Summary
Цитрусовые озеленение является особенно разрушительным заболевание, поражающее цитрусовых культур во всем мире. Представленные здесь является простой метод с помощью ПЦР и Геномную ДНК добыча цитрусовых листовой ткани для точной и достоверной идентификации возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp.
Abstract
Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, является разрушительной цитрусовых заболевание опустошает цитрусовых ферм во всем мире. Эта болезнь вызывает асимметричный желтый лист крапчатость, пожелтение вен, дефолиации, корневой гнили и в конечном счете, смерть цитрусовых растений. Когда зараженный, цитрусовые растения низкорослые роста и производят цветы вне сезона. Эти цветы редко дают плоды, и те, которые дают небольшие, горький, неправильной формы цитрусовых, которые не являются желательными. Эта болезнь распространяется азиатских цитрусовых psyllid, Diaphorina citri и путем прививки инфицированные ткани цитрусовых. Возбудитель имеет длинный и переменной инкубационный период в цитрусовых растений — иногда годы, прежде чем симптомы появляются. Попытки культуры этот возбудитель в vitro были безуспешными, возможно из-за низкой и неравномерным концентрация патогена в инфицированных цитрусовых ткани, или потому, что трудно повторить экологических условий благоприятствующих росту патогена. Это очень трудно определить заболевание, прежде чем он распространился, благодаря его длительный инкубационный период и неспособность исследователей культуры возбудителя. В результате болезнь только становится очевидной после внезапно уничтожить весь урожай цитрусовых фермер. Представленные здесь — это метод для точной и конкретной обнаружения возбудителя цитрусовых озеленение, Candidatus liberibacter spp., с использованием геномной ДНК добыча комплект и ПЦР. Этот метод является простой, эффективной, экономически эффективным и адаптированы для количественного анализа. Этот метод может быть адаптирована для использования на любой цитрусовых ткани; Однако это потенциально ограничивается количество патогена присутствуют в ткани. Тем не менее этот метод позволит цитрусовых фермеров для выявления зараженных цитрусовых растений ранее и сдерживанию распространения этой разрушительной болезни, прежде чем она может распространяться далее.
Introduction
Цитрусовые озеленение, также известный как huanglongbing, вызвало значительные потери цитрусовых деревьев. Один представитель случай является Флорида, где, по прогнозам, болезнь вызывают снижение на 70% в производстве Флорида оранжевый коробки из 244 миллиона коробок в сезоне 1997-1998 годов до 70 миллионов коробок по состоянию на 2016-2017 сезон1. Свыше 90% цитрусовых деревьев во Флориде являются зараженные2, и предполагается, что цитрусовая промышленность Флорида теряет около одного миллиарда долларов каждый год благодаря цитрусовых заболеваний, в котором цитрусовых озеленение играет важную роль3. Цитрусовые озеленение распространяется главным образом при инвазивных азиатских цитрусовых psyllid Diaphorina citri, но может также передаваться путем прививки зараженные ткани. Болезнь вызывает пожелтение вен, асимметричные желтый лист крапчатость, преждевременный листопад, отмирание веточку, корневой гнили и смерти завода. Важно отметить, что болезнь вызывает цитрусовые растения производить цветы вне сезона, которые редко плодоносить. Плоды, которые производится инфицированных цитрусовых растений незрелых, зеленый и горький, дегустация4.
Цель этого метода является точно и точно идентифицировать подвижные бактерия Candidatus liberibacter spp., возбудителя цитрусовых озеленение, живущих в пределах флоэма зараженных цитрусовые деревья5. Геномная ДНК, извлеченные из ткани весь лист, который содержит живых бактерий. Этот геномной ДНК используется в качестве шаблона для обычных PCR, где олигонуклеотиды дополняет бактерия 16S рДНК последовательности используются для усиления этой последовательности. Олигонуклеотиды комплементарную цитрусовых Транслируется используются как элемент внутреннего усиления. Мы решили использовать этот метод, потому что было доказано, чтобы быть успешным в предыдущих исследований6.
Этот метод имеет явное преимущество простой, относительно недороги и могут быть выполнены в любой лаборатории обычно оборудованы биохимии. Кроме того ПЦР остается наиболее точное и точный метод для обнаружения этого патогена, из-за сложности культивирования Этот возбудитель7и возбудителя способность выжить и воспроизвести лет бессимптомно принимающей8. Многие различные специальности анализы ПЦР были использованы для успешного обнаружения возбудителя; Однако обычные ПЦР остается простейший assay для точной и конкретной обнаружения, особенно в рамках бессимптомной хостов8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изолируйте геномной ДНК из растительной ткани, используя набор Genomic извлечения
- Получите цитрусовых листовой ткани резки весь свежий лист из цитрусового дерева, с использованием чистой ножницы и положите лист в чистые пластиковые сэндвич мешок.
Примечание: Пакет, содержащий ткани листа следует поместить в холодильник 4 ° C или на льду в изотермических контейнеров как можно скорее после коллекции, чтобы избежать порчи. - Добавьте небольшое количество жидкого азота для охлаждения ступку и пестик. Хотя они являются пугающими, используйте ножницы, чтобы вырезать небольшой кусок ткани листа, примерно 1 квадратный дюйм в размер. Место среза ткани в раствор немедленно заблокировать его. Добавьте более жидкий азот, в случае необходимости.
Примечание: Изолированные перчатки должны всегда носить при обработке жидким азотом. - Быстро измельчить растительной ткани в мелкий порошок, используя раствор. Далее, измельчение до жидкого азота полностью испаряется, и зеленый порошок остается.
- Кратко холод металлической лопаткой в жидком азоте для 10-15 s, а затем совок на земле ткани внутри раствор в 1,5 мл microcentrifuge трубку, используя шпатель.
- 600 мкл раствора Lysis ядер (см. Таблицу материалы) с использованием 1000 мкл Пипетка и вихревой образца для 1-3 сек, затем инкубировать в 65 ° C водяной бане 15 мин.
- 3 мкл раствора РНКазы lysate с помощью пипетки 10 мкл, инвертировать трубки 2 - 5 раз смешать его, и инкубировать при 37 ° C в шкаф инкубатора для 15 мин.
Примечание: Позвольте смеси остыть до комнатной температуры перед продолжением. - Добавьте 200 мкл белка осадков раствора, вихрь на высокой скорости для 20 s, а затем центрифуги для 3 мин на 13 000 x g сформировать твердые гранулы. В то время как образец является время центрифугируется, добавьте 600 мкл комнатной температуре изопропанола пробки microcentrifuge свежие 1,5 мл.
- С помощью пипетки 1000 мкл, тщательно удалите супернатант из центрифугировали образца, передачи его на трубу microcentrifuge свежие 1,5 мл, содержащих изопропиловый спирт. Теперь можно выбраковать гранулы.
Примечание: Избегайте загрязнения супернатант с белком, оставляя незначительное количество супернатант выше гранулы. - Инвертировать трубку, пока становится видимым как масса нитевидные нитей ДНК, а затем центрифуги на 13 000 x g 1 мин при комнатной температуре.
- Декант супернатанта, 600 мкл 70% этанола в гранулах, перевернуть трубку несколько раз мыть ДНК, и центрифуги на 13 000 x г за 1 мин.
- Тщательно аспирационная этанола, оставляя сыпучих гранул ДНК, а затем открыть и инвертировать трубки, опираясь на абсорбирующий бумаги. Воздух сухой при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавьте 100 мкл раствора регидратации ДНК сухие гранулы ДНК, а затем инкубировать ДНК в ванну водой 65 ° C для 1 h, периодически помешивая, касания трубку.
- Место 1 мкл очищенной воды на microcuvette и вставить его в спектрофотометр использоваться как пустой. Рассчитайте концентрации ДНК нынешних 1 мкл пример на microcuvette, и вставка в спектрофотометра. Концентрация ДНК (нг/мкл) может быть вычисляемый как (260-320) × коэффициент разрежения × 50 нг/мкл.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. Образцы можно хранить при 4 ° C.
2. выполнять ПЦР на геномной ДНК образцов
- Объединить 10 мкл 2 x PCR Master Mix (см. таблицу материалов), 1 мкл вперед грунт (10 pM/мкл), 1 мкл обратный грунтовка (10 pM/мкл) (см. таблицу 2 для последовательностей праймера), 100 нг геномной ДНК извлечены из образца и очищенной воды (до 20 мкл окончательный объем) в 50 мкл ПЦР-пробирку, Флик смешивать и кратко центрифуги.
- Вставьте Термоциклер ПЦР-пробирку и запустить соответственно (см. таблицу 1).
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. При необходимости Храните образца при температуре 4 ° C, после завершения реакции.
3. electrophorese амплифицированного ДНК в агарозном геле
- Весят 0.4 g агарозы порошок и добавить его вместе с 1 x TAE буфер в чистой 200 мл колбу Эрленмейера, заполнение до 50 мл.
- Микроволновой на высоко в течение 1,5 мин, пожимая каждые 30 сек, пока полностью не растворится агарозы.
Примечание: Изолированные перчатки следует надевать при обработке жидких агарозы для предотвращения ожогов. - 2.5 мкл бромид ethidium 10 мг/мл жидкого агарозы и встряхните смесь, затем вылейте жидкость агарозном геле в форму уровня геля. Быстро вставьте стандартные 12-зубов гель Расчески после заливки.
- Разрешить гель остыть в течение 20 минут при комнатной температуре, а затем удалить гелем Комбс и поместите гель в поле уровень Гель заполнены с 1 x TAE буфера.
- С помощью микропипеткой, загрузите всего усиливается образцы ДНК в скважины. Добавьте 5 мкл ДНК лестница (см. Таблицу материалы) в отдельной скважины от ваших образцов.
- Electrophorese образцы для 35 мин с постоянной 90 V, а затем удалить гелем и место в УФ transilluminator.
- Фотография и анализировать гель диапазонов шаблон при использовании ультрафиолетового просвечивания в 302 Нм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Положительный результат дает различные группы соответствует 500 bp Candidatus Liberibacter Азиатская Las606/Lss6, и/или отдельных группы, соответствующий 700 bp для Laa2/Laj5, Вставка в рибосомных β 16S Оперон9. Группа внутреннего усиления контроля должны также появляются на 400 bp. Эта группа соответствует амплификации цитрусовых Транслируется гена10и должны появиться на результат, чтобы считаться действительными (рис. 1 и Рисунок 2). Отсутствие обоих 500 bp и 700 bp полос при 400 bp группа представляет отрицательный результат. Выполнение ПЦР на здоровых образцов может принести некоторые неспецифические диапазонов шаблоны около 700 bp и 400 bp; Однако только смелый однодиапазонный соответствующий этих молекулярных масс указывает положительный результат (рис. 1).
| Операция | Темп. | Время | Циклы |
| Первоначальный денатурации | 95 ° C | 3 - 5 мин | 1 |
| Денатурация | 95 ° C | 30 сек | 35 |
| Отжиг | 55 ° C | 30 сек | |
| Относительное удлинение | 72 ° C | 40 сек | |
| Окончательный удлинение | 72 ° C | 10 мин | 1 |
Таблица 1. Термоциклер параметры, используемые для усиления целевой 16S рДНК генов и цитрусовых блоки.
| Имя грунтовка | Последовательность | Ссылка | |
| LAA2_F | 5'-ТАТ AAA GGT TGA CCT TTC КЛЯП ТТТ-3' | Hocquellet, и др., 1999 | |
| LAJ5_R | 5'-ACA AAA ГЦА GAA ATA ГЦА CGA ACA A-3' | Hocquellet, и др., 1999 | |
| FBOX_F | 5'-TTG ГАА АКТ CTT ВРЧ ОСО CT-3' | Этот assay | |
| FBOX_R | 5'-AGC АГА CCT GGC ТАТ ТАТ ACG АКТ G-3' | Этот assay | |
| LSS_F | 5'-GGA КЛЯП GTG АГТ GGA ATT CCG A-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
| LSS_R | 5'-АКК УГА CAT CTA GGT AAA AAC C-3' | Fujikawa, et al., 2012 | |
В таблице 2. Имя грунты, их последовательность ДНК и ссылки.
Рисунок 1. Анализ ПЦР обычных результатов из четырех образцов ткани зараженных листьев цитрусовых и два вересковый образцов, используемых как негативный контроль. «геномная ДНК» указывает на образец геномной ДНК, извлеченные из цитрусовых листовой ткани. Образцы геномная ДНК 1 и геномная ДНК 4 являются от неинфицированных цитрусовых лист образцов; Геномная ДНК, 2, 3, 5 и 6 являются Candidatus liberibacter Азиатский (КЛА) зараженных проб. ДНК было извлечено как написано в протоколе. ПЦР была выполнена с использованием геномной ДНК в шаблоне, в протоколе (см. таблицу 1). LAA2/LAJ5, LAS606/ЗПУ и Транслируется ссылаются на грунт наборы, используемые (см. таблицу 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Полный гель фотоснимка трех усиливается геномная ДНК образцов. Пример 1 — здоровые ткани цитрусовых; образцы 2 и 3 являются образцы Clas инфицированных тканей. Эти образцы соответствуют геномная ДНК, 1, 2 и 3, как показано на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важно, что все шаги выполняются точно для достижения оптимального экспериментальных условиях. Весь лист ткани был использован во время этой демонстрации; Однако можно изменить протокол теоретически включать любые виды растительной ткани. Ранее Исследователи извлекали геномной ДНК из Вены ткани листа, а не весь лист ткани и достигнутые аналогичные результаты11. Если группы, соответствующий цитрусовых Транслируется ген не появляется, результатом является недействительным, и там может быть один или более из нескольких технических ошибок в процедуре работы. Наиболее распространенные ошибки: использование загрязненных или неправильно стерилизации воды, микропипеткой советы или microcentrifuge трубы; не добавить один или несколько необходимых компонентов в смеси ПЦР или во время экстракции геномной ДНК; неспособность поддерживать надлежащее Термоциклер условий; с помощью реагентов или другие ингредиенты, которые в прошлом истечения срока их действия; неспособность добавить ethidium бромид или иной ДНК пятно в агарозном геле; electrophoresing амплифицированного ДНК в слишком высоким напряжением или слишком долго; и с помощью старых или неправильно смешанные буфер TAE или просто воды вместо буфер TAE для заполнения поле геля.
Праймеры LAA2_F и LAJ5_R были выбраны из предыдущих исследований из-за их успех в выявлении, Азиатский Liberibacter Candidatus и africanum. Эти грунты усиливают Субблок рибосомных генов rplA и rplJ, уступая усиливается 669 bp фрагмент от C. l. africanum или фрагмент 703 bp от C. l. Азиатский9. Грунты, LSS_F и LSS_R были выбраны для этот assay из предыдущих исследований из-за их установленных низкий уровень ложных отрицательных, точности и конкретности для C. l. Азиатский. LSS грунтовка набор усиливает 500 bp последовательности в всех трех 16S рДНК генов в C. l. Азиатский6. Праймеры блоки были построены для использования в качестве внутреннего усиления управления и усилить 400 bp последовательность в цитрусовых растений. Предыдущие исследования показывают, что Транслируется стабильно выражается в цитрусовых растений и сделает отличным кандидатом для использования в качестве ссылки гена при адаптации этот assay для RT-ПЦР10.
Этот assay может быть адаптирована к быть использованы для любого типа ткани, цитрусовых и может быть изменен для использования с дополнительные анализы на основе ПЦР, таких как RT-ПЦР. Ограничения этот assay мало, и большинство присущи обычных PCR. Эти ограничивающие факторы включают: присутствие этанола или других ингибирующее химических веществ в смеси ПЦР, отсутствие количественный без выполнения более продвинутые пробирного, потребность Термоциклер в небольших лабораториях и наличие ДНК загрязнения.
В то время как специфика этот assay не были непосредственно сравнены более конкретных методов RT-ПЦР, этот assay полезен для ученых, выполняющих исследования на Candidatus liberibacter, и фермеры, стремясь выявить потенциально инфицированных цитрусовых деревья в их областях, особенно если более конкретные методы не доступны или экономически. Действительно вполне возможно, что один цитрусовых садовод или исследователь может быстро и дешево пробирного несколько сотен образцов в течение нескольких дней, с помощью многоканальных пипеток, в сочетании с несколькими 96-луночных плит, без покупки дорогостоящих Термоциклер RT-ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Huan Chen, Ian Артур Палмер, Чэнь Цзянь, Чанг Минг, Стивен Томпсон, Fengquan Лю и Фу Цин Чжэн объявить отсутствие конфликта интересов.
Acknowledgments
Концептуализации, H.C. и Z. Q. ф; Расследование, H. C., J. C и Z. Q. F; Ресурсы, Z. Q. ф; Написание - оригинальный проект, I. A. P.; Написание – обзор и редактирование, I. A. P., J. C., H. C., с л. т. и з. Q. ф; Визуализация, H. C.; Надзор, Z. Q. ф; Финансирование приобретения, Z. Q. F и F. Q. л
Проект поддержан Южная Каролина улучшение учитель качества высшего образования государственный грант под названием, повышение среднего классов науки учителя знания растений процессов, структур и функций посредством участия в наук исследования растений (завод Наука)
Фонды, награжден Соединенные Штатов Департамента образования (CFDA номер 84.367B)
Авторы хотели бы поблагодарить Nian Ванг из университета Флориды для предоставления геномной ДНК образцов от инфицированных Citrus sinensis Валенсии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Source of Nuclei Lysis, RNase, Protein Precipitation, and DNA Rehydration solutions |
| Liquid nitrogen | Air Products | N/A | |
| Mastercycler pro with control panel | Eppendorf | 6321000019 | |
| 1250 W Microwave | Panasonic | N/A | |
| 5424 table top centrifuge | Eppendorf | 05-403-93 | |
| Isotemp 215 digital water bath | Fisher scientific | 15-462-15Q | |
| Metal spatula | Sigma-Aldrich | Z283274 | |
| Mortar and pestle | Sigma-Aldrich | Z247464 | |
| LSE Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Sterile 10 μL tips | TipOne | 1161-3730 | |
| Sterile 200 μL tips | TipOne | 1163-1730 | |
| Sterile 1250 μL tips | TipOne | 1161-1750 | |
| Variable Volume Pipettor Kit | VWR | 75788-460 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Agarose | IBI Scientific | IB70041 | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 17892 | |
| Acetic acid | Fisher Chemical | A38-212 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| μcuvette | Eppendorf | 6138000018 | |
| Stackable casting tray and combs | Carolina | 213655 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Mini-Sub Cell GT System | Bio-Rad | 1704487EDU | |
| Biospectrometer basic | Eppendorf | 6135000009 | |
| 0.2 mL PCR tubes | Fisher scientific | AB-0620 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3439 | |
| 2X Taq Green PCR Master Mix | Promega | M7122 | |
| Forward Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Reverse Primer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Water, PCR grade | Sigma-Aldrich | 3315953001 | |
| Gel Doc XR+ | Bio-Rad | 1708195 | |
| 1 KB+ DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 |
References
- Field Office, F. lorida Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).
- Singerman, A., Useche, P. Impact of citrus greening on citrus operations in Florida. Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).
- Spreen, T. H., Hodges, A. The economic impact of HLB on the florida citrus industry. , University of Florida. (2012).
- UICEP. Pathology. , (2013).
- Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria. Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).
- Fujikawa, T., Iwanami, T. Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium "Candidatus Liberibacter asiaticus" by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers. Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).
- Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing. Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).
- Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015). , (2015).
- Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon. Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).
- Mafra, V., et al. Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions. PLoS One. 7 (2), e31263 (2012).
- Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing. J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).
