Summary
Enverdecimiento de los cítricos es una enfermedad particularmente destructiva que afecta a cultivos de cítricos a nivel mundial. Presentado aquí es un método simple usando PCR y extracción de ADN genómica de tejido foliar cítricos para la identificación exacta y precisa de lo patógeno de enverdecimiento de los cítricos Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, es una enfermedad destructiva de cítricos causando estragos en granjas de cítricos a nivel mundial. Esta enfermedad causa moteado asimétrica hoja amarilla, vena amarillamiento, defoliación, caries de la raíz y en última instancia, la muerte de la planta de cítricos. Cuando infectados, las plantas de cítricos con retraso en el crecimiento y producen flores fuera de temporada. Estas flores raramente rendir fruto, y aquellos que producen cítricos pequeñas, amargas y de forma irregular no son deseables. Esta enfermedad se transmite por el psílido asiático de los cítricos, Diaphorina citri y por el injerto de tejido infectado de cítricos. El patógeno tiene un período de incubación largo y variable dentro de la planta cítricos, a veces años, antes de que aparezcan los síntomas. Los intentos de cultivar este agente patógeno en vitro han tenido éxito, posiblemente debido a la baja y desigual concentración del patógeno dentro de infectados tejido cítricos, o porque es difícil replicar el medio ambiente las condiciones propicia para el crecimiento de el patógeno. Es muy difícil identificar la enfermedad antes de que se ha propagado, debido a su período de incubación largo y la incapacidad de los investigadores para el patógeno de la cultura. Como resultado, la enfermedad sólo se hace evidente después de repente destruir toda producción de un agricultor cítricos. Presentado aquí es un método para la detección precisa y específica del patógeno de enverdecimiento de los cítricos, Candidatus liberibacter spp. usando un kit de extracción de DNA genómico y PCR. Este método es simple, eficiente, rentable y adaptable para el análisis cuantitativo. Este método puede adaptarse para su uso en cualquier tejido cítricos; sin embargo, potencialmente está limitada por la cantidad de patógenos presentes en el tejido. Sin embargo, este método permitirá cítricos agricultores identificar plantas cítricas infectadas antes y frenar la propagación de esta enfermedad destructiva antes de que se propaguen aún más.
Introduction
Enverdecimiento de los cítricos, también conocida como huanglongbing, ha causado una pérdida significativa de árboles de cítricos. Un caso representativo es la Florida, donde pronostican la enfermedad causa una reducción del 70% en la producción de cajas de naranja de Florida de 244 millones de cajas en la temporada 1997-1998 a 70 millones de cajas a partir de la temporada 2016-20171. Más del 90% de los árboles de cítricos en Florida son infectados2, y se estima que la industria cítrica de Florida pierde alrededor de 1 billón de dólares cada año debido a enfermedades de cítricos, en donde enverdecimiento de los cítricos juega un papel importante3. Enverdecimiento de los cítricos se extiende principalmente por el invasor psílido asiático de los cítricos Diaphorina citri, pero también puede propagarse por injerto de tejido infectado. La enfermedad causa amarillamiento de las venas, moteado de la hoja amarilla asimétrica, defoliación prematura, muerte regresiva de ramas, caries de raíz y muerte de la planta. Lo importante, la enfermedad causa la planta de cítricos producir flores fuera de temporada, que rara vez producen fruta. El fruto que es producido por las plantas cítricas infectadas es inmaduros, verdes y amargo sabor4.
El propósito de este método es exactamente e identificar con precisión el móvil de la bacteria Candidatus liberibacter spp., el agente causativo del enverdecimiento de los cítricos, en el líber de árboles cítricos infectados5. ADN genómico se extrae tejido de la hoja entera, que contiene bacterias vivas. Este ADN genómico extraído se utiliza como plantilla para PCR convencional, donde se utilizan oligonucleótidos complementarios a la secuencia de ADNr 16S de la bacteria para amplificar esta secuencia. Oligonucleótidos complementarios a un gen FBOX cítricos se utilizan como un control de amplificación interno. Optamos por utilizar este método, porque se ha demostrado para tener éxito en la investigación anterior6.
Este método tiene la clara ventaja de ser simple, relativamente barato y puede realizarse en cualquier laboratorio de bioquímica normalmente equipada. Además, la PCR sigue siendo el método más preciso y exacto para la detección de este patógeno, debido a la dificultad de cultivo este patógeno7y capacidad del patógeno de sobrevivir y reproducirse durante años dentro de un anfitrión asintomático8. Muchos análisis PCR de diferentes especialidades se han utilizado para detectar con éxito este patógeno; sin embargo, la PCR convencional sigue siendo el ensayo más simple para la detección exacta y específica, especialmente en huéspedes asintomáticos8.
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Protocol
1. aislar el ADN genómico de tejidos vegetales utilizando un Kit de extracción genómica
- Obtener tejido foliar cítricos cortando un fresco entero de la hoja de un árbol cítrico con unas tijeras limpias y coloque la hoja en una bolsa de plástico limpia sandwich.
Nota: La bolsa que contiene el tejido de la hoja debe colocarse en un refrigerador de 4 ° C o en hielo en un contenedor aislado tan pronto como sea posible después de la colección para evitar deterioro. - Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un mortero y una maja. Mientras que son escalofriantes, use tijeras para cortar un pedazo pequeño de tejido foliar, aproximadamente 1 pulgada cuadrada de tamaño. Lugar el corte del tejido en el mortero para congelarlo inmediatamente. Añadir más nitrógeno líquido, si es necesario.
Nota: Siempre deben usar guantes aislantes al manipular nitrógeno líquido. - Rápidamente moler el tejido de la planta en un polvo fino usando el mortero. Continuar moliendo hasta que el nitrógeno líquido se evapora completamente, y sigue siendo un polvo fino verde.
- Brevemente chill una espátula de metal en nitrógeno líquido de 10-15 s, luego sacar el tejido de la planta dentro del mortero en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, utilizando la espátula.
- Añadir 600 μl de solución de lisis de núcleos (véase Tabla de materiales) usando un 1000 μl de pipeta y agitar la muestra para 1-3 s, entonces Incube en un baño de agua de 65 ° C durante 15 minutos.
- Agregar 3 μl de Rnasa solución al lisado utilizando una pipeta de 10 μl, invertir el tubo 2 - 5 veces y mezclar, incubar a 37 ° C en una incubadora de gabinete durante 15 minutos.
Nota: Deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente antes de proceder. - Añadir 200 μL de solución de precipitación de proteína, vortex en alta velocidad por 20 s, luego centrifugar por 3 min a 13.000 x g para formar un pellet firme. Mientras que se se centrifuga la muestra, añadir 600 μl de isopropanol de temperatura ambiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco.
- Con una pipeta de 1000 μl, retire con cuidado el sobrenadante de la muestra centrifugada, transferir al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco que contiene isopropanol. Ahora puede descartarse la pelotilla.
Nota: Evite contaminar el sobrenadante con la proteína dejando una cantidad minúscula de sobrenadante por encima de la pelotilla. - Invertir el tubo hasta que el ADN se hace visible como una masa de filamentos filiformes, luego centrifugar a 13.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente.
- Decantar el sobrenadante, añadir 600 μl de etanol al 70% para el pellet, invertir el tubo varias veces para lavar el DNA y centrifugar a 13.000 x g durante 1 minuto.
- Cuidadosamente aspirar el etanol, dejando el pellet de ADN suelto, luego abrir e invertir el tubo sobre papel absorbente. Aire seco a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- Añadir 100 μl de solución de rehidratación de la DNA para el pellet de ADN seco, luego incubar el ADN en un baño de agua de 65 ° C durante 1 h, mientras se mezcla periódicamente golpeando suavemente el tubo.
- Coloque 1 μl de agua purificada en una microcubeta y colóquelo en un espectrofotómetro para ser utilizado como un espacio en blanco. Calcular la concentración de ADN presente colocar 1 μl de la muestra sobre la microcubeta, e insertando en el espectrofotómetro. Concentración de ADN (ng/μL) puede ser calculado como (un260- un320) × dilución factor × 50 ng/μl.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. La muestra puede conservarse a 4 ° C.
2. realizar PCR en muestras de ADN genómico
- Combinar 10 μl 2 x PCR Master Mix (véase tabla de materiales), primer avance de 1 μl (10 pM/μL), 1 μl de invierte cartilla (10 pM/μL) (ver tabla 2 para las secuencias de la cartilla), 100 ng de ADN genómico extraído de la muestra y purificado de agua (volumen final de hasta 20 μl) en una 50 μl PCR tubo, flick para mezclar y brevemente centrífuga.
- Inserte el tubo PCR en el termociclador y funcionar en consecuencia (véase tabla 1).
Nota: El protocolo se puede detener aquí. Si es necesario, guarde la muestra a 4 ° C después de la reacción es completa.
3. electrophorese el ADN amplificado en un Gel de agarosa
- Peso 0,4 g de agarosa en polvo y añadir junto con 1 x TAE buffer a una limpia 200 mL matraz Erlenmeyer, 50 mL de relleno.
- Microondas en alto por 1,5 min, agitando cada 30 s, hasta que la agarosa se disuelva completamente.
Nota: Se deben usar guantes aislantes durante la manipulación de agarosa líquida para evitar quemaduras. - Añadir 2,5 μl de bromuro de etidio 10 mg/mL a la agarosa líquida y agitar para mezclar y verter el gel de agarosa líquida en un molde de gel nivel. Inserte rápidamente el estándar 12-tooth gel peines después de verter.
- Permita que el gel se enfríe por 20 min a temperatura ambiente y luego quitar gel de peines y coloque el gel en una caja de gel nivel llenada de tampón de x TAE 1.
- Usando una micropipeta, cargar las muestras de ADN amplificadas total en pozos. Añadir 5 μl de DNA ladder (véase Tabla de materiales) en un pozo aparte de sus muestras.
- Electrophorese las muestras durante 35 minutos a una constante 90 V, luego retirar el gel y colocar en un transiluminador UV.
- Fotografiar y analizar el gel de patrón de bandas durante el uso de la transiluminación UV 302 nm.
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Representative Results
Un resultado positivo produce una banda distinta correspondiente a 500 bp para Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, o una banda distinta correspondiente a 700 bp para Laa2/Laj5, un inserto en el β ribosomal 16S operón9. La banda de control de amplificación interno debe aparecer también en 400 bp. Esta banda corresponde a la amplificación de los cítricos FBOX gen10y debe aparecer un resultado a considerar válido (figura 1 y figura 2). Falta de ambos 500 bp y 700 bandas de bp, mientras que una banda de bp 400 está presente representa un resultado negativo. Realizar PCR en las muestras saludables puede producir algunos patrones de bandas inespecíficas alrededor de 700 bp y 400 bp; sin embargo, sólo una única banda negrita correspondientes a estos pesos moleculares indica un resultado positivo (figura 1).
| Operación | A la temperatura. | Tiempo | Ciclos de |
| Desnaturalización inicial | 95 ° C | 3 - 5 min | 1 |
| Desnaturalización | 95 ° C | 30 seg. | 35 |
| De recocido | 55 ° C | 30 seg. | |
| Alargamiento | 72 ° C | 40 segundos | |
| Elongación final | 72 ° C | 10 min | 1 |
Tabla 1. Termociclador valores utilizados para amplificar genes de Diana 16S rDNA y cítricos FBOX.
| Nombre de la cartilla | Secuencia de | Referencia | |
| LAA2_F | 5'-TAT AAA GGT TGA AAC TTC GAG TTT-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA ACG GAA ATA ACG CGA ACA A-3' | Hocquellet, et al., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG GAA LEY CTT TCG CCA CT-3' | Este ensayo | |
| FBOX_R | 5'-AGC AGA CCT GGC TAT TAT ACG LEY G-3' | Este ensayo | |
| LSS_F | 5'-GGA GAG GTG AGT GGA ATT CCG A-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
| LSS_R | 5'-CAC CAA GATO CTA GGT AAA AAC C-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
Tabla 2. Nombre de cartillas y su secuencia de ADN, referencia.
Figura 1. Análisis de PCR convencional resulta de cuatro muestras de tejido de hojas cítricos infectados y dos muestras heathy utilizadas como controles negativos. 'gDNA' indica una muestra de ADN genómica extraído de tejido foliar cítricos. Muestras gDNA 1 y gDNA 4 son de muestras de hojas cítricos no infectada; gDNA 2, 3, 5 y 6 son Candidatus liberibacter asiaticum (Clas) infectado muestras. Se extrajo ADN como escrito en el protocolo. PCR fue realizada usando la DNA genomic extraída como una plantilla, por el protocolo (véase tabla 1). LAA2/LAJ5, LAS606/LSS y FBOX se refieren a los conjuntos de la cartilla utilizados (ver tabla 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fotografía de gel completo de tres muestras amplificadas gDNA. 1 la muestra es tejido cítricos sano; las muestras 2 y 3 son las muestras de tejido infectada de la Clas. Estas muestras corresponden a gDNA 1, 2 y 3, como se ve en la figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Es fundamental que se sigan todos los pasos exactamente para lograr condiciones experimentales óptimas. Tejido de hoja entera fue utilizado durante esta demostración; sin embargo, el protocolo puede ser modificado para incluir teóricamente cualquier tipo de tejido vegetal. Previamente, investigadores han extraído ADN genómico de tejido de la vena de la hoja, en lugar de tejido de hoja entera y consigue similares resultados11. Si la banda correspondiente al gen FBOX cítricos no compareciera, el resultado es válido, y puede haber uno o más de varios errores técnicos en el procedimiento operativo. Errores comunes incluyen: uso de agua contaminada o mal esterilizado, puntas de micropipeta o tubos de microcentrífuga. pudiendo añadir uno o más componentes necesarios en la mezcla PCR o durante la extracción de ADN genómica; no mantener las condiciones del termociclador adecuada; uso de reactivos u otros ingredientes que están más allá de su fecha de vencimiento; pudiendo añadir etidio bromuro o DNA otra mancha para el gel de agarosa; electrophoresing el ADN amplificado en una tensión demasiado alta o demasiado; y utilizando Tampón TAE viejo o mal mezclado, o simplemente con agua en vez de Tampón TAE a llenar la caja de gel.
Cebadores LAA2_F y LAJ5_R fueron elegidos de investigaciones anteriores debido a su éxito en identificar africanum y Candidatus Liberibacter asiaticum. Estos cebadores amplifican la subunidad ribosomal genes rplA y rplJ, produciendo un fragmento amplificado de bp 669 de C. l. africanum o un fragmento de bp 703 de C. l. asiaticum9. Cebadores LSS_F y LSS_R fueron elegidos para este ensayo de investigación anterior debido a su tasa negativa falsa baja establecido, precisión y especificidad para C. l. asiaticum. El sistema de cartilla LSS amplifica una secuencia de bp 500 en los tres 16S rDNA genes presentes en C. l. asiaticum6. Los cebadores FBOX fueron construidos para el uso como un control de amplificación interno y amplifican una secuencia de bp 400 encontrado en plantas de cítricos. Investigación previa muestra que FBOX estable se expresa en plantas de cítricos y sería un gran candidato para el uso como un gen de referencia cuando la adaptación de este ensayo de RT-qPCR10.
Este análisis pueden ser adaptado para cualquier tipo de cítricos y pueden ser modificado para su uso con análisis polimerización en cadena-basado adicionales, como RT-qPCR. Las limitaciones de este ensayo son pocos y la mayoría son inherente a la PCR convencional. Estos factores limitantes son: la presencia de etanol o de otros productos químicos inhibitorios en la mezcla PCR, la falta de cuantificación sin realizar un análisis más avanzado, la necesidad de un termociclador en laboratorios más pequeños y la presencia de contaminación del ADN.
Mientras que la especificidad de este ensayo no se ha comparado directamente a los más específicos métodos de RT-qPCR, este análisis es útil para los científicos realizar investigaciones de Candidatus liberibacter, y los agricultores que buscan diagnosticar potencialmente infectaron cítricos árboles en sus campos, sobre todo si métodos más específicos no están disponibles o rentable. De hecho, es concebible que un solo cultivador cítricos o investigador podría rápida y barata de ensayo varias cientos muestras en pocos días, utilizando pipetas multicanales combinados con varias placas de 96 pocillos, sin tener que comprar un costoso termociclador RT-qPCR.
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Disclosures
Huan Chen Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Chang Ming, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu y Zheng Qing Fu no declaran conflictos de interés.
Acknowledgments
Conceptualización, H.C. y Z. p. F.; Investigación, H. C., J. C y Z. p. F; Recursos, Z. p. F.; Escritura - proyecto Original, I. A. P.; Redacción, revisión y edición, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. y F. de p. Z.; Visualización, H. C.; Supervisión, Z. p. F.; Financiación de adquisición, Z. p. F y F. p. L.
Proyecto apoyado por Carolina del sur mejorar maestro calidad educación superior estado becado titulado, conocimiento de procesos de la planta mejorar medio grados ciencia docentes, estructuras y funciones a través de la participación en investigación en Ciencias de planta (planta Ciencia)
Fondos otorgados por el Reino Estados Departamento de Educación (CFDA número 84.367B)
Los autores desean dar las gracias a Dr. Nian Wang de la Universidad de Florida para proporcionar muestras de ADN genómicas de infectados Valencia Citrus sinensis .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
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- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
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- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
