Summary
Vi utvecklade ett enkelt och effektivt protokoll för beredning av stora mängder sojabönor protoplasts att studera komplexa regelverk och signalering mekanismer i levande celler.
Abstract
Sojabönor (Glycine max (L.) Merr.) är en viktig gröda art och har blivit en baljväxt modell för studier av genetiska och biokemiska vägar. Det är därför viktigt att etablera en effektiv övergående gen uttryck system i sojabönor. Här rapporterar vi ett enkelt protokoll för beredning av sojabönor protoplasts och dess tillämpning för övergående funktionella analyser. Vi hittade att unga unifoliate blad från sojabönor plantor resulterade i stora mängder av hög kvalitet protoplasts. Genom att optimera en PEG-kalcium-medierad omvandling metod, uppnått vi hög förvandling effektivitet använder sojabönor unifoliate protoplasts. Detta system ger en effektiv och mångsidig modell för granskning av komplexa regelverk och signalering mekanismer i levande sojabönor celler och får hjälp att bättre förstå olika cellulär-, utvecklings- och fysiologiska processer av baljväxter.
Introduction
Protoplasts är växtceller som har cellväggar bort. De behålla de flesta av funktioner och aktiviteter av växtceller, protoplasts är en bra modell för att observera och utvärdera olika cellulära händelser och är värdefulla verktyg att studera somatisk hybridisering1 och växt regenerering2. Protoplasts har utnyttjats också allmänt för växt förvandling3,4,5, eftersom cellväggarna annars skulle blockera passagen av DNA i cellen. Protoplasts besitter några av fysiologiska svaren och cellulära processer av intakt växter, därför erbjuder grundläggande värde i grundforskning att studera subcellulär protein lokalisering6,7,8, protein-protein interaktioner9,10, och arrangören aktivitet11,12,13 i levande celler.
Isolering av växten protoplasts rapporterades först i 196014 och protokollen för både isolering och omvandling av protoplasts har utvecklats och optimerats. Ett standardförfarande av protoplast isolering innebär att skära av bladen och enzymatisk nedbrytning av cellväggar, följt av separation av släppt protoplasts från icke-smält vävnad skräp. Omvandling strategier inkluderar elektroporation15,16, Mikroskop17,18och polyetylenglykol (PEG)4,5,19 metoder. Ett stort antal arter har rapporterats framgångsrik för protoplast isolering, inklusive Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 och andra prydnadsväxter familjer23,24. Medan olika vävnadstyper används i olika arter, har ett system av övergående uttryck i Arabidopsis mesophyll protoplast (TEAMP) isolerade från bladen på modell växten Arabidopsis thaliana varit väl etablerade25 och allmänt antagna till applikationsmöjligheter.
Sojabönor (Glycine max (L.) Merr.) är en av de viktigaste proteinet och olja grödor26. Till skillnad från Arabidopsis och ris, är att erhålla genmodifierade sojabönor växter kända för att vara ganska svårt och låga effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-medierad infiltration har varit populärt används för övergående gen uttryck studier i de epidermala cellerna i tobak27 och plantor i Arabidopsis28,29, medan Agrobacterium rhizogenes har använts för omvandling av håriga rötter i sojabönor30. Virus-inducerade genen ljuddämpningssystemet metoder använts för nedreglering av mål gener31,32 och övergående uttryck33 i en systemisk sätt. Protoplasts ger en värdefull och mångsidigt alternativ till dessa synsätt. Protoplasts kan erhållas från sojabönors aboveground material och tillåter snabb och synkroniserade transgenens uttryck. Sedan första framgångsrika isolering av sojabönor protoplasts i den 198334, har det dock begränsat rapporter om tillämpningen av protoplasts i sojabönor35,36,37, 38, främst på grund av relativt låg avkastning av sojabönor protoplasts.
Här beskriver vi ett enkelt och effektivt protokoll för isolering av sojabönor protoplasts och dess tillämpning för övergående gen uttryck studier. Använder unga unifoliate blad från sojabönor plantor, kunde vi få stora mängder viktig protoplasts inom några timmar. Dessutom har vi optimerat en PEG-kalcium-medierad omvandling metod som är enkel och låg kostnad att leverera DNA in sojabönor protoplasts med hög verkningsgrad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tillväxt av växter
- Så 5-10 sojabönor frön (Williams 82) i 13 cm kruka i växthuset under lång-dag förhållanden (16 h ljus på 1 500 µmol m-2 s-1) vid 25 ° C på den anpassade jord mix för sojabönor (1:1:1-förhållande av jord, perlit och torped sand).
2. beredning av Plasmid DNA
- Med hjälp av en steril pipettspetsen eller tandpetare, plocka en enda koloni eller frysta glycerol lager av E. coli transporterar plasmiden som innehåller genen av intresse och Inokulera det i 20 mL Luria-Bertani (LB) flytande medium med lämplig antibiotika i en 50 mL mätkolv.
- Inkubera kolven vid 37 ° C över natten i en shaker. Samla in bakterierna genom centrifugering suspensionen vid 12 000 x g i rumstemperatur i 5 min och kasta bort supernatanten. Extrahera och rena plasmiden efter tillverkarens förfarande av en plasmid prep kit.
3. protoplast isolering
- Skär nyligen utvidgade unifoliate bladen från 10 - dag-gammal sojabönor plantor (figur 1).
Obs: Urval av bladen på en lämplig utvecklingsstadiet är nyckeln till framgång för sojabönor protoplast förberedelse. Använd endast bara utökade bladen i tidiga utvecklingsstadier. Som lämnar mogen, blivit cellväggar svårare för att smälta. - Med en färsk rakblad, ta bort HUVUDNERV unifoliate blad och sedan klippa resterna till 0,5-1 mm remsor.
Obs: Två unifoliate blad rötas i 10 mL enzym lösning kommer att ge tillräcklig protoplasts för mer än 10 transformationer. - Blad med hjälp av ett par pincett, överföring och remsor omedelbart och försiktigt i 10 mL nyberedd enzym lösning (tabell 1) i en 15 mL tub. Vakuum infiltrera bladet remsor för 15 min i rumstemperatur.
- Inkubera leaf remsorna i enzymet lösningen med mild agitation (40 rpm) i svagt ljus för 4-6 h i rumstemperatur. Se till att enzymet lösningen blir gul-grön när protoplasts släpps. Kontrollera enzym/protoplasts lösningen under mikroskopet (X10).
Obs: De frisläppta protoplasts är sfäriskt formade, medan osmält cellerna har oregelbunden eller oval form. - Överför 10 mL av enzym/protoplast lösning i en 50 mL tub genom att försiktigt hälla och tillsätt 10 mL W5 lösning (tabell 1) vid rumstemperatur att stoppa matsmältningen. Vänd röret försiktigt några gånger. Häll försiktigt enzym/protoplasts lösningen på en ren 75 µm nylon mesh placeras ovanpå en 50 mL tub ta bort osmält leaf vävnader.
- Centrifugera genomflöde enzym/protoplasts lösningen vid 100 x g i 50 mL röret för 1-2 min i rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten med serologiska pipett 10 mL utan att störa pelleten protoplast.
- Återsuspendera protoplasts och späd till en koncentration av 2 x 105 mL-1 i kylda W5 lösning vid 4 ° C genom att räkna protoplast nummer på en hemacytometer under mikroskopet (x10). Hålla protoplasts på is i 30 min.
- Centrifugera fjädringen på 100 x g för 1-2 min i rumstemperatur och ta försiktigt bort W5 lösningen med 1 mL pipett utan att störa pelleten protoplast. Återsuspendera protoplasts i MMG lösning (tabell 1) vid en koncentration på 2 x 105 mL-1 vid rumstemperatur.
4. protoplast omvandling
- Gör 100 µL portioner av protoplasts (2 x 104 protoplasts på 2 x 105 mL-1) i 1,5 mL låg friktion mikrocentrifugrör använder uncut 200 µL pipettspetsar. Placera en alikvot åt sidan för att fungera som negativ kontroll. Tillsätt 10 µL av Plasmiden (10-20 µg) i var och en av alikvoten som resten av protoplasts.
- Tillsätt långsamt 110 µL nylagade PEG lösning (tabell 1) på den inre väggen av 1,5 mL mikrocentrifug röret, och Vänd sedan försiktigt och vrid röret tills lösningen blir homogen.
- Inkubera omvandling blandningen i rumstemperatur i 15 min.
- Att stoppa omvandlingen, sakta lägga 400 µL W5 lösning till 1,5 mL röret vid rumstemperatur och vänd försiktigt röret tills lösningen blir homogen. Centrifugera röret på 100 g för 1-2 min i rumstemperatur och kasta bort supernatanten med pipett.
- Tillsätt 1 mL WI lösning (tabell 1) till röret och resuspendera av försiktigt pipettering 1 - 2 gånger. Tillsätt 1 mL 5% (vol/vol) steril kalvserum i varje brunn 6-väl vävnadsodling platta att belägga ytan och förhindra protoplasts fastnar på plattan.
- Efter några sekunder, kassera kalvserum med pipett. Över de återsuspenderade protoplasts till en brunn av kultur plattan. Täck tallriken med lock.
5. protoplast inkubation och skörd
- Inkubera i protoplasts i rumstemperatur i 1-2 dagar i mörkret.
Obs: Vi fann att två-dagars inkubation ger starkare fluorescerande protein signal i allmänhet jämfört med en-dagars inkubation, och att den fluorescerande protein signalen kan pågå i upp till 3-4 dagar. - Överför protoplast lösningen till ett 1,5 mL låg friktion mikrocentrifug rör. Centrifugera röret på 100 x g för 1-2 min i rumstemperatur att skörda protoplasts. Ta bort supernatanten med pipett och överföra 10 µL protoplasts på en glasskiva.
- Iaktta fluorescerande signal under fluorescens eller konfokalmikroskopi. Använd icke-omvandlad protoplasts som negativ kontroll (ingen signal bör observeras).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Olika organ i 10 - dagar gamla sojabönor testades för protoplast beredning (figur 1) och avkastningen observerades under mikroskopet (figur 2). Cellväggar från hypocotyl och epicotyl var knappast rötas, och vissa celler stannade fästa vid varandra (figur 2B, 2 C). Hjärtblad (figur 2D) och rot (figur 2A), cellväggar togs bort endast i en liten del av cellerna. Däremot ett stort antal protoplasts observerades när unifoliate var används (figur 2E-G). Unifoliate bladen under de olika utvecklingsstadierna var ytterligare undersökta (figur 2 H). Medan båda oexpanderade och bara utökad unifoliate bladen resulterade i hög avkastning i protoplasts, storlek protoplasts från det bara utvidgade unifoliate var mer uniform (figur 2F) än den oexpanderade unifoliate (figur 2E). För den fullständigt expanderad unifoliate, cellväggarna var fortfarande intakt i de flesta av cellerna (figur 2 g). Vi testade cellväggen-matsmältning enzymer från tre olika tillverkare och erhålls jämförbara resultat som beskrivs ovan. Baserat på dessa iakttagelser, slutsatsen vi att valet av växtmaterial var en avgörande faktor och att bara utökade unifoliate bladen från unga sojabönor plantor var det bästa materialet för protoplast förberedelse.
En rad olika mängder av plasmid DNA (0.1 µg, 1 µg, 5 µg och 20 µg) testades för optimal förvandling effektivitet av sojabönor unifoliate protoplasts (figur 3A-D). 20 µg plasmid DNA visade högsta förvandling effektivitet med mer än 50% omvandling hastighet (figur 3D), medan 0.1 µg visade det lägsta (mindre än 1%) (Figur 3A). Vi erhålls jämförbara förvandling effektivitet använder olika DNA rening kit från tre tillverkare. Detta resultat tyder på att större mängder av plasmid DNA kraftigt skulle bidra till att effektivisera omvandling.
Figur 4 är confocal bilder av sojabönor protoplasts omvandlas med konstruera p2GWF7-E1, som uttrycker GFP smält till baljväxter-specifika genen E1 (Glyma.06G207800), driven av promotorn 35S CaMV i den vektor p2GWF7 39. E1-GFP fusionsprotein visar cellkärnelokalisering i sojabönor protoplasts, vilket är förenligt med en tidigare studie använda Arabidopsis protoplast system40. E1 är en baljväxt-specifik gen, ger vårt resultat med hjälp av sojabönor protoplast systemet en avgörande inblick i subcellulär lokalisering av E1 protein.
Figur 1. Illustration som visar organ en sojabönor fröplanta som är testade för protoplast beredning i denna studie, inklusive roten, hypocotyl, hjärtblad, epicotyl och unifoliate. Efter ett par unifoliate blad utveckla sojabönor plantor trifoliate blad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Protoplast celler beredd från olika organ och utvecklingsstadier av sojabönor plantor. (A-D) Celler beredd från olika organ i 10 - dagar gamla sojabönor plantor: root (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), hjärtblad (D). (E-G) Protoplast celler beredd från unifoliate blad i olika utvecklingsstadier: oexpanderade (E), bara expanderat (F), och fullt utbyggd (G) unifoliate, motsvarande sojabönor plantorna i (H) till vänster, mitten och höger, respektive. Skalstapeln är 25 µm (A-G) eller 25 mm (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Confocal bilder visar omvandling effektivitet av sojabönor unifoliate protoplasts med olika mängder av plasmid DNA. Bilder av god Jordbrukarsed (representerade i grönt) och ljusa fält (grå) sammanfogas. Protoplasts omformades med olika mängder av de plasmid p2GWF7-E1: 0.1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) och 20 µg (D). Fluorescens signal om GFP var övervakas 24 timmar efter omvandling enligt mikroskopi. Svart skalstapeln är 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4. Confocal bilder visar subcellulär lokalisering av E1-GFP i kärnan av sojabönor unifoliate protoplasts. Den plasmid p2GWF7-E1 användes för omvandling. Bilder av god Jordbrukarsed (representerade i grönt) och ljusa fält (grå) slås samman. Fluorescens signal om GFP var övervakas 24 timmar efter transformation. Svart skalstapeln är 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Enzymet lösning (nyberedd) | |
| MES, pH 5,7 | 20mM |
| Cellulase CELF | 2% (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1% (w/v) |
| Mannitol | 0,75 M |
| CaCl2 | 0,2 mM |
| BSA | 0,1% (w/v) |
| DTT | 0,5 mM |
| W5 lösning | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5,7 | 2 mM |
| MMg lösning | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PEG lösning (nyberedd) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| Mannitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| WI lösning | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Mannitol | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabell 1. Lösningar används för sojabönor protoplast isolering och transformation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll för isolering av sojabönor protoplasts och ansökan till övergående uttryck studier har testats grundligt och fungerar mycket bra i vårt laboratorium. Förfaranden som är enkla och lätta och kräver vanlig utrustning och minsta möjliga kostnad. Våra protokoll ger stora mängder enhetlig, hög kvalitet protoplasts jämfört med tidigare rapporterade metoder34,35,36,37,38. Men eftersom det finns många faktorer som påverkar protoplast avkastning och omvandling priser, rekommenderas det starkt för forskare att optimera villkoren enligt deras experimentella förhållanden, önskvärda resultat och material som används. Detta system är mycket användbart för granskning av omedelbar tillsyn och biokemiska händelser i växtceller, är det inte lämpliga för observation av långsiktiga cellulära processer och händelser som inträffar på vävnad eller organismer nivåer.
Vi fann att urval av kraftigt växande växtmaterial på en idealisk utvecklingsstadiet var den mest avgörande faktorn i sojabönor protoplast preparatet. Den avgör inte bara avkastningen av protoplasts, men kvalitet som påverkar efterföljande DNA omvandlingen. Det är viktigt att alltid odla sojabönor växter i en konstant miljö bort från all stress, såsom torka, översvämningar, extrema temperaturer eller skadedjur. Den högsta protoplast avkastning och förvandling effektiviteten kan uppnås med bara utökade unifoliate bladen från unga plantor. För nybörjare föreslås det att använda unifoliate bladen i olika utvecklingsstadier och göra en jämförelse för att få bästa resultat.
Protoplast/DNA förhållandet är en viktig faktor för optimal förvandling effektivitet. Det är vanligtvis bäst att börja med förhållandet mellan 2 x 104 protoplasts/10-20 µg DNA, men optimering av förhållandet för enskilda konstruktioner rekommenderas25. Användningen av hög kvalitet DNA som erhållits genom en DNA-rening kit rekommenderas starkt.
För valet av vektorer för övergående uttryck i protoplasts är hög-kopia och små vektorer generellt att föredra. Även om binär vektorer för Agrobacterium tumefaciens-medierad omvandling av växter kan användas för protoplast omvandling, den stora storleken av dessa vektorer kan resultera i mindre optimala omvandling effektivitet. För GFP-fusion proteinuttryck använda vi brukar vektorer som inte äger en urval markör för växter och är således relativt små (6-7kb), såsom p2GWF7 och p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Flera vektorer kan användas för att omvandla protoplasts samtidigt. Vi hade framgång i att uttrycka BiFC vektorer för testning protein-protein interaktioner, liksom flera fluorescerande proteiner för organell och subcellulär märkning i sojabönor protoplasts. Dessutom erbjuder enkelhet och stor avkastning av vår metod ett idealiskt system för granskning av reglerings- och biokemiska händelser, gen-targeting vektor design, isolering av övergående uttryckta proteiner och protein komplex och rening av specifika organell som kärnor, möjliggör ytterligare ansökningar till framväxande genomisk och proteomiska strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av programmet växt Genome Research från National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
