Specifiche e rilevazione accurata del Using PCR convenzionale su campioni di tessuto foglia agrumi Citrus Greening patogeno Candidatus liberibacter spp.

Summary

Citrus Greening è una malattia particolarmente distruttiva che interessano colture di agrumi a livello globale. Presentato qui è un metodo semplice usando PCR ed estrazione del DNA genomico di tessuto fogliare agrumi per l'accurata e precisa identificazione dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp.

Abstract

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, è una malattia distruttiva agrumi devastando agrumeti a livello globale. Questa malattia provoca asimmetrico foglia giallo chiazzatura, vena ingiallimento, defogliazione, decadimento di radice e in ultima analisi, la morte della pianta di agrumi. Quando infetta, le piante di agrumi hanno stentata crescita e producono fiori fuori stagione. Questi fiori frutti raramente, e quelli che producono agrumi piccoli, amaro, dalla forma irregolare che non sono desiderabili. Questa malattia è sparsa per l'Asian psyllid agrumi, Diaphorina citri e margotta di tessuto infetto di agrumi. L'agente patogeno ha un periodo di incubazione lungo e variabile all'interno della pianta di agrumi — a volte anni, prima che i sintomi compaiono. Tentativi di questo agente patogeno in vitro della coltura sono stati infruttuosi, possibilmente dovuto il livello basso e irregolare concentrazione dell'agente patogeno all'interno tessuto di agrumi contaminati, o perché è difficile da replicare l'ambientale condizioni favorevoli alla crescita di l'agente patogeno. È molto difficile individuare la malattia prima che si è diffuso, a causa del suo lungo periodo di incubazione e l'incapacità dei ricercatori alla cultura l'agente patogeno. Di conseguenza, la malattia diventa solo apparente dopo aver distrutto improvvisamente resa intera di un contadino di agrumi. Presentato qui è un metodo per la rilevazione accurata e specifica dell'agente patogeno citrus greening, Candidatus liberibacter spp utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico e PCR. Questo metodo è semplice, efficiente, conveniente e adattabile per l'analisi quantitativa. Questo metodo può essere adattato per l'uso su qualsiasi tessuto agrumi; Tuttavia, è potenzialmente limitato dalla quantità di agente patogeno presente nel tessuto. Tuttavia, questo metodo verrà consentire agli agricoltori di agrumi identificare le piante infette di agrumi all'inizio e frenare la diffusione di questa malattia distruttiva prima che possa diffondersi ulteriormente.

Introduction

Citrus greening, noto anche come huanglongbing, ha causato una perdita significativa di alberi di agrumi. Un caso rappresentativo è Florida, dove la malattia è prevista per causare una riduzione del 70% nella produzione di scatole di Florida arancione da scatole di 244 milioni nella stagione 1997-1998 a caselle 70 milioni a partire dal 2016-2017 stagione¹. Oltre il 90% degli alberi di agrumi in Florida sono infetti², e si stima che l'industria dell'agrume di Florida perde circa 1 miliardo di dollari ogni anno a causa di malattie degli agrumi, in cui citrus greening gioca un ruolo importante³. Citrus greening è trasmesso principalmente per la dilagante psyllid agrume asiatico Diaphorina citri, ma può essere trasmessa anche mediante innesto di tessuto infetto. La malattia provoca l'ingiallimento delle vene, foglia giallo asimmetrico chiazzatura, defogliazione precoce, avvizzimento progressivo ramoscello, decadimento di radice e morte della pianta. D'importanza, la malattia provoca la pianta di agrumi a produrre fiori fuori stagione, che raramente producono frutta. La frutta che è prodotta da piante di agrumi infetti è immaturi, verde e amaro degustazione⁴.

Lo scopo di questo metodo è quello con precisione e identificare con precisione il batterio mobile Candidatus liberibacter spp., l'agente causativo di citrus greening, vivono all'interno del floema di alberi di agrumi infetti⁵. Il DNA genomico è estratto dal tessuto foglia intera, che contiene i batteri vivi. Questo DNA genomico estratto viene utilizzato come un modello per PCR convenzionale, dove oligonucleotidi complementari alla sequenza del rDNA 16S del batterio sono utilizzati per amplificare questa sequenza. Oligonucleotidi complementari ad un gene FBOX agrumi sono utilizzati come un controllo di amplificazione interna. Abbiamo scelto di utilizzare questo metodo, perché essa ha dimostrato di avere successo nella precedente ricerca⁶.

Questo metodo ha il chiaro vantaggio di essere semplice, relativamente poco costoso e in grado di essere eseguita in qualsiasi laboratorio di biochimica normalmente attrezzata. Inoltre, PCR rimane il metodo più accurato e preciso per la rilevazione di questo agente patogeno, a causa della difficoltà di coltura di questo agente patogeno⁷e capacità del patogeno di sopravvivere e riprodursi per anni all'interno di un host asintomatico⁸. Molte specialità diverse analisi di PCR sono state usate per rilevare correttamente questo agente patogeno; Tuttavia, PCR convenzionale rimane il più semplice test per la rilevazione accurata e specifica, soprattutto all'interno di host asintomatico⁸.

Protocol

1. isolare il DNA genomico da tessuto vegetale utilizzando un Kit di estrazione genomico

1. Ottenere tessuto fogliare agrumi tagliando un intero fresco foglia da un albero di agrume utilizzando forbici pulite e portare l'anta in un sacchetto di plastica pulito sandwich.
   Nota: La borsa contenente tessuto fogliare deve essere inserita in un frigorifero a 4 ° C o il ghiaccio in un contenitore isolato appena possibile dopo la raccolta per evitare il deterioramento.
2. Aggiungere una piccola quantità di azoto liquido per raffreddare un mortaio e un pestello. Mentre essi sono agghiaccianti, usare le forbici per tagliare un piccolo pezzo di tessuto fogliare, circa 1 pollice quadrato di dimensioni. Posizionare il tessuto tagliato nel mortaio per congelare istantaneamente. Aggiungere più azoto liquido, se necessario.
   Nota: Guanti isolanti devono sempre essere indossati durante la manipolazione di azoto liquido.
3. Macinare rapidamente i tessuti vegetali in una polvere fine utilizzando il mortaio. Continuare la rettifica fino a quando l'azoto liquido evapora completamente, e rimane una polvere fine verde.
4. Brevemente chill una spatola di metallo in azoto liquido per 10-15 s, poi scoop il tessuto di terra all'interno di mortaio in una microcentrifuga da 1,5 mL, utilizzando la spatola.
5. Aggiungere 600 µ l di soluzione di lisi di Nuclei (Vedi Tabella materiali) utilizzando una 1000 µ l pipette e vortexare il campione per 1-3 e, quindi, Incubare in un bagno di acqua di 65 ° C per 15 min.
6. Aggiungere 3 µ l di soluzione di RNAsi al lisato utilizzando una pipetta 10 µ l, capovolgere la provetta 2 - 5 volte per mescolare e incubare a 37 ° C in un incubatore armadietto per 15 min.
   Nota: Lasciar raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere.
7. Aggiungere 200 µ l di soluzione di precipitazione della proteina, vortice ad alta velocità per 20 s, poi Centrifugare per 3 min a 13.000 x g per formare una pallottola solida. Mentre il campione è essere centrifugato, aggiungere 600 µ l di isopropanolo a temperatura ambiente per un tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL.
8. Utilizzando una pipetta di 1000 µ l, con attenzione rimuovere il supernatante dal campione centrifugato, trasferirlo al tubo del microcentrifuge fresco 1,5 mL contenenti isopropanolo. Il pellet può ora essere scartato.
   Nota: Evitare di contaminare il surnatante con proteina lasciando una quantità minuscola di surnatante sopra il pellet.
9. Capovolgere la provetta fino a quando il DNA diventa visibile come una massa di filamenti filiformi, poi Centrifugare a 13.000 x g per 1 min a temperatura ambiente.
10. Decantare il supernatante, aggiungere 600 µ l di etanolo al 70% per il pellet, capovolgere la provetta diverse volte per lavare il DNA e centrifugare a 13.000 x g per 1 min.
11. Attentamente aspirare l'etanolo, lasciando il pellet sciolto di DNA, quindi aprire e capovolgere la provetta, che riposa su carta assorbente. Aria secca a temperatura ambiente per 15 min.
12. Aggiungere 100 µ l di soluzione di reidratazione del DNA al pellet di DNA secchi, quindi incubare il DNA in un bagno di acqua di 65 ° C per 1 h, mescolando periodicamente toccando il tubo.
13. Posizionare 1 µ l di acqua purificata su un microcuvette e inserirlo in uno spettrofotometro per essere utilizzato come uno spazio vuoto. Calcolare la concentrazione di DNA presente posizionando 1 µ l di campione sulle microcuvette e inserimento nello spettrofotometro. Concentrazione di DNA (ng / µ l) può essere calcolato come (un₂₆₀-₃₂₀) × diluizione fattore × 50 ng / µ l.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione può essere conservato a 4 ° C.

2. eseguire la PCR su campioni di DNA genomico

1. Unire 10 µ l 2 x PCR Master Mix (Vedi tabella dei materiali), primer di 1 µ l in avanti (10 pM / µ l), 1 µ l reverse primer (10 pM / µ l) (Vedi tabella 2 per sequenze dell'iniettore), 100 ng di DNA genomic estratto dal campione e purificato acqua (fino a 20 µ l di volume finale) in un 50 µ l PCR tubo, flick per mescolare e brevemente della centrifuga.
2. Inserire il tubo PCR il termociclatore ed eseguire di conseguenza (Vedi tabella 1).
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se necessario, conservare il campione a 4 ° C dopo la reazione è completa.

3. elettroforesi del DNA amplificato in un Gel di agarosio

1. Pesare 0,4 g di polvere di agarosio e aggiungerlo insieme con 1 tampone di x TAE a un pulito 200 mL flacone erlenmeyer, riempimento fino a 50 mL.
2. Forno a microonde in alto per 1,5 minuti, scuotendo ogni 30 s, finchè agarosio sia completamente dissolto.
   Nota: Guanti isolanti devono essere indossati durante la manipolazione di liquidi dell'agarosi per evitare ustioni.
3. Aggiungere 2,5 µ l di bromuro di etidio 10 mg/mL il liquido agarosio e agitare per mescolare, quindi versare il gel di agarosio liquido in uno stampo di gel di livello. Inserire rapidamente pettini standard 12-dente del gel dopo la colata.
4. Lasciare che il gel a raffreddare per 20 min a temperatura ambiente, poi rimuovere gel pettini e mettere il gel in una scatola di livello gel riempito con 1 tampone di x TAE.
5. Utilizzando una micropipetta, caricare i campioni di DNA amplificati totali nei pozzetti. Aggiungere 5 µ l di DNA ladder (Vedi Tabella materiali) in un pozzo separato dai vostri campioni.
6. L'elettroforesi per 35 min a una costante 90 V, quindi rimuovere il gel e posto in un transilluminatore UV.
7. Fotografare e analizzare il gel banding modello mentre con transilluminazione UV a 302 nm.

Representative Results

Un risultato positivo produce una fascia distinta corrispondente a 500 bp per Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss⁶, e/o una fascia distinta corrispondente a 700 bp per Laa2/Laj5, un inserto nella β ribosomal 16S operone⁹. La banda di controllo di amplificazione interna deve essere presente anche a 400 bp. Questa banda corrisponde all'amplificazione dell'agrume FBOX gene¹⁰e deve comparire per un risultato da considerarsi validi (Figura 1 e Figura 2). Mancanza di entrambi 500 bp e 700 bande di bp, mentre una banda di bp 400 è presente rappresenta un risultato negativo. Esecuzione di PCR su campioni sani può produrre alcuni disegni a strisce non specifico circa 700 bp e 400 bp; Tuttavia, solo una singola banda grassetto corrispondenti a questi pesi molecolari indica un risultato positivo (Figura 1).

Funzionamento	Temp.	Tempo	Cicli
Denaturazione iniziale	95 ° C	3 - 5 min	1
Denaturazione	95 ° C	30 sec	35
Ricottura	55 ° C	30 sec
Allungamento	72 ° C	40 sec
Allungamento finale	72 ° C	10 min	1

Tabella 1. Thermocycler impostazioni utilizzate per amplificare geni 16S rDNA e agrumi FBOX.

Nome di Primer	Sequenza		Riferimento
LAA2_F	5'-TAT AAA GGT TGA CCT TTC GAG TTT-3'		Hocquellet, et al., 1999
LAJ5_R	5'-ACA AAA GAA GCA ATA GCA CGA ACA A-3'		Hocquellet, et al., 1999
FBOX_F	CT-3 DI 5'-TTG GAA ATTO CTT TCG CCA'		Questo test
FBOX_R	5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG ATTO G-3'		Questo test
LSS_F	5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3'		Fujikawa, et al., 2012
LSS_R	5'-ACC CAA GATTO CTA GGT AAA AAC C-3'		Fujikawa, et al., 2012

Tabella 2. Nome del primer, loro sequenza di DNA e il riferimento.

Figura 1. Analisi di PCR convenzionale risultati da quattro campioni di tessuto infetto foglia agrumi e due campioni heathy utilizzati come controlli negativi. 'gDNA' indica un campione di DNA genomico Estratto da tessuto fogliare agrumi. I campioni gDNA 1 e gDNA 4 sono da campioni non infetti foglia agrumi; gDNA 2, 3, 5 e 6 sono esempi di Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) infetti. Il DNA è stato estratto come scritto nel protocollo. PCR è stata effettuata usando il DNA genomic estratto come un modello, per il protocollo (Vedi tabella 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS e FBOX si riferiscono ai set di primer utilizzato (Vedi tabella 2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Fotografia di gel completo di tre campioni amplificati gDNA. Esempio 1 è tessuto sano di agrumi; i campioni 2 e 3 sono campioni di tessuto infettata Clas. Questi campioni corrispondono a gDNA 1, 2 e 3, come si vede nella Figura 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

È fondamentale che tutti i passaggi sono seguiti esattamente per ottenere le condizioni sperimentali ottimali. Tessuto di foglia intera è stato utilizzato durante questa dimostrazione; Tuttavia, il protocollo può essere modificato per includere teoricamente qualsiasi tipo di tessuto vegetale. In precedenza, i ricercatori hanno estratto il DNA genomico da tessuto fogliare della vena, piuttosto che del tessuto foglia intera e raggiunto simili risultati¹¹. Se la fascia corrispondente al gene FBOX agrumi non compare, il risultato non è valido, e ci possono essere uno o più dei diversi errori tecnici nella procedura operativa. Gli errori più comuni includono: utilizzando acqua contaminata o impropriamente sterilizzata, suggerimenti micropipetta o microcentrifuga; in mancanza di aggiungere uno o più componenti necessari del mix di PCR o durante l'estrazione del DNA genomico; non riuscendo a mantenere le condizioni di corretta thermocycler; utilizzando reagenti o altri ingredienti che sono oltre la loro data di scadenza; non riuscendo a aggiungere etidio bromuro o un altro DNA macchia per il gel di agarosio; Electrophoresing il DNA amplificato a una tensione troppo alta o troppo a lungo; e con vecchi o impropriamente misto buffer TAE, o semplicemente utilizzando acqua invece di tampone TAE per riempire la vaschetta del gel.

Primer LAA2_F e LAJ5_R sono stati scelti dalle ricerche precedenti a causa del loro successo a individuare africanum e Candidatus Liberibacter asiaticum. Questi iniettori amplificano subunità ribosomiche geni rplA e rplJ, producendo un frammento amplificato di bp 669 da C. l. africanum o un frammento di bp 703 da C. l. asiaticum⁹. Primer LSS_F e LSS_R sono stati scelti per questo test dalle ricerche precedenti a causa del loro basso tasso di falsi negativi stabilito, la precisione e la specificità per C. l. asiaticum. Il set di primer LSS amplifica una sequenza 500 bp in tutte le tre 16S rDNA geni presenti in C. l. asiaticum⁶. I primers FBOX sono stati costruiti per uso come un controllo di amplificazione interna e amplificano una sequenza di bp 400 piante di agrumi. La ricerca precedente dimostra che FBOX è stabilmente espressa in piante di agrumi e renderebbe un ottimo candidato per essere utilizzato come un gene di riferimento quando si adatta questo test per RT-qPCR¹⁰.

Questo dosaggio può essere adattato per essere usato per qualsiasi tipo di tessuto agrumi e possa essere modificato per l'utilizzo con ulteriori analisi PCR-basata, ad esempio RT-qPCR. Le limitazioni di questo test sono pochi, e la maggior parte sono inerente a PCR convenzionale. Tra questi fattori limitanti: la presenza di etanolo o altri prodotti chimici inibitori nella miscela PCR, la mancanza di quantificazione senza eseguire un'analisi più avanzata, la necessità di un termociclatore nei laboratori più piccoli e la presenza di contaminazione da DNA.

Mentre la specificità di questo test non è stata confrontata direttamente con i metodi più specifici, RT-qPCR, questo test è utile per gli scienziati conducendo ricerche su Candidatus liberibacter, e gli agricoltori che cercano di diagnosticare potenzialmente infettati agrumi alberi nei loro settori, soprattutto se metodi più specifici non sono disponibili o conveniente. Infatti, è concepibile che un singolo coltivatore agrumi o un ricercatore potrebbe rapidamente ed economicamente analisi diverse centinaia di campioni in pochi giorni, utilizzando pipette multicanale combinate con diverse piastre da 96 pozzetti, senza l'acquisto di un costoso thermocycler RT-qPCR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions
Liquid nitrogen	Air Products	N/A
Mastercycler pro with control panel	Eppendorf	6321000019
1250 W Microwave	Panasonic	N/A
5424 table top centrifuge	Eppendorf	05-403-93
Isotemp 215 digital water bath	Fisher scientific	15-462-15Q
Metal spatula	Sigma-Aldrich	Z283274
Mortar and pestle	Sigma-Aldrich	Z247464
LSE Vortex Mixer	Corning	6775
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516
Sterile 10 μL tips	TipOne	1161-3730
Sterile 200 μL tips	TipOne	1163-1730
Sterile 1250 μL tips	TipOne	1161-1750
Variable Volume Pipettor Kit	VWR	75788-460
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510
Agarose	IBI Scientific	IB70041
EDTA	Thermo Fisher Scientific	17892
Acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Tris base	Sigma-Aldrich	10708976001
μcuvette	Eppendorf	6138000018
Stackable casting tray and combs	Carolina	213655
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Mini-Sub Cell GT System	Bio-Rad	1704487EDU
Biospectrometer basic	Eppendorf	6135000009
0.2 mL PCR tubes	Fisher scientific	AB-0620
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	3439
2X Taq Green PCR Master Mix	Promega	M7122
Forward Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Reverse Primer	Thermo Fisher Scientific	N/A
Water, PCR grade	Sigma-Aldrich	3315953001
Gel Doc XR+	Bio-Rad	1708195
1 KB+ DNA ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018