Summary
Vi utviklet en enkel og effektiv protokoll for utarbeidelse av store mengder soyabønner protoplasts å studere komplekse regulatoriske og signalnettverk mekanismer i levende celler.
Abstract
Soyabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en viktig avling og har blitt en legume modell for studier av genetiske og biokjemiske. Derfor er det viktig å etablere en effektiv forbigående gene expression system i soyabønner. Her rapporterer vi en enkel protokoll for utarbeidelse av soyabønner protoplasts og programmet for forbigående funksjonelle analyser. Vi fant at unge unifoliate blader fra soybean frøplanter resulterte i store mengder av høykvalitets protoplasts. Ved å optimalisere en PEG-kalsium-mediert transformasjon metoden, oppnådd vi høye transformasjon effektivitet ved hjelp soyabønner unifoliate protoplasts. Dette systemet gir en effektiv og allsidig modell for undersøkelse av komplekse regulatoriske og signalnettverk mekanismer i live soyabønner celler og kan bidra til å bedre forstå ulike mobilnettet, utviklingsmessige og fysiologiske prosesser av belgfrukter.
Introduction
Protoplasts er anlegget celler som har cellevegger fjernet. De vedlikeholde det meste av funksjoner og aktiviteter i anlegget celler, protoplasts er en god modell å observere og vurdere ulike mobilnettet arrangementer, og er verdifulle verktøy å studere somatisk hybridiseringen1 og plante gjenfødelse2. Protoplasts har vært også mye benyttet for plante transformasjon3,4,5, siden cellevegger ellers blokkere passasjen av DNA i cellen. Protoplasts har noen av de fysiologiske responser og cellulære prosesser intakt planter, derfor tilbyr grunnleggende verdien i grunnleggende forskning til å studere subcellular protein lokalisering6,7,8, Protein-protein interaksjoner9,10og promoter aktivitet11,12,13 i lever celler.
Isolasjon av anlegget protoplasts ble først rapportert i 196014 og protokollene for både isolasjon og transformasjonen av protoplasts er utviklet og optimalisert. En standard prosedyre protoplast isolasjon innebærer skjæring av blader og enzymatiske fordøyelsen av cellevegger, etterfulgt av separasjon av utgitt protoplasts fra ikke-fordøyd vev rusk. Transformasjon strategier inkluderer electroporation15,16, microinjection17,18og polyetylenglykol-basert (PEG)4,5,19 metoder. En rekke arter har rapportert vellykket for protoplast isolasjon, inkludert sitrus20, Brassica21, Solanaceae22 og andre dekorative plant familier23,24. Mens ulike vev brukes i ulike arter, er et system av forbigående uttrykk i Arabidopsis mesophyll protoplast (TEAMP) isolert fra bladene av modellen anlegget Arabidopsis thaliana godt etablert25 og vidt vedtatt å forskjellige programmer.
Soyabønner (Glycine max (L.) Merr.) er en av de viktigste protein og olje avlinger26. I motsetning Arabidopsis og ris, er skaffe transgene soyabønner planter kjent for å være ganske vanskelig og lav effektivitet. Agrobacterium tumefaciens-mediert infiltrasjon har blitt populært brukt for forbigående gene expression studier i epidermal cellene i tobakk27 og planter i Arabidopsis28,29, mens Agrobacterium rhizogenes har blitt brukt for transformasjon av hårete røtter i soyabønner30. Forårsaket av virus genet stanse tilnærminger har blitt benyttet for downregulation målet gener31,32 og forbigående uttrykk33 i en systemisk måte. Protoplasts gir en verdifull og allsidig alternativ til disse tilnærmingene. Protoplasts kan fås fra soyabønner aboveground materialer og tillate rask og synkronisert transgene uttrykk. Men siden den første vellykkede isolering av soyabønner protoplasts i 198334, har det vært begrenset rapporter på anvendelse av protoplasts i soyabønner35,36,37, 38, hovedsakelig på grunn av relativt lav avkastning på soyabønner protoplasts.
Her beskriver vi en enkel og effektiv protokoll for isolering av soyabønner protoplasts og programmet for forbigående gene expression studier. Bruker unge unifoliate blader fra soybean frøplanter, kunne vi få store mengder av avgjørende protoplasts i noen timer. Dessuten, har vi optimalisert en PEG-kalsium-mediert transformasjon metode som er enkelt og rimelig å levere DNA i soyabønner protoplasts med høy effektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vekst av planter
- Så 5-10 soyabønner frø (Williams 82) i en 13 cm pott i drivhuset under lange dager forhold (16 h lys på 1500 µmol m-2 s-1) ved 25 ° C på egendefinerte jord blanding for soyabønner (1:1:1 ratio med jord, perlitt og torpedo sand).
2. utarbeidelse av plasmider DNA
- Bruke et sterilt pipette tips eller tannpirker, Velg en enkelt koloni eller frosne glyserol lager av E. coli bærer plasmider inneholder genet av interesse og vaksinere det i 20 mL Luria-Bertani (LB) flytende medium med aktuelle antibiotika i en 50 mL kolbe.
- Inkuber kolbe på 37 ° C over natten på en shaker. Samle bakterier ved sentrifugering suspensjon på 12.000 x g ved romtemperatur for 5 min og forkaster nedbryting. Ekstra og rense plasmider produsentens fremgangsmåten av en plasmider prep kit.
3. protoplast isolasjon
- Kuttet nylig utvidet unifoliate blader fra 10 - dagers gammel soybean frøplanter (figur 1).
Merk: Utvalg av bladene på en passende utviklingsstadiet er nøkkelen til suksess for soyabønner protoplast forberedelse. Bare bruke bare utvidet blader på tidlig i utviklingen etapper. Som forlater modne, bli cellevegger vanskeligere for å fordøye. - Med en frisk barberblad, fjerne midrib fra unifoliate blad og kuttet restene i 0,5-1 mm strimler.
Merk: To unifoliate blader fordøyd i 10 mL enzym løsningen vil gi tilstrekkelig protoplasts for mer enn 10 transformasjoner. - Bladet med en tang, overføring og strimler umiddelbart og forsiktig inn 10 mL av nylagde enzym løsning (tabell 1) i en 15 mL tube. Vakuum infiltrere bladet strimler i 15 min ved romtemperatur.
- Inkuber blad strimler av enzymet løsningen med mild agitasjon (40 rpm) under dårlig lys for 4-6 h ved romtemperatur. Kontroller at enzymet løsningen blir gul-grønn som protoplasts utgis. Sjekk enzym/protoplasts løsningen under mikroskopet (X10).
Merk: De utgitt protoplasts er sfærisk formet, mens ufordøyd cellene har uregelmessig eller oval form. - Overfør 10 mL av enzymet/protoplast løsning i en 50 mL tube av forsiktig helle og legge 10 mL U5 løsning (tabell 1) ved romtemperatur å stoppe fordøyelsen. Forsiktig Inverter røret noen ganger. Hell forsiktig enzym/protoplasts løsningen på en ren 75 µm nylon maske plasseres over en 50 mL tube fjerne ufordøyd blad vev.
- Sentrifuge gjennomflytsenhet enzym/protoplasts løsningen på 100 x g i 50 mL tube i 1-2 min ved romtemperatur. Fjern nedbryting bruker en 10 mL serologisk pipette uten å forstyrre protoplast pellets.
- Resuspend protoplasts og fortynne til en konsentrasjon av 2 x 105 mL-1 i kjølt U5 løsning på 4 ° C ved å telle protoplast nummer på en hemacytometer under mikroskopet (x10). Hold protoplasts på is 30 min.
- Sentrifuge suspensjon 100 x g i 1-2 min ved romtemperatur og forsiktig fjerne U5 løsning ved hjelp av en 1 mL pipette uten å forstyrre protoplast pellets. Resuspend protoplasts i MMG løsning (tabell 1) i en konsentrasjon av 2 x 105 mL-1 ved romtemperatur.
4. protoplast transformasjon
- Gjøre 100 µL dele protoplasts (2 x 104 protoplasts på 2 x 105 mL-1) i 1,5 mL lav vedheft microcentrifuge rør med uncut 200 µL pipette-spisser. Sette en aliquot til side for å tjene som negativ kontroll. Legge til 10 µL av plasmider (10-20 µg) i hver av resten aliquot av protoplasts.
- Sakte legge 110 µL av nylagde PEG løsning (tabell 1) på den indre veggen i 1,5 mL microcentrifuge røret, og deretter inverterer du forsiktig og rotere røret til løsningen blir homogen.
- Inkuber transformasjon blandingen i romtemperatur i 15 min.
- Stoppe transformasjon, sakte legger 400 µL U5 løsning til 1,5 mL røret ved romtemperatur og forsiktig Inverter røret til løsningen blir homogen. Sentrifuge røret 100 g i 1-2 min ved romtemperatur og kast nedbryting bruker en pipette.
- Legg 1 mL av WI løsning (tabell 1) til røret og resuspend av forsiktig pipettering 1 - 2 ganger. Legge 1 mL av 5% (vol/vol) sterilt kalv serum i hver brønn av en 6-og vev kultur plate å coat overflaten og forhindre protoplasts stikker til platen.
- Etter noen sekunder, kan du forkaste kalv serum bruker en pipette. Overføre resuspended protoplasts inn i en brønn på kultur plate. Dekk platen med lokk.
5. protoplast inkubasjon og høsting
- Inkuber protoplasts ved romtemperatur for 1-2 dager i mørket.
Merk: Vi fant at to dagers inkubasjon gir sterkere fluorescerende protein signal i forhold til dag incubation, og at fluorescerende protein signalet kan vare opp til 3-4 dager. - Overføre protoplast løsningen til en 1,5 mL lav vedheft microcentrifuge tube. Sentrifuge røret 100 x g i 1-2 min ved romtemperatur å høste protoplasts. Fjern nedbryting bruker en pipette og overføre 10 µL protoplasts på et glass lysbilde.
- Observere fluorescerende signal under fluorescens eller AC confocal mikroskopi. Bruk ikke-transformert protoplasts som negativ kontroll (ingen signal bør overholdes).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ulike organer av 10 - dagers gammel soyabønner ble testet for protoplast forberedelse (figur 1) og gir ble observert under mikroskopet (figur 2). Cellevegger fra hypocotyl og epicotyl var knapt fordøyd, og noen celler ble festet til hverandre (figur 2B, 2 C). I cotyledon (figur 2D) og roten (figur 2A), ble cellevegger fjernet i en liten del av cellene. I kontrast, et stort antall protoplasts ble observert når unifoliate ble brukt (figur 2E-G). Unifoliate blader på ulike utviklingsstadier var videre undersøkt (figur 2 H). Mens både ut og bare utvidet unifoliate bladene resulterte i høy avkastning av protoplasts, størrelsen på protoplasts fra den bare utvidede unifoliate var mer uniform (figur 2F) enn den ut unifoliate (figur 2E). For de fullt utvidet unifoliate, cellen vegger var fortsatt intakt i de fleste cellene (figur 2 g). Vi testet celleveggen-fordøyelsen enzymer fra tre forskjellige produsenter og fikk sammenlignbare resultater som beskrevet ovenfor. Basert på disse observasjonene, vi konkluderte med at utvalg av plantemateriale var en avgjørende faktor og at bare utvidet unifoliate blader fra unge soybean frøplanter var det beste materialet for protoplast forberedelse.
En rekke ulike mengder plasmider DNA (0,1 µg, 1 µg, 5 µg og 20 µg) ble testet for optimal transformasjon effektiviteten av soyabønner unifoliate protoplasts (figur 3A-D). 20 µg plasmider DNA viste høyeste transformasjon effektivitet med mer enn 50% transformasjon rate (figur 3D), mens 0,1 µg viste den laveste verdien (mindre enn 1%) (Figur 3A). Vi fikk sammenlignbare transformasjon effektivitet med forskjellige DNA rensing kits fra tre produsenter. Dette resultatet antyder at større mengder plasmider DNA vil sterkt bidra til å effektivisere transformasjon.
Figur 4 er AC confocal bilder av soyabønner protoplasts forvandlet konstruere p2GWF7-E1, som uttrykker GFP del Belgfrukt-spesifikke genet E1 (Glyma.06G207800), drevet av CaMV 35S selskapet i vektor-p2GWF7 39. E1-GFP fusion protein viser kjernefysiske lokalisering i soyabønner protoplasts, som er i samsvar med en tidligere studie med Arabidopsis protoplast system40. Gitt at E1 er en legume-spesifikke genet, gir vår resultatet ved hjelp av soyabønner protoplast systemet en avgjørende innsikt i den subcellular lokaliseringen E1 protein.
Figur 1. Illustrasjonen viser organer i en Soyabønne frøplante som testes for protoplast forberedelse i denne studien, inkludert rot, hypocotyl, cotyledon, epicotyl og unifoliate. Etter et par unifoliate blader utvikle soybean frøplanter trifoliate blader. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Protoplast celler ulike organer og utviklingsstadier av soybean frøplanter. (A-D) Celler forberedt fra ulike organer av 10 - dagers gammel soybean frøplanter: root (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), cotyledon (D). (E-G) Protoplast celler forberedt unifoliate blader på ulike utviklingsmessige stadier: skjult (E), nettopp utvidet (F) og fullstendig utvidet (G) unifoliate, tilsvarende soybean frøplanter i (H) på venstre, midtre og høyre, henholdsvis. Skala baren er 25 µm (AG) eller 25 mm (H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. AC confocal bilder viser transformasjon effektiviteten av soyabønner unifoliate protoplasts med ulike mengder plasmider DNA. Bilder av GFP (representert i grønt) og lys feltet (grå) flettes. Protoplasts ble forvandlet med ulike mengder plasmider p2GWF7-E1: 0,1 µg (A), 1 µg (B), 5 µg (C) og 20 µg (D). Fluorescens signal av GFP var overvåket 24 timer etter transformasjon under mikroskopi. Svart skala baren er 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. AC confocal bilder viser den subcellular lokaliseringen av E1-GFP i kjernen av soyabønner unifoliate protoplasts. Plasmider p2GWF7-E1 ble brukt for transformasjon. Bilder av GFP (representert i grønt) og lys feltet (grå) flettes. Fluorescens signal av GFP var overvåket 24 timer etter transformasjon. Svart skala baren er 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Enzym løsning (nylagde) | |
| MES, pH 5.7 | 20mM |
| Cellulase CELF | 2% (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1% (w/v) |
| Mannitol | 0,75 M |
| CaCl2 | 0.2 mM |
| BSA | 0,1% (w/v) |
| DTT | 0,5 mM |
| U5 løsning | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| MMg løsning | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| PEG løsning (nylagde) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| Mannitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| WI løsning | |
| MES, pH 5.7 | 4 mM |
| Mannitol | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabell 1. Løsninger for soyabønner protoplast isolasjon og transformasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen for isolering av soyabønner protoplasts og programmet forbigående uttrykk studier har blitt grundig testet og fungerer godt i vårt laboratorium. Fremgangsmåten er enkel og lett og krever vanlig utstyr og minimale kostnader. Våre protokollen gir store mengder ensartet, høy kvalitet protoplasts i forhold til tidligere rapportert metoder,34,,35,,36,,37,,38. Men siden det er mange faktorer som påvirker protoplast avkastning og transformasjon priser, anbefales for forskere å optimalisere betingelsene etter deres eksperimentelle forhold, ønskelig resultater og materialer. Dette systemet er svært nyttig for undersøkelse av umiddelbar regulatoriske og biokjemiske hendelser i anlegget celler, er det ikke egnet for observasjon av langsiktig cellulære prosesser og hendelser som forekommer på vev eller organismebiologi nivåer.
Vi fant at utvalg av kraftig økende plantemateriale i en ideell utviklingsstadiet var den mest avgjørende faktoren for soyabønner protoplast utarbeidelse. Bestemmer ikke bare gir protoplasts, men kvalitet som påvirker den påfølgende DNA-transformasjonen. Det er viktig å alltid vokse soyabønner planter i et konstant miljø borte fra alle stress, slik som tørke, flom, ekstreme temperaturer eller skadedyr. Høyeste protoplast avkastning og transformasjon effektiviteten oppnås ved hjelp av bare utvidet unifoliate blader fra unge frøplanter. For nybegynnere, er det foreslått å bruke unifoliate blader på ulike utviklingsmessige stadier og gjøre en sammenligning å få de beste resultatene.
Protoplast/DNA er en viktig faktor for optimal transformasjon effektivitet. Det er vanligvis best å starte med forholdet mellom 2 x 104 protoplasts/10-20 µg DNA, men optimalisering av proporsjonen for enkelte konstruksjoner anbefales25. Bruk av høykvalitets DNA ved en DNA rensing kit anbefales.
For valg av vektorer for forbigående uttrykk i protoplasts er antall høy-kopier og lite vektorer generelt foretrukket. Selv om binær vektorer for Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon av planter kan brukes for protoplast transformasjon, den store størrelsen på disse vektorer kan resultere i mindre optimal transformasjon effektivitet. For GFP-fusion protein uttrykk bruker vi vanligvis vektorer som ikke har en utvalgsmarkøren for planter og er dermed relativt liten (6-7kb), som p2GWF7 og p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Flere vektorer kan brukes til å transformere protoplasts samtidig. Vi har hatt suksess i å uttrykke BiFC vektorer for testing protein-protein interaksjoner, samt flere fluorescerende proteiner organeller og subcellular merking i soyabønner protoplasts. Videre tilbyr enkelhet og stor avkastning av vår metode et ideelt system for undersøkelse av regulatoriske og biokjemiske hendelser, gene målretting vektor design, isolering av transiently uttrykt proteiner og protein kompleks og rensing av spesifikke organelle som kjerner, slik at ytterligere programmer til nye genomisk og proteomic tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av anlegget Genome Research Program fra National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
- Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
- Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
- Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
- Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
- Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
- Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
- Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
- Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16 (2009).
- Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
- Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
- Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
- Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
- Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
- Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
- Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
- Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
- Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
- Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
- Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
- Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
- Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
- Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14 (2012).
- Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565 (2007).
- Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
- Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
- Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
- Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19 (2014).
- Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
- Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
- Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
- Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
- Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
- Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
- Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129 (2011).
- Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
- Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342 (2015).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).
