Un metodo semplice per l'isolamento di protoplasti di soia e l'applicazione di analisi di espressione genica transitoria
Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo semplice ed efficiente per la preparazione di grandi quantità di protoplasti di soia studiare i complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule vive.
Abstract
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una specie di coltura importante ed è diventato un modello di legumi per gli studi delle vie genetiche e biochimiche. Pertanto, è importante stabilire un sistema di espressione genica transitoria efficiente in soia. Qui, segnaliamo un semplice protocollo per la preparazione dei protoplasti di soia e la sua applicazione per l’analisi funzionale transitorie. Abbiamo trovato che le foglie giovani unifoliate da piantine di soia ha provocato grandi quantità di protoplasti di alta qualità. Grazie all’ottimizzazione di un metodo di trasformazione PEG-calcio-mediata, abbiamo raggiunto l’efficienza di trasformazione alta utilizzando protoplasti unifoliate soia. Questo sistema fornisce un modello efficiente e versatile per l’esame dei complessi meccanismi di regolamentazione e di segnalazione in cellule di soia dal vivo e può aiutare per meglio comprendere diversi processi cellulari, inerente allo sviluppo e fisiologici dei legumi.
Introduction
Protoplasti sono cellule vegetali che hanno rimosse le pareti cellulari. Come mantengono la maggior parte delle caratteristiche e attività di cellule vegetali, protoplasti sono un sistema di buon modello di osservare e valutare diversi eventi cellulari e sono strumenti preziosi per studiare ibridazione somatica1 e impianto di rigenerazione2. Protoplasti sono stati anche ampiamente utilizzati per impianto trasformazione3,4,5, poiché le pareti cellulari altrimenti bloccherebbe il passaggio del DNA nella cellula. Protoplasti possiedono alcune delle risposte fisiologiche e processi cellulari di piante intatte, offrendo quindi un valore fondamentale nella ricerca di base per lo studio di proteine sottocellulari localizzazione6,7,8, interazioni proteina-proteina9,10e promotore attività11,12,13 in cellule vive.
L’isolamento di protoplasti di pianta in primo luogo è stato segnalato nel 196014 e i protocolli per l’isolamento e la trasformazione dei protoplasti sono stati sviluppati e ottimizzati. Una procedura standard di isolamento del protoplasto comporta il taglio delle foglie e la digestione enzimatica delle pareti cellulari, seguita dalla separazione dei protoplasti rilasciati da detriti del tessuto non digerito. Strategie di trasformazione include elettroporazione15,16, microinjection17,18e base di polietilenglicole (PEG)4,5,19 metodi. Una vasta gamma di specie sono stati segnalati successo per l’isolamento di protoplasti, compresi agrumi20, Brassica21, Solanaceae22 e altre piante ornamentali famiglie23,24. Mentre i tipi di tessuti diversi sono utilizzati in varie specie, un sistema di espressione transiente in protoplasti di Arabidopsis mesofillo (TEAMP) isolato dalle foglie della pianta modello Arabidopsis thaliana è stato affermata25 e ampiamente adottato per diverse applicazioni.
Soia (Glycine max (L.) Merr.) è una delle proteine più importanti e olio colture26. A differenza di Arabidopsis e riso, ottenimento di piante di soia transgenica è noto per essere piuttosto difficile e basso rendimento. Agrobacterium tumefaciens-mediata infiltrazione è stato popolarmente utilizzato per studi di espressione transiente in cellule epidermiche in tabacco27 e piantine in Arabidopsis28,29, considerando che Agrobacterium rhizogenes è stato utilizzato per la trasformazione delle radici pelosi in soia30. Approcci di silenziamento genica indotta da virus sono stati utilizzati per downregulation di destinazione geni31,32 e transitori espressione33 in maniera sistematica. Protoplasti forniscono una preziosa e versatile alternativa a questi approcci. Protoplasti possono essere ottenuti da materiali aboveground di soia e consentono l’espressione del transgene rapido e sincronizzato. Tuttavia, poiché l’isolamento iniziale successo dei protoplasti di soia nel 198334, ci sono stati rapporti limitati sull’applicazione dei protoplasti in soia35,36,37, 38, principalmente a causa della relativamente basse rese dei protoplasti di soia.
Qui, descriviamo un protocollo semplice ed efficiente per l’isolamento di protoplasti di soia e la sua applicazione per studi di espressione genica transitoria. Utilizzando foglie giovani unifoliate da piantine di soia, siamo stati in grado di ottenere grandi quantità di protoplasti vitali entro poche ore. Inoltre, abbiamo ottimizzato un metodo di trasformazione di PEG-calcio-mediata che è semplice e a basso costo per trasportare DNA in protoplasti di soia con alta efficienza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo per l’isolamento di protoplasti di soia e l’applicazione di studi di espressione transitoria è stato accuratamente testato e funziona molto bene nel nostro laboratorio. Le procedure sono semplici e facili e richiedono apparecchiature ordinarie e minimo costo. Il nostro protocollo produce grandi quantità di protoplasti di uniforme, di alta qualità rispetto ai metodi precedentemente segnalati34,35,36,</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca del genoma di pianta dalla National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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