעת התסמינים. ניסיונות תרבות פתוגן זה במבחנה כבר נכשל, ייתכן שעקב הנמוך ואת ריכוז לא אחידה של המחלה בתוך נגוע רקמות הדרים, או כי קשה לשכפל את הסביבה תנאים להצטיינות הצמיחה של הפתוגן. . זה קשה מאוד לזהות את המחלה לפני שהיא התפשטה, בשל תקופת הדגירה ארוכה שלו ואת היכולת של חוקרי תרבות את הפתוגן. כתוצאה מכך, המחלה רק הופכת נראית לעין לאחר השמדת לפתע התשואה כולה של חקלאי הדרים. המובאת כאן היא שיטת איתור מדויק וספציפי הפתוגן ירוק הדרים, Candidatus liberibacter spp. באמצעות ערכת חילוץ דנ א גנומי PCR. שיטה זו היא פשוט, יעיל, חסכוני, ו וישימה אנליזה כמותית. בשיטה זו ניתן להתאים לשימוש על כל רקמות הדרים; עם זאת, זה פוטנציאל מוגבל לפי הסכום של פתוגן נוכח הרקמה. ובכל זאת, שיטה זו לאפשר חקלאים הדר לזהות צמחים נגועים הדר קודם לכן, לבלום את התפשטות המחלה ההרסנית הזאת לפני זה יכול להתפשט עוד יותר.
Introduction
הדר ירוק, הידוע גם בשם huanglongbing, גרמה לאובדן משמעותי של עצי הדר. במקרה זה פלורידה, שבו המחלה היא תחזית כדי לגרום 70% לירידה בייצור של פלורידה כתום תיבות של 244 מיליון תיבות עונת 1997-1998 70 מיליון תיבות עד 2016-2017 עונה1 מעל 90% של עצי הדר בפלורידה הם נגועים2, ההערכה היא כי תעשיית הדר פלורידה מאבד כמיליארד דולר בשנה עקב מחלות הדרים, שבו הדר ירוק ממלא תפקיד מרכזי3. ירוק הדר מופצת בעיקר על ידי פולשני psyllid אסיה הדרים Diaphorina קמחית, אבל גם יכול להיות להתפשט על-ידי הארכת רקמות הנגוע. המחלה גורמת הצהבה של ורידים, עלה הצהובים סימטרית mottling, defoliation מוקדמת, dieback זרד, שורש, ומוות של הצמח. חשוב לציין, המחלה גורמת תחנת הדר כדי לייצר פרחים מחוץ לעונה, אשר לעתים נדירות מייצרים פירות. הפרי המיוצר על ידי צמחים נגועים הדר הן ילדותי, ירוק ומריר טעימות4.
מטרת שיטה זו היא מדויקת ואת לזהות במדויק את החיידק תאי Candidatus liberibacter spp., סוכן סיבתי של ירוק הדרים, שחיו במרחק שיפה של עצי הדר נגוע5. דנ א גנומי מופק מרקמות העלה כולו, אשר מכיל חיידקים חיים. את הדנ א הגנומי שחולצו משמש כתבנית עבור PCR קונבנציונאלי, איפה oligonucleotides משלימים לרצף rDNA מטוסי אף-16 של החיידק משמשים כדי להגביר את הרצף הזה. Oligonucleotides משלים FBOX גן הדרים משמשים פקד הגברה פנימית. בחרנו להשתמש בשיטה זו, כי הוכח כדי להיות מוצלחת מחקר קודמות6.
בשיטה זו יש יתרון ברור של להיות פשוטה, זולה יחסית, ומסוגל לבצע במעבדה ביוכימיה בדרך כלל מאובזר בכל. בנוסף, ה-PCR נשאר שיטת ומדויקים מדויק ביותר עבור זיהוי הפתוגן הזה, בשל הקושי culturing הזאת הפתוגן7, ואת היכולת של המחלה לשרוד להתרבות במשך שנים בתוך המארח אסימפטומטיים8. מבחני ה-PCR מיוחדים שונים רבים השתמשו בהצלחה לזהות את הפתוגן; עם זאת, PCR קונבנציונאלי נשאר וזמינותו הפשוטה ביותר לצורך זיהוי מדויק וספציפי, במיוחד בתוך מארחים ללא תסמינים8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לבודד דנ א גנומי מרקמות הצמח באמצעות ערכת חילוץ גנומית
- להשיג את רקמת העלה הדר על ידי חיתוך רענן כל העלים מעץ הדרים באמצעות מספריים נקי, ולמקם העלה לשקית פלסטיק נקי אוכל.
הערה: התיק המכיל את רקמת העלה יוצבו במקרר 4 ° C או על קרח במיכל מבודד בהקדם האפשרי לאחר אוסף כדי למנוע קלקול. - להוסיף כמות קטנה של חנקן נוזלי להרגע ומכתש. בעוד הם הם מצמרר, להשתמש במספריים לחתוך חתיכה קטנה של רקמת העלה, כ 1 אינץ ' רבוע בגודל. מקם את הרקמה לחתוך המליטה לעצור באופן מיידי את זה. להוסיף עוד חנקן נוזלי, במידת הצורך.
הערה: כפפות מבודדות צריך תמיד להיות משוחק תוך טיפול בחנקן נוזלי. - במהירות לטחון את רקמת הצמח לאבקה בסדר בעזרת המרגמה. המשך שחיקה עד החנקן הנוזלי מתאדה לגמרי, נותרה אבקה ירוקה.
- בקצרה צינת מרית מתכת בחנקן נוזלי עבור s 10-15, לאחר מכן סקופ הרקמה הקרקע בתוך המליטה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL, בעזרת המרית.
- להוסיף 600 µL של פתרון פירוק גרעיני (ראה טבלה של חומרים) באמצעות פיפטה µL 1000 ו מערבולת המדגם עבור s 1-3, ואז דגירה באמבט מים 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- להוסיף 3 µL של פתרון RNase lysate באמצעות פיפטה 10µL, להפוך את הצינור 2 - 5 פעמים כדי לערבב את זה, דגירה-37 מעלות צלזיוס חממה בארון למשך 15 דקות.
הערה: אפשר לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. - להוסיף 200 µL של חלבון משקעים פתרון, מערבולת על מהירות גבוהה עבור 20 s ולאחר מכן צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 13,000 g x כדי ליצור גלולה המשרד. בעוד הוא להיות centrifuged לדוגמה, להוסיף µL 600 של אלכוהול איזופרופיל בטמפרטורת החדר צינור microcentrifuge mL 1.5 טריים.
- באמצעות פיפטה µL של 1000, הסר בזהירות את תגובת שיקוע מדגם centrifuged, העברת אותו הצינור microcentrifuge mL 1.5 טריים המכילים אלכוהול איזופרופיל. עכשיו יכול להיות מושלך בגדר.
הערה: להימנע מזיהום את תגובת שיקוע עם חלבונים על ידי השארת כמות מזערית של תגובת שיקוע מעל בגדר. - היפוך הצינור עד ה-DNA הופך לגלוי כמו מסה של חוט כמו קווצות ולאחר מכן צנטריפוגה-13,000 g x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
- Decant את תגובת שיקוע, להוסיף 600 µL של 70% אתנול בגדר, להפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את ה-DNA, צנטריפוגה-13,000 g x עבור 1 דקות.
- בזהירות תשאף האתנול, עוזב בגדר DNA חופשי, ואז פתח, היפוך ברכבת התחתית, נח על נייר סופג. האוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- להוסיף 100 µL של ה-DNA התייבשות פתרון בגדר דנ א מיובשים, ולאחר מכן דגירה הדנ א באמבט מים 65 ° C עבור 1 h, תוך כדי ערבוב מדי פעם על-ידי הקשה ברכבת התחתית.
- מקום 1 µL של מים מטוהרים על microcuvette ולאחר להכניס אותו לתוך ספקטרופוטומטרים כדי לשמש מקום ריק. חשב את ריכוז הדנ א הנוכחי על-ידי הצבת µL 1 מדגם microcuvette ולאחר הוספת ספקטרופוטומטרים. ריכוז ה-DNA (ng/µL) יכול להיות גורם דילול מחושב כמו (260-320) × × 50 ng/µL.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את הדגימה ב 4 º C.
2. לבצע את ה-PCR על דגימות דנ א גנומי
- לשלב 10 µL 2 x PCR מאסטר לערבב (ראה טבלה של חומרים), µL 1 קדימה פריימר (pM 10/µL), 1 µL הפוך פריימר (pM 10/µL) (ראה טבלה 2 רצפים פריימר), 100 ננוגרם של דנ א גנומי שחולצו מן המדגם, וטיהרו מים (עד 20 נפח סופי µL) ב 50 µL PCR צינור קפיצי לערבב, בקצרה צנטריפוגה.
- להכניס את הצינור PCR thermocycler ולהפעיל בהתאם (ראה טבלה 1).
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. במידת הצורך, לאחסן מדגם ב 4 ° C בתום התגובה.
3. ה-DNA מוגבר בג'ל Agarose electrophorese
- שוקל 0.4 g agarose אבקת ולהוסיף אותו יחד עם מאגר x TAE 1 נקי 200 מל Erlenmeyer את הבקבוק, מילוי עד 50 מ.
- מבשלים במיקרוגל בחום גבוה למשך דקות 1.5, רועדת בכל 30 s, עד agarose הוא להתמוססות מלאה.
הערה: כפפות מבודדות לענידה לטיפול agarose נוזלי כדי למנוע כוויות. - להוסיף 2.5 µL של 10 מ"ג/מ"ל אתידיום ברומיד agarose נוזלי ו- shake לערבב ולאחר מכן שופכים את הג'ל agarose נוזלי לתוך תבנית ג'ל ברמה. להוסיף במהירות מסרקים ג'ל 12-שן רגילה לאחר שמזג.
- לאפשר את הג'ל להתקרר למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להסיר את הג'ל מסרקים, ולמקם את הג'ל לתוך קופסת ג'ל ברמה מלא עם מאגר x TAE 1.
- שימוש של micropipette, לטעון את דגימות ה-DNA מוגבר הכולל לתוך בארות. להוסיף 5 µL של ה-DNA סולם (ראה טבלה של חומרים) לבאר נפרד מדגימות שלך.
- Electrophorese את הדגימות במשך 35 דקות קבועה 90 V, ולאחר מכן להסיר את הג'ל ולמקם transilluminator UV.
- צילום ולנתח את הג'ל פסי צבע דפוס תוך שימוש UV transillumination-302 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה חיובית התשואות להקה ברורים המתאימים 500 bp טיריה Liberibacter Candidatus Las606/Lss6, ו/או להקה ברורים המתאימים ל- 700 bp Laa2/Laj5, מוסף בβ ribosomal מטוסי אף-16 אופרון9. הלהקה בקרת הגברה פנימית להופיע גם 400 bp. הלהקה הזאת מקביל הגברה של ג'ין FBOX הדר10, חייב להופיע על תוצאה להיחשב חוקיים (איור 1 , איור 2). חוסר 500 שתי bp ו- 700 להקות bp בזמן להקה bp 400 קיים מייצג תוצאה שלילית. ביצוע PCR על דגימות בריא תניב כמה דפוסים שאינם ספציפיים סימון בסביבות 700 bp ו- 400 bp; עם זאת, רק להקה מודגש יחיד המתאימים אלה משקולות מולקולרית מציין תוצאה חיובית (איור 1).
| מבצע | Temp. | זמן | מחזורים |
| דנטורציה הראשונית | 95 ° C | 3 - 5 דקות | 1 |
| דנטורציה | 95 ° C | 30 שניות | 35 |
| חישול | 55 ° C | 30 שניות | |
| אלונגציה | 72 ° C | 40 שניות | |
| התארכות הסופי | 72 ° C | 10 דקות | 1 |
טבלה 1. הגדרות Thermocycler להשתמש כדי להגביר את המטרה מטוסי אף-16 rDNA הגנים, FBOX הדר.
| שמו של פריימר | רצף | הפניה | |
| LAA2_F | 5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC איסור פרסום TTT-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA GCA גה אתא GCA CGA ACA A-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG גה מעשה CTT TCG המרכז לאמנות עכשווית CT-3... ' | Assay הזה | |
| FBOX_R | 5'-AGC אגא CCT GGC תאת TAT ACG מעשה G-3' | Assay הזה | |
| LSS_F | 5'-לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה איסור פרסום חברתנו של AGT לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה ATT CCG A-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
| LSS_R | 5'-ACC לפנות לסוכנות החתול CTA GGT AAA AAC C-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
בטבלה 2. שם תחל את רצף ה-DNA, הפניה.
איור 1. ניתוח של PCR המקובלת נובעת 4 דגימות רקמה עלה הדר נגוע ודוגמאות heathy שני להשתמש כפקדים שלילי. 'gDNA' מציין דגימת DNA גנומי מופק רקמת העלה הדרים. דוגמאות gDNA 1, gDNA 4 מגיעות דגימות עלים הדר נגוע; gDNA 2, 3, 5 ו- 6 הם Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) נגוע דגימות. דנ א נעקר כפי שנכתב בפרוטוקול. PCR בוצעה באמצעות ה-DNA גנומי שחולצו כתבנית, לפי הפרוטוקול (ראה טבלה 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS, ו FBOX עיין ערכות פריימר להשתמש (ראה טבלה 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. ג'ל להשלים תמונה של שלוש דוגמאות gDNA מוגבר. דוגמה 1 הוא רקמה בריאה הדרים; דוגמאות 2 ו- 3 הינם דגימות רקמה Clas נגוע. דגימות אלה תואמות gDNA 1, 2 ו- 3, כפי שניתן לראות באיור1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. זה קריטי כי כל השלבים עוקבים בדיוק כדי להשיג את התנאים האופטימליים ניסיוני רקמת כל העלה שימש במהלך הפגנה זו; עם זאת, ניתן לשנות בפרוטוקול תיאורטית לכלול כל סוג של רקמת הצמח. בעבר, חוקרים מופק דנ א גנומי רקמת הווריד של העלה, יותר מאשר רקמת העלה כולו, השיגו תוצאות דומות11. אם הלהקה התואם הגן FBOX הדר נכשל להופיע, התוצאה אינה חוקית, ייתכן שיש אחד או יותר של מספר שגיאות טכניות בהליך הפעלה. השגיאות הנפוצות כוללות: באמצעות מים מזוהמים או לא סטריליים, טיפים micropipette או צינורות microcentrifuge; כשל להוסיף רכיב אחד או יותר הדרושים בתערובת PCR או במהלך הפקת דנ א גנומי; כשל לשמור על התנאים thermocycler נאות; בעזרת ריאגנטים או מרכיבים אחרים שנמצאים מעבר לתאריך התפוגה שלהם; נכשל להוסיף אתידיום ברומיד או DNA עוד כתם לג'ל agarose; electrophoresing ה-DNA מוגבר במתח גבוה מדי או יותר מדי זמן; באמצעות מאגר טה הישן או מעורבות באופן לא תקין, או פשוט באמצעות מים במקום טה המאגר כדי למלא את התיבה ג'ל.
תחל LAA2_F ו- LAJ5_R נבחרו ממחקרים קודמים עקב הצלחתם לזהות Candidatus Liberibacter asiaticum ו- africanum. אלה תחל להגביר את יחידת משנה ribosomal הגנים rplA ו- rplJ, מניב שבר לחץ דם מוגבר של 669 מ ג ל' africanum או רסיס bp 703 מ ג ל' asiaticum9. תחל LSS_F ו- LSS_R נבחרו הזה assay ממחקרים קודמים שלהם הוקמה שיעור שלילי כוזב נמוך, דיוק וכתוצאה ירידה לפרטים עבור C. ל' asiaticum. ערכת פריימר LSS מגביר את רצף bp 500 כל שלושה מטוסי אף-16 rDNA גנים נוכח ג ל' asiaticum6. תחל FBOX נבנו לשימוש כפקד של הגברה פנימית ומגבירים רצף bp 400 הנמצאים בצמחים הדרים. מחקרים קודמים מראים כי FBOX מבוטא stably בצמחים הדרים, יגרום מועמד מצוין לשימוש גן הפניה כאשר התאמה זו assay RT-qPCR10.
Assay זו ניתן להתאים לשימוש עבור כל סוג של רקמה הדרים, יכול להיות שונה לשימוש עם נוספים מבוססי ה-PCR מבחני, כגון RT-qPCR. המגבלות של assay הזה מעטים, ורובם הטמון PCR קונבנציונלי. הגבלת גורמים אלה כוללים: הנוכחות של אתנול או כימיקלים אחרים מעכבות בתערובת PCR, העדר כימות ללא ביצוע של assay מתקדמים יותר, את הצורך של thermocycler במעבדות קטנות יותר, ואת נוכחותם של ה-DNA זיהום.
בעוד יחודיות של assay הזה לא הושוותה ישירות לשיטות RT-qPCR יותר ספציפי, וזמינותו זו שימושית עבור מדענים ביצוע מחקר על Candidatus liberibacter, חקלאים המבקשים לאבחן שעשויות להיות נגוע הדרים עצי בתחומם, במיוחד אם שיטות ספציפיות יותר אינם זמינים או חסכונית. אכן, זה מתקבל על הדעת כי מגדל הדר יחיד או חוקר יכול במהירות ובזול assay מאות דוגמאות בעוד כמה ימים, באמצעות פיפטות רב-ערוצי בשילוב עם מספר לוחות 96-ובכן, ללא רכישת של thermocycler RT-qPCR יקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
חן הואן, איאן ארתור פאלמר, ג'יאן חן, מינג צ'אנג, סטיבן ל' תומפסון, Fengquan Liu ו פו צ'ינג ג'נג מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
וימשיג, ע מ ו צ ש פ; החקירה, ח ג, ג' C ו- F ש צ; משאבים, צ ש פ; כתיבת - הטיוטה המקורית, א פ א; כתיבה – סקירה & עריכה, פ א א, י ג, ה ג, S. T ל' ו צ ש פ; ויזואליזציה, ה ג; פיקוח, צ ש פ; מימון הרכישה, צ ש F ול' ש פ
פרוייקט הנתמך על ידי דרום קרוליינה שיפור המורה איכות ההשכלה הגבוהה המדינה מענק שכותרתו שיפור האמצעי ציונים מורים למדע של הידע של הצמח תהליכים, מבנים, פונקציות באמצעות מעורבות במחקר מדעי הצמח (צמח מדע)
קרנות הוענק על ידי יונייטד משביעה את משרד החינוך (CFDA מספר 84.367B)
המחברים רוצה להודות ד ר וואנג Nian באוניברסיטת פלורידה למתן דגימות דנ א גנומי מן נגוע סיננסיס הדר ולנסיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
- UICEP. Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
