Summary
We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.
Abstract
Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een belangrijk gewas soorten en geworden een peulvrucht model voor de studies van genetische en biochemische trajecten. Daarom is het belangrijk om een efficiënte voorbijgaande gen expressie systeem in soja. Wij rapporteren hier een eenvoudig protocol voor de bereiding van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande functionele analyses. We vonden dat de jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen in grote hoeveelheden hoogwaardige protoplasten resulteerde. We bereikt door het optimaliseren van een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode, hoge transformatie efficiëntie met behulp van soja unifoliate protoplasten. Dit systeem biedt een efficiënte en veelzijdige model voor onderzoek van complexe regelgeving en signalering mechanismen in levende soja cellen en kan helpen om beter begrijpen divers cellulaire-, ontwikkelings- en fysiologische processen van peulvruchten.
Introduction
Protoplasten zijn plantaardige cellen waarin celwanden verwijderd. Als ze beweert dat de meeste functies en activiteiten van plantencellen, protoplasten zijn een goed modelsysteem te observeren en evalueren van de verschillende cellulaire gebeurtenissen, en waardevolle hulpmiddelen te bestuderen van somatische hybridisatie1 en regeneratie2plant. Protoplasten hebben ook op grote schaal gebruikt voor plant transformatie3,4,5, aangezien celwanden zou anders het blokkeren van de passage van DNA in de cel. Protoplasten bezitten sommige van de fysiologische reacties en cellulaire processen van intact planten, vandaar het aanbieden van fundamentele waarde bij het basisonderzoek aan studie eiwit subcellular localisatie6,7,8, eiwit-eiwit interacties9,10, en promotor activiteit11,12,13 in levende cellen.
Het isolement van de plant protoplasten werd voor het eerst gemeld in 196014 en de protocollen voor zowel de isolatie en de transformatie van protoplasten zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd. Een standaardprocedure voor isolatie van de protoplast impliceert het uitsnijden van bladeren en enzymatische vertering van celwanden, gevolgd door een scheiding van vrijgegeven protoplasten van niet-verteerde weefsels puin. Transformatie strategieën bevat electroporation15,16, microinjection17,18, en op basis van polyethyleenglycol (PEG)4,5,19 methoden. Een breed scala van soorten hebben gemeld succes voor isolatie van de protoplast, met inbegrip van Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 en andere sierplanten gezinnen23,24. Terwijl verschillende weefseltypes (HLA) worden gebruikt in verschillende soorten, is een stelsel van meningsuiting van de voorbijgaande in Arabidopsis mesophyl protoplast (TEAMP) van de bladeren van de plant model Arabidopsis thaliana geïsoleerd goed ingeburgerd25 en algemeen aangenomen voor uiteenlopende toepassingen.
Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een van de belangrijkste eiwit en olie gewassen26. In tegenstelling tot Arabidopsis en rijst, is verkrijgen van transgene soja planten bekend nogal moeilijk en lage efficiëntie. Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde infiltratie is volksmond gebruikt voor tijdelijke gen expressie studies in de epidermale cellen in tabak27 en zaailingen in Arabidopsis28,29, overwegende dat Agrobacterium rhizogenes is gebruikt voor transformatie van harige wortels in soja30. Virus-geïnduceerde gene silencing benaderingen hebben gebruikt voor Downregulatie van doel genen31,32 en voorbijgaande expressie33 met systemische. Protoplasten vormen een waardevolle en veelzijdig alternatief voor deze benaderingen. Protoplasten kunnen worden verkregen uit sojabonen van bovengrondse materialen en laat snel en gesynchroniseerde transgenic expressie. Echter sinds de eerste succesvolle isolatie van soja protoplasten in de 198334, zijn er beperkt verslagen over de toepassing van protoplasten in soja35,36,,37,, 38, voornamelijk te wijten aan de relatief lage opbrengst voor sojabonen protoplasten.
Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor isolatie van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande gen expressie studies. Met behulp van jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen, konden we krijgen van grote hoeveelheden van vitale protoplasten binnen een paar uur. Daarnaast hebben we een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode die is eenvoudig en low-cost te leveren van DNA in soja protoplasten met hoog rendement geoptimaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. de groei van de planten
- Zaaien 5-10 sojabonen (Williams 82) in een 13 cm pot in de serre omstandigheden lange-dag (16 h licht aan 1.500 µmol m-2 s-1) bij 25 ° C op de bodem van de aangepaste mix voor sojabonen (het 1:1:1 verhouding bodem, perliet en torpedo zand).
2. voorbereiding van de plasmide DNA
- Met behulp van een steriele Pipetteer tip of een tandenstoker, kies een één kolonie of bevroren glycerol voorraad van E. coli die de plasmide met het gen van belang en het in 20 mL Luria Bertani (LB) vloeistof met passende antibiotica in een maatkolf van 50 mL beënten.
- Incubeer de kolf bij 37 ° C's nachts op een shaker. Het verzamelen van de bacteriën door centrifugeren van de opschorting bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en het supernatant te verwijderen. Extraheren en te zuiveren van de plasmide die volgens de procedure van de fabrikant van een plasmide prep kit.
3. isolatie van de protoplast
- Gesneden onlangs uitgebreide unifoliate bladeren van 10 - dagen oude soja zaailingen (Figuur 1).
Opmerking: Selectie van bladeren in een passend stadium van ontwikkeling is de sleutel tot het succes voor soja protoplast voorbereiding. Gebruik alleen net uitgebreid bladeren op vroege ontwikkelingsstadia. Laat volwassen, celwanden worden moeilijker te verteren. - Met een verse scheermesje, de hoofdnerf uit de unifoliate blad en dan knippen de resten in 0,5-1 mm strips te verwijderen.
Opmerking: Twee unifoliate bladeren verteerd in 10 mL enzym oplossing krijgt voldoende protoplasten voor meer dan 10 transformaties. - Met behulp van een paar pincet, overdracht stroken het blad onmiddellijk en zachtjes in 10 mL vers bereide enzym in een tube van 15 mL oplossing (tabel 1). Vacuüm infiltreren het blad strips voor 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer de blad-strips in de enzym-oplossing met zachte agitatie (40 rpm) onder lage licht voor 4-6 uur op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het enzym omslaat naar geel-groen zoals protoplasten zijn vrijgegeven. Controleer de enzym/protoplasten oplossing onder de Microscoop (X10).
Opmerking: De vrijgegeven protoplasten zijn bolvormige vorm, terwijl de onverteerd cellen onregelmatige of ovale vorm hebben. - Breng de 10 mL van enzym/protoplast oplossing in een tube van 50 mL door zachtjes gieten en voeg 10 mL W5 oplossing (tabel 1) bij kamertemperatuur om te stoppen met de spijsvertering. Voorzichtig omkeren de buis een paar keer. Giet voorzichtig het enzym/protoplasten oplossing op een schone 75 µm nylon gaas geplaatst op de top van een tube van 50 mL te verwijderen van de weefsels onverteerd blad.
- Centrifugeer de doorstroming enzym/protoplasten oplossing bij 100 x g in de tube 50 mL voor 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Zachtjes Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van serologische Pipetteer 10 mL zonder verstoring van de protoplast-pellet.
- Resuspendeer de protoplasten en Verdun tot een concentratie van 2 x 105 mL-1 in gekoeld W5 oplossing bij 4 ° C door het tellen van de protoplast nummer op een hemacytometer onder de Microscoop (x10). Houd de protoplasten op ijs gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer de schorsing bij 100 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de W5-oplossing met behulp van een pipet 1 mL zonder verstoring van de protoplast-pellet. Resuspendeer de protoplasten in MMG oplossing (tabel 1) bij een concentratie van 2 x 105 mL-1 bij kamertemperatuur.
4. protoplast transformatie
- Breng 100 µL aliquots van protoplasten (2 x 104 protoplasten op 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL lage wrijvingscoëfficiënt microcentrifuge buizen met behulp van Onbesneden 200 µL Pipetteer tips. Één aliquot opzij zetten om te dienen als negatieve controle. Voeg 10 µL van plasmide (10-20 µg) in elk van de rest hoeveelheid protoplasten.
- Voeg langzaam 110 µL van vers bereide oplossing van de PEG (tabel 1) op de binnenwand van de 1,5 mL microcentrifuge buis, en vervolgens voorzichtig omkeren en draai de buis totdat de oplossing homogeen wordt.
- Incubeer de transformatie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- De transformatie stoppen, langzaam Voeg 400 µL van W5 oplossing aan de buis 1,5 mL bij kamertemperatuur en voorzichtig het omkeren van de buis totdat de oplossing homogeen wordt. Centrifugeer de buis bij 100 g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant met behulp van een precisiepipet.
- Voeg 1 mL WI oplossing (tabel 1) aan de buis en resuspendeer door zachtjes pipetteren 1 - 2 keer. Voeg 1 mL 5% (vol/vol) steriele kalfsserum in elk putje van de plaat van een 6-well weefselkweek coat het oppervlak te voorkomen dat de protoplasten kleven aan de plaat.
- Na een paar seconden, gooi de met behulp van een precisiepipet kalfsserum. Breng de geresuspendeerde protoplasten in een putje van de plaat van de cultuur. De afdekplaat met een deksel.
5. protoplast incubatie en oogsten
- Incubeer de protoplasten bij kamertemperatuur gedurende 1-2 dagen in het donker.
Opmerking: We vonden dat twee dagen incubatie opbrengsten sterker fluorescerende eiwit signaal in het algemeen ten opzichte van eendaagse incubatie, en dat het signaal fluorescent proteïne kan duren voor maximaal 3-4 dagen. - Breng de protoplast-oplossing tot een 1,5 mL koker voor de microcentrifuge van de lage wrijvingscoëfficiënt. Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur te oogsten protoplasten. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet en overdracht van 10 µL protoplasten op een glasplaatje.
- Observeren fluorescent signaal onder fluorescentie- of confocale microscopie. Gebruik niet-getransformeerd protoplasten als negatieve controle (geen signaal moet worden nageleefd).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillende organen van het 10 - dagen oude sojabonen werden getest voor protoplast voorbereiding (Figuur 1) en de opbrengsten werden waargenomen onder de Microscoop (Figuur 2). Celwanden van hypocotyl en epicotyl werden nauwelijks verteerd, en sommige cellen bleef vasthouden aan elkaar (figuur 2B, 2 C). In zaadlob (figuur 2D) en wortel (figuur 2A), werden de celwanden alleen in een klein deel van de cellen verwijderd. In tegenstelling, een groot aantal protoplasten werden waargenomen toen unifoliate gebruikt (figuur 2E-G). Unifoliate bladeren in verschillende ontwikkelingsstadia waren verder onderzocht (Figuur 2 H). Terwijl zowel de decomprimeren en net uitgebreid unifoliate bladeren resulteerde in hoge opbrengsten van protoplasten, de grootte van protoplasten uit de zojuist uitgebreide unifoliate werden meer uniform (figuur 2F) dan de decomprimeren unifoliate (figuur 2E). Voor het volledig uitgevouwen unifoliate, de celwanden waren nog intact in de meeste van de cellen (Figuur 2 g). We celwand-spijsvertering enzymen uit drie verschillende fabrikanten getest en vergelijkbare resultaten verkregen, zoals hierboven beschreven. Op basis van deze opmerkingen, wij geconcludeerd dat selectie van plantaardig materiaal een cruciale factor was en dat alleen uitgebreide unifoliate bladeren van jonge sojabonen zaailingen het beste materiaal voor de voorbereiding van de protoplast waren.
Een scala aan verschillende hoeveelheden plasmide DNA (0,1 µg, 1 microgram, 5 µg en 20 µg) werd getest voor optimale transformatie efficiëntie van soja unifoliate protoplasten (figuur 3A-D). 20 µg plasmide DNA toonde de hoogste efficiëntie van de transformatie met meer dan 50% transformatie tarief (figuur 3D), terwijl 0,1 µg de laagste toonde (minder dan 1%) (Figuur 3A). Wij verkregen vergelijkbare transformatie efficiëntie met behulp van verschillende DNA reiniging kits van drie fabrikanten. Dit resultaat wijst erop dat grotere hoeveelheden plasmide DNA enorm helpen zou de transformatie-efficiëntie te verhogen.
Figuur 4 is confocal beelden van soja protoplasten getransformeerd met construct p2GWF7-E1, die GFP gesmolten tot de peulvruchten-specifieke gen E1 (Glyma.06G207800) uitdrukt, aangedreven door de CaMV 35S promotor in de vector p2GWF7 39. E1-GFP fusieproteïne toont nucleaire localisatie in soja protoplasten, die strookt met een eerdere studie met de Arabidopsis protoplast systeem40. Gezien het feit dat E1 een peulvrucht-specifieke gen is, biedt ons resultaat met behulp van het systeem van de protoplast soja een overtuigend inzicht in de subcellular localisatie van E1 eiwit.
Figuur 1. Illustratie van de organen van een zaailing van de soja die zijn getest voor de voorbereiding van de protoplast in deze studie, met inbegrip van root, hypocotyl, zaadlob, epicotyl en unifoliate. Na een paar unifoliate bladeren ontwikkelen zaailingen van soja drievoudige bladeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Protoplast cellen, bereid uit verschillende organen en ontwikkelingsstadia van soja zaailingen. (A-D) Cellen, bereid uit verschillende organen van 10 - dagen oude soja zaailingen: wortel (B), hypocotyl (B), epicotyl (C), zaadlob (D). (E-G) Protoplast cellen, bereid uit unifoliate bladeren in verschillende ontwikkelingsstadia: decomprimeren (E), (F) gewoon te uitgebreid en volledig uitgevouwen (G) unifoliate, overeenkomt met de zaailingen van de soja in (H) links, Midden en rechts, respectievelijk. De bar van de schaal is 25 µm (A-G) of 25 mm (H). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Confocale afbeeldingen tonen transformatie efficiëntie van soja unifoliate protoplasten met verschillende hoeveelheden plasmide DNA. Beelden van GFP (afgebeeld in groen) en helder veld (grijs) worden samengevoegd. Protoplasten werden omgevormd met verschillende hoeveelheden van de plasmide p2GWF7-E1: 0,1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) en 20 µg (D). Fluorescentie signaal van GFP werd 24 uur na de transformatie onder microscopie gecontroleerd. De zwarte schaal bar is 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Confocale afbeeldingen tonen de subcellular localisatie van E1-GFP in de kern van soja unifoliate protoplasten. Het plasmide p2GWF7-E1 werd gebruikt voor transformatie. Beelden van GFP (afgebeeld in groen) en helder veld (grijs) worden samengevoegd. Fluorescentie signaal van GFP werd bewaakt 24 uur na de transformatie. De zwarte schaal bar is 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Enzym-oplossing (vers bereid) | |
| MES, pH 5.7 | 20mM |
| Cellulase CELF | 2% (g/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1% (g/v) |
| Mannitol | 0.75 M |
| CaCl2 | 0.2 mM |
| BSA | 0,1% (g/v) |
| DTT | 0.5 mM |
| W5 oplossing | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| MMg oplossing | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PEG-oplossing (vers bereid) | |
| PEG4000 | 20% (m/v) |
| Mannitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| WI oplossing | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitol | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabel 1. Oplossingen gebruikt voor soja protoplast isolatie en transformatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol voor de isolatie van soja protoplasten en de toepassing op voorbijgaande expressie studies grondig is getest en werkt zeer goed in ons laboratorium. De procedures zijn eenvoudig en gemakkelijk en vereisen gewone apparatuur en minimale kosten. Ons protocol levert grote hoeveelheden van uniforme, hoge kwaliteit protoplasten in vergelijking met de eerder gemelde methoden34,35,,36,,37,38. Echter, aangezien er vele factoren die invloed hebben op de protoplast opbrengsten en transformatie tarieven, het is sterk aanbevolen voor onderzoekers te optimaliseren de voorwaarden volgens hun experimentele omstandigheden, de gewenste resultaten en de gebruikte materialen. Terwijl dit systeem zeer nuttig zijn voor onderzoek van onmiddellijke regelgevings- en biochemische gebeurtenissen in plantencellen is, is het niet geschikt zijn voor waarneming van lange termijn cellulaire processen en gebeurtenissen die zich bij weefsel of organisch niveaus voordoen.
We vonden dat selectie van krachtig groeiende plantaardig materiaal in een ideale developmental stadium de meest cruciale factor bij de voorbereiding van de protoplast soja was. Het bepaalt niet alleen de opbrengsten van protoplasten, maar kwaliteit die van invloed is op de verdere transformatie van DNA. Het is belangrijk om altijd soja planten groeien in een voortdurende omgeving weg van alle stress, zoals droogte, overstromingen, extreme temperaturen of ongedierte. De hoogste protoplast opbrengst en transformatie efficiëntie kan worden bereikt met behulp van de zojuist uitgebreide unifoliate bladeren van jonge zaailingen. Voor beginners, wordt voorgesteld om het gebruik van unifoliate bladeren op verschillende ontwikkelingsstadia en maak een vergelijking om de beste resultaten te verkrijgen.
Protoplast/DNA verhouding is een belangrijke factor voor optimale transformatie efficiëntie. Het is meestal het beste om te beginnen met de verhouding van 2 x 104 protoplasten/10-20 µg DNA, maar de optimalisatie van de verhouding voor individuele constructies25wordt aanbevolen. Het gebruik van hoge kwaliteit DNA verkregen door een DNA zuivering kit is sterk aanbevolen.
Voor de keuze van vectoren voor voorbijgaande expressie in protoplasten zijn hoge-exemplaaraantal en kleine vectoren over het algemeen de voorkeur. Hoewel de binaire vectoren voor Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie van planten kan worden gebruikt voor protoplast transformatie, de grote omvang van deze vectoren kan resulteren in minder optimale transformatie-efficiëntie. Voor GFP-fusion eiwit expressie gebruiken we meestal de vectoren die niet beschikken over een selectie marker voor planten en zijn dus relatief klein (6-7kb), zoals p2GWF7 en p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Meerdere vectoren kunnen worden gebruikt om te transformeren van protoplasten gelijktijdig. We hadden succes bij het uiten van BiFC vectoren voor het testen van eiwit-eiwitinteractie, evenals meerdere fluorescente proteïnen voor organel en subcellular labelen in soja protoplasten. Eenvoud en grote opbrengsten van onze methode biedt bovendien een ideaal systeem voor onderzoek van de regelgevings- en biochemische gebeurtenissen, gentargeting vector design, isolatie van Transient uitgedrukte proteïnen en eiwit complex en zuivering van specifieke organel zoals kernen, waardoor verdere toepassingen kunnen opkomende genomic en proteomic benadert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Plant Genome Research Program van de National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
