Summary
我々 は生きているセルで複雑な規制とシグナル伝達メカニズムを研究するダイズプロトプ ラストの大量の準備のためシンプルで効率的なプロトコルを開発しました。
Abstract
大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) は重要な作物を遺伝学的、生化学的経路の研究マメ科のモデルとなっています。そのため、大豆の効率的な一過的遺伝子発現系を確立することが重要です。ダイズプロトプ ラストの準備のための単純なプロトコルと非定常の機能解析への応用を報告します。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉が高品質のプロトプ ラストの大量に起因したと分かった。ペグ カルシウム仲介された変形方法を最適化することにより、大豆含むプロトプ ラストを用いた高い変換効率を達成しました。このシステムは、ライブ ダイズ細胞における複雑な規制とシグナル伝達メカニズムの検討の効率的かつ汎用性の高いモデルを提供し、ヘルプは、マメ科植物の多様な細胞・発達・生理学的なプロセスを理解するかもしれない。
Introduction
プロトプ ラストは、削除される細胞壁を持つ植物細胞です。機能のほとんどは、植物細胞の活動を管理するのでプロトプ ラスト観察・多様な携帯電話イベントを評価する良いモデル系、1体の交配を研究し、植物の再生2する貴重なツールです。プロトプ ラストは、細胞壁がブロックされセルに DNA の通過以来工場変換3,4、5、また広く利用されています。プロトプ ラストは生理学的な応答のいくつか、したがって細胞内タンパク質局在6,7、8を研究する基礎研究の基本的な値を提供して、そのまま植物の細胞プロセスを所有しています。蛋白質蛋白質の相互作用の9,10、プロモーター活動11,12,13ではセルを住んでいます。
196014で最初に報告された植物プロトプ ラストの分離と分離とプロトプ ラストの変形のためのプロトコルを開発し、最適化します。葉の切断と非消化組織破片からリリースされた原形質体の分離に続いて、細胞壁の酵素消化、原形質体の隔離の標準的な手順が含まれます。エレクトロポレーション15,16、マイクロインジェクション17,18、およびポリエチレング リコール (PEG)4,5,19手法変革戦略が含まれています。種の広い範囲は、原形質体の隔離、柑橘類20、アブラナ科21、ナス科22その他の観賞用植物家族23,24を含む成功報告されています。モデル植物シロイヌナズナの葉から分離したシロイヌナズナ葉肉プロトプ ラスト (TEAMP) に一過性発現系が確立した25をされている様々 な種では、多様な組織型が使用されて、多様なアプリケーションに広く採用されています。
大豆 (最高グリシン(l.)ダイズ) 最も重要なタンパク質の 1 つで、油作物26。異なり、シロイヌナズナイネ、遺伝子組み換え大豆の植物を得ることはむしろ困難と低効率に知られています。アグロバクテリウム-仲介された浸潤一般に使用されているタバコ27で表皮細胞およびシロイヌナズナ28,29, 苗の一時的な遺伝子発現研究に対しサツマイモネコブセンチュウは大豆30植物毛状根の変形のために使用されています。ウイルス誘導性遺伝子のサイレンシング アプローチは、ターゲット遺伝子の31,32と過渡式の33のダウンレギュレーションを系統的に利用されています。プロトプ ラストは、貴重な汎用性の高いこれらのアプローチ方法を提供します。プロトプ ラストは大豆の地上材料から得ることが、発現の迅速かつ同期ができます。しかし、1983年34ダイズプロトプ ラストの最初の成功した分離以来報告されている限られた大豆35,36,37,プロトプ ラストの応用38、主にダイズプロトプ ラストの比較的低い収穫のため。
ここでは、ダイズプロトプ ラストの分離のためのシンプルで効率的なプロトコルと一時的な遺伝子発現研究への応用について述べる。ダイズ芽ばえから若い単葉の葉を使用すると、数時間以内の重要なプロトプ ラストの大量を取得することができました。さらに、ペグによるカルシウムの変換法はシンプルで高効率で大豆プロトプ ラストに DNA を提供する低コストを最適化しています。
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Protocol
1. 植物の成長
- 大豆の 5-10 ダイズ種子 (ウィリアムズ 82) 長日条件 (16 h 1,500 µmol m-2の-1光) カスタム土壌ミックスの 25 ° c の下で温室で 13 cm ポットに種をまく (、1: 土、パーライト、魚雷の砂の比率 1:1)。
2. DNA のプラスミッドの準備
- 滅菌ピペット チップやつまようじを使用すると、単一コロニーを大腸菌興味の遺伝子を含んでいるプラスミッドを運ぶ冷凍グリセロール ストックを選ぶし、20 mL ルリア ベルターニカミラ (LB) 液体培地 50 mL のフラスコに適切な抗生物質で予防接種します。
- シェーカーで一晩 37 ° C でフラスコを孵化させなさい。5 分間室温で 12,000 × g の懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄して細菌を収集します。抽出・精製プラスミド プラスミド準備キットの製造元の手順を実行します。
3. プロトプ ラスト単離
- 10 日間の古い大豆苗 (図 1) から新しく拡張された単葉の葉をカットします。
注: 適切な発達段階で葉の選択は大豆プロトプ ラスト調製成功への鍵です。初期の発達段階で展開直後の葉だけ使用します。成熟した葉、消化する細胞壁と難しくなってください。 - 新鮮なかみそりの刃を含む葉と 0.5-1 に残る mm ストリップ、カットから主脈を削除します。
注: 2 つの単葉の葉 10 mL の酵素液で消化は以上 10 変換のため十分なプロトプ ラストを与えます。 - 葉が 10 mL を 15 mL チューブに作りたての酵素液 (表 1) にすぐにそして軽くをストリップ鉗子、転送のペアを使用しています。真空潜入葉ストリップ部屋の温度で 15 分。
- 室温で 4-6 h の低照度下で穏やかな攪拌 (40 回転) と酵素液で葉の細片を孵化させなさい。プロトプ ラストがリリースされると、酵素液が黄色緑を回すことを確認します。(X10) 顕微鏡下で酵素/プロトプ ラスト ソリューションを確認してください。
注: リリースのプロトプ ラストは球状形、未消化の細胞が不規則なまたは楕円形です。 - そっとして 50 mL のチューブで酵素/プロトプ ラスト溶液 10 mL を転送し、消化を停止するために室温 W5 溶液 (表 1) 10 mL を追加します。穏やかに数回チューブを反転します。未消化の葉身を削除する 50 mL のチューブの上に置かれたきれいな 75 μ m ナイロン メッシュに酵素/プロトプ ラストの溶液を注ぐ穏やか。
- 室温で 1-2 分の 50 mL のチューブで 100 x g でプロトプ ラスト酵素/フロースルー ソリューションを遠心します。プロトプ ラストのペレットを乱すことがなく 10 mL の血清ピペットを使用して上清を慎重に取り外します。
- プロトプ ラストを再懸濁し、プロトプ ラスト (x10) 顕微鏡で血球の数を数えることによって 2 x 105 mL-1 4 ° C に冷やした W5 ソリューションでの濃度に希釈します。30 分間氷の上プロトプ ラストをしてください。
- 室温で 1-2 分の 100 x グラムの懸濁液を遠心し、原形質体の餌を乱すことがなく 1 mL ピペットを使用した W5 ソリューションを慎重に取り外します。室温で 2 x 105 mL-1濃度で MMG 解決方法 (表 1) プロトプ ラストを再懸濁します。
4. プロトプ ラスト
- プロトプ ラスト (2 x 104プロトプ ラスト 2 x 105 mL-1) の 100 μ 因数は 1.5 mL 低接着マイクロ遠心チューブ用ノーカット 200 μ L ピペット チップを使用してします。ネガティブ コントロールとして機能する 1 つの因数脇を置きます。プロトプ ラストの残りの因数のそれぞれにプラスミド (10-20 μ g) の 10 μ L を追加します。
- ゆっくり 1.5 mL 遠心チューブの内壁に作りたての止め釘の解決 (表 1) の 110 μ L を追加し、軽く反転ソリューションが均質になるまでチューブを回転させてください。
- 15 分間室温で変換の混合物を孵化させなさい。
- 変換を停止するには、ゆっくりと室温で 1.5 mL チューブに W5 ソリューションの 400 μ L を追加し、ソリューションが均一になるまでやさしくチューブを転倒させます。室温で 1-2 分の 100 g でチューブを遠心分離、ピペットを使用して上澄みを廃棄します。
- チューブに無線ソリューション (表 1) の 1 つの mL を追加し、1-2 回を軽くピペッティングによって再懸濁します。表面をコートし、プロトプ ラストが板にくっつかないように 6 ウェル培養プレートの各ウェルに 5% (巻/巻) 滅菌子牛血清 1 mL を追加します。
- 数秒後、ピペットを使用して子牛血清を破棄します。再懸濁のプロトプ ラスト培養プレートのウェルに移転します。蓋付きプレートをカバーします。
5. プロトプ ラストの培養と収穫
- 暗闇の中で 1-2 日間室温でプロトプ ラストを孵化させなさい。
注: 1 日培養に比べて一般に強い蛍光蛋白質信号を 2 日間培養に利回りし、蛍光蛋白質信号が 3-4 日間続く可能性がありますがわかった。 - プロトプ ラストのソリューションを 1.5 mL の低接着微量遠心チューブに転送します。プロトプ ラストを収穫するために室温で 1-2 分の 100 x g でチューブを遠心します。ピペットを使用して上清を除去し、スライド ガラスに 10 μ L プロトプ ラストを転送します。
- 蛍光共焦点顕微鏡又は蛍光信号を観察します。(信号を守らなければなりませんない) 陰性対照として非変形プロトプ ラストを使用します。
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Representative Results
プロトプ ラストの調製 (図 1) を 10 日間の古い大豆のさまざまな器官を調べた (図 2) 顕微鏡下では認められなかった.胚軸, 上胚軸から細胞壁がほとんど消化して、そしていくつかの細胞 (図 2 b, 2 C) 互いに接続されています。子葉 (図 2 D) とルート (図 2 a) は、細胞壁は細胞のごく一部でのみ削除されました。対照的に、多数プロトプ ラストの含むの頃にみ (図 2 eG) を使用します。発達段階別に単葉の葉はさらに調べた (図 2 H).展開されていないとだけ拡張含む葉プロトプ ラストの高収率の結果が生じ, 含む展開直後からのプロトプ ラストのサイズが多かった制服 (図 2 f) の未展開含む (図 2 e) より。完全に展開された含む、細胞壁は、まだそのままの細胞 (図 2)。我々 は 3 つの異なった製造業者からの細胞壁分解酵素をテストし、上記のように同等の結果を得られます。これらの観察に基づいて、植物材料の選択が重要な要因であるとプロトプ ラストの準備のための最もよい材料をエダマメ苗からちょうど拡大された単葉の葉にいたと考えられました。
プラスミド DNA (0.1 μ、1 μ、5 μ g、20 μ g) 量の範囲は、大豆含むプロトプ ラスト (図 3 a~ D) の最適な変換効率のテストされました。20 μ g のプラスミド DNA 0.1 μ g を示した最低 50% 変換レート (図 3 D) より多くの最高の変換効率を示した (1% 未満)(図 3 a)。3 つのメーカーから別の DNA 精製キットを使用して同等の変換効率を得られます。プラスミド DNA の量が多くて大きく変換効率を向上させる助けることが示唆されました。
図 4は、構成 p2GWF7-E1、 GFPマメ科特異遺伝子E1 (Glyma.06G207800)、ベクトル p2GWF7 CaMV 35Sプロモータ主導に融合を表現すると変換ダイズプロトプ ラストの共焦点画像39. E1 GFP 融合タンパク質はシロイヌナズナ プロトプ ラスト システム40を使用して前の調査に一貫している、ダイズプロトプ ラストの核局在化を示します。E1は、マメ科植物に固有の遺伝子は、大豆のプロトプ ラストを用いた結果は E1 蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーションの決定的な洞察力を提供します。
図 1。この研究では、ルート、胚軸、子葉、芽生えを含む原形質体の準備のためテストがダイズ幼植物の器官を示す図含むと。単葉の葉のペア後、は、大豆の苗は三葉の葉を開発します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。さまざまな臓器と大豆苗の段階から調製したプロトプ ラストの細胞します。(A ~ D)ダイズ芽ばえの 10 日間の古いさまざまな器官から調製した細胞: ルート (A)、胚軸 (B)、(C)、芽生え子葉 (D)。(E ・ G)発達段階別に単葉の葉から調製したプロトプ ラストの細胞: 未展開 (E)、(F) を発展させただけと (G) を完全に展開含む、左・中・右、上 (H) 大豆苗にそれぞれ対応します。スケール バーは 25 μ m (A G) または 25 mm (H です)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。共焦点画像を含むプロトプ ラスト プラスミッド DNA の量が異なると大豆の変換効率を示します。画像 (緑色で表される) GFP と明るいフィールド (グレー) がマージされます。プロトプ ラストは、プラスミド p2GWF7 E1 の量が異なると変形した: 0.1 μ g (A)、(B) 1 μ、5 μ g (C)、20 μ g (D)。GFP の蛍光信号は、顕微鏡下で変換後 24 時間監視されました。ブラック スケール バーは 50 μ m いますこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
図 4。共焦点画像含むプロトプ ラスト大豆の核に E1 GFP の細胞内分布を示すします。プラスミド p2GWF7 E1 は、変換に使用されました。画像 (緑色で表される) GFP と明るいフィールド (グレー) がマージされます。GFP の蛍光信号は変換後 24 時間監視されました。ブラック スケール バーは 5 μ m ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。
| 酵素液 (新鮮な) | |
| MES の pH 5.7 | 20 mM |
| セルラーゼ CELF | 2% (w/v) |
| ペクトリアーゼ Y-23 | 0.1% (w/v) |
| マンニトール | 0.75 M |
| CaCl2 | 0.2 mM |
| BSA | 0.1% (w/v) |
| DTT | 0.5 mM |
| W5 ソリューション | |
| 塩化ナトリウム | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES の pH 5.7 | 2 mM |
| MMg ソリューション | |
| MES の pH 5.7 | 4 mM |
| マンニトール | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| 止め釘の解決 (新鮮な) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| マンニトール | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| 無線ソリューション | |
| MES の pH 5.7 | 4 mM |
| マンニトール | 0.5 M |
| KCl | 20 mM |
表 1。大豆プロトプ ラスト単離と変換に使用されるソリューションです。
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Discussion
ダイズプロトプと一過性発現研究への応用の分離のこのプロトコルは徹底的にテストされており、当研究室では非常にうまきます。手順はシンプルで簡単な一般的な機器を最小コストを必要とされます。我々 のプロトコルは、以前に報告された方法34,35,36,37,38に比べて均一で高品質のプロトプ ラストの大量を生成します。ただし、プロトプ ラストの収率と変換レートに影響を与える多くの要因があるので、実験条件、望ましい結果および使用される材料に従って条件を最適化する研究者も強く推奨します。このシステムは植物細胞における即時規制および生化学的イベントの検討に非常に役立ちますが、組織または個体レベルで発生するイベントと長期的細胞プロセスの観察に適してはありません。
理想的な発達段階で成長する植物材料の選択だった大豆プロトプ ラスト調製で最も重要な要因であることがわかった。プロトプ ラスト、しかしその後 DNA 変換に影響を与える品質の利回りだけでなくを決定します。常にストレスを感じないで、干ばつ、洪水、極端な温度や害虫などから一定の環境で大豆の植物を育てることが重要です。最高のプロトプ ラスト収量と変換効率は、稚苗からちょうど拡大された単葉の葉を使用して実現できます。初心者は、発達段階別に単葉の葉を使用し、最高の結果を得るために比較することをお勧めします。
プロトプ ラスト/DNA 比は、最適な変換効率を上げるのための重要な要因です。手始めに 2 × 104プロトプ ラスト/10-20 μ g の DNA 比、個々 の構成要素の比率の最適化お勧め25通常お勧めします。高品質 DNA 精製キットによって得られた DNA を使用することを強くお勧めします。
プロトプ ラストにおける過渡的表現のためのベクトルの選択、高コピー数と小型ベクトルが一般に好ましいです。バイナリのアグロバクテリウムのベクトルが-より少ない最適な変換効率これらのベクトルの大きいサイズがあります、プロトプ ラストの植物を介した変換を使用できます。GFP 融合タンパク質発現、我々 は通常 p2GWF7 と p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be) など植物あり、従って比較的小さい (6-7 kb)、選択マーカーを持っていないベクトルを使用します。
複数のベクトルは、プロトプ ラストを同時に変換する使用できます。オルガネラとダイズプロトプ ラストの細胞内ラベリングのための複数の蛍光蛋白質と同様、蛋白質蛋白質の相互作用をテストするため BiFC ベクトルを表現することに成功しました。シンプルさと手法の大規模な利回りが規制や生化学的イベント、標的遺伝子ベクター、一過性に表現された蛋白質と蛋白質の複合体の分離の検討そして特定の浄化のための理想的なシステムを提供していますさらに、新興 genomic および proteomic アプリケーションがさらにできるように核などの細胞小器官に近づきます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、全米科学財団 (NSF-PGRP IOS-1339388) から植物ゲノム研究プログラムによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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