Summary
우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.
Abstract
콩 (최대 글리신 (L.) Merr.)는 중요 한 작물 종 이며 유전 그리고 생 화 확 적인 통로의 연구에 대 한 콩과 모델 되고있다. 따라서, 그것은 콩에서 효율적인 변이 유전자 표현 시스템을 설정 하는 것이 중요입니다. 여기, 우리 콩 protoplasts의 준비에 대 한 간단한 프로토콜 및 일시적 기능 분석에 대 한 응용 프로그램을 보고합니다. 우리는 젊은 unifoliate 잎 콩 모 종에서 높은 품질 protoplasts의 대량에서 결과 발견. 못 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 하 여 우리 콩 unifoliate protoplasts를 사용 하 여 높은 변환 효율을 달성. 이 시스템 라이브 콩 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘의 검사에 대 한 효율적이 고 다재 다능 한 모델을 제공 하 고 더 나은 하는 데 도움이 콩의 다양 한 세포, 발달 및 생리 적 프로세스를 이해할 수 있습니다.
Introduction
Protoplasts는 식물 세포는 세포 벽 제거. 그들은 대부분의 기능을 유지 하 고 식물 세포의 활동, protoplasts는 관찰 하 고 평가 하는 다양 한 세포 이벤트, 좋은 모델 시스템 하 고 체세포 혼성1 을 공부 하 고 중생2공장에 유용한 도구. Protoplasts 공장 변환3,,45, 세포 벽 세포로 DNA의 통로 차단 그렇지 않으면 이후 널리 이용 되어 있다. Protoplasts 생리 적인 응답의 일부 및 따라서 단백질 subcellular 지 방화6,7,8, 공부 하는 기초 연구에 근본적인 가치를 제공 하 고 그대로 식물의 세포 프로세스 보유 단백질 단백질 상호 작용9,10, 발기인 활동11,,1213 에 셀 살고 있다.
식물 protoplasts의 196014 에 처음 알려졌다 고 절연 및 protoplasts의 변환에 대 한 프로토콜 개발 및 최적화 되었습니다. 원생 동물 격리의 표준 절차는 잎의 절단 및 세포 벽, 비 소화 조직 파편에서 출시 된 protoplasts의 분리에 의해 다음의 효소 소화를 포함 한다. 전환 전략 electroporation15,16, microinjection17,18및 폴 리 에틸렌 글리콜 기반 (PEG)4,,519 방법을 포함 합니다. 다양 한 종의 원생 동물 격리, 감귤 류20, 브라시카21, Solanaceae22 및 다른 장식적인 식물 가족23,24를 포함 하 여 성공 보고 되었습니다. 다양 한 조직 유형에 다양 한 종에 사용 하 고, 표현의 과도 애기 mesophyll 원생 동물 (TEAMP)에서 애기 thaliana 모델 식물의 잎에서 분리 된 시스템 잘 설립된25 되었습니다. 그리고 다양 한 응용 프로그램을 광범위 하 게 채택.
콩 (최대 글리신 (L.) Merr.) 가장 중요 한 단백질의 하나 이며 기름 작물26. 애기 와 달리 쌀, 유전자 변형 콩 식물을 얻기 보다 어렵고 낮은 효율 될 알려져 있다. Agrobacterium tumefaciens-중재 침투는 널리 사용 되 고 담배27 에서 상피 세포와 애기28,29, 모 종 변이 유전자 표현 연구 반면 Agrobacterium rhizogenes 콩30털 뿌리의 변화에 대 한 사용 되었습니다. 바이러스 유도 유전자 입을 접근 downregulation 대상 유전자31,32 와 과도 식33 의 체계적인 방식으로 활용 되어 있다. Protoplasts 이러한 접근에 대 한 소중 하 고 다양 한 대안을 제공합니다. Protoplasts 콩의 지상 자료에서 얻어질 수 있다 고 신속 하 고 동기화 transgene 식. 그러나, 198334에 콩 protoplasts의 초기 성공 격리, 이후 제한 보고서 콩35,,3637, protoplasts의 응용 프로그램에 38, 콩 protoplasts의 상대적으로 낮은 수확량 때문에 주로.
여기, 우리 콩 protoplasts의 격리에 대 한 간단 하 고 효율적인 프로토콜 및 변이 유전자 표현 연구에 대 한 응용 프로그램을 설명합니다. 콩 모 종에서 젊은 unifoliate 잎을 사용 하 여, 몇 시간 안에 많은 양의 중요 한 protoplasts 얻을 수 있었습니다. 또한, 우리는 간단 하 고 저비용 고효율 콩 protoplasts에 DNA를 전달 하는 말뚝 칼슘 중재 하는 변환 메서드를 최적화 했습니다.
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Protocol
1입니다. 식물의 성장
- 콩에 대 한 사용자 지정 토양 혼합에 25 ° C에서 긴 하루 조건 (16 h 1500 µmol m-2의 -1에 빛)에서 온실에서 13cm 냄비에 5-10 콩 씨앗 (윌리엄스 82)를 뿌리 다 (1: 토양, 진주 암 및 어 뢰 모래의 비율이 1:1).
2입니다. 플라스 미드 DNA의 준비
- 살 균 피 펫 팁 또는 이쑤시개 사용 하, 단일 식민지 또는 냉동된 글리세롤 재고의 대장균 의 유전자를 포함 하는 플라스 미드를 운반 하 고 20 mL 50 mL 플라스 크에 적절 한 항생제와 Luria Bertani (파운드) 액체 매체에 접종.
- 통에 하룻밤 37 ° C에서 플라스 크를 품 어. 5 분 동안 실 온에서 12000 x g에서 정지 centrifuging와 삭제는 상쾌한 박테리아를 수집 합니다. 추출 하 고 플라스 미드 플라스 미드 준비 장비의 제조 업체의 절차에 따라 정화.
3. 원생 동물 격리
- 10 일 된 콩 모 종 (그림 1)에서 새로 확장 된 unifoliate 나뭇잎을 잘라.
참고: 적절 한 발달 단계에서 잎의 선택 콩 원생 동물 준비에 대 한 성공에 열쇠 이다. 만 그냥 확장된 잎을 사용 하 여 초기 발달 단계에서. 성숙한 잎, 세포 벽 소화 하기 어렵게 된다. - 신선한 면도날으로는 midrib unifoliate 잎 및 0.5-1에 남아 m m 스트립 다음 컷에서 제거 합니다.
참고: 10 mL 효소 솔루션에 소화 두 unifoliate 잎 10 개 이상의 변환에 대 한 충분 한 protoplasts를 줄 것 이다. - 집게, 전송의 쌍을 사용 하 여 리프 스트립 즉시 고 부드럽게 15 mL 튜브에 갓된 효소 솔루션 (표 1) 10 mL에. 진공 침투 잎은 실 온에서 15 분 동안 스트립.
- 부드러운 실 온에서 4-6 h에 대 한 낮은 조명에서 동요 (40 rpm)와 효소 솔루션에서 리프 스트립을 품 어. 효소 솔루션 변하기 노란색-녹색 protoplasts 해제 됩니다 확인 하십시오. 현미경 (X10) 효소/protoplasts 솔루션을 확인 하십시오.
참고: 릴리스 protoplasts 모양, 소화 되지 않은 세포는 불규칙 한 또는 타원형 모양을 하는 동안 구형은. - 부드럽게 붓는 의해 50 mL 튜브에 효소/원생 동물 솔루션의 10 mL를 전송 하 고 소화를 막으려고 실 온에서 W5 솔루션 (표 1) 10 mL를 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 몇 번 반전. 부드럽게 깨끗 한 75 µ m 나일론 메쉬 위에 소화 되지 않은 잎 조직 제거를 50ml 튜브에 효소/protoplasts 솔루션을 붓으십시오.
- 실 온에서 1-2 분 50 mL 튜브에 100 x g에서 흐름을 통해 효소/protoplasts 솔루션 원심 부드럽게 상쾌한 원생 동물 펠 렛을 방해 하지 않고 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 제거 합니다.
- Resuspend는 protoplasts 그리고 (x10) 현미경 hemacytometer에 원생 동물 수를 계산 하 여 4 ° C에서 냉장된 W5 솔루션에서 2 x 105 mL-1 의 농도를 희석. 30 분 동안 얼음에 protoplasts를 유지.
- 실 온에서 1-2 분 x 100g에 현 탁 액을 원심 그리고 W5 솔루션 원생 동물 펠 렛을 방해 하지 않고 1 mL 피 펫을 사용 하 여 제거. 실 온에서 2 x 105 mL-1 의 농도에 MMG 솔루션 (표 1)에서 protoplasts를 resuspend.
4. 원생 동물 전이
- 1.5 mL 낮은 접착 microcentrifuge 튜브 포경된 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 protoplasts (2 x 105 mL-1에서 2 × 104 protoplasts)의 100 µ L aliquots를 확인 합니다. 부정적인 통제 역할을 한 약 수 옆으로 넣어. 각 protoplasts의 나머지 약 수로 플라스 미드 (10-20 µ g)의 10 µ L를 추가 합니다.
- 천천히 1.5 mL microcentrifuge 튜브의 내부 벽에 갓된 못 솔루션 (표 1)의 110 µ L을 추가 하 고 부드럽게 반전 솔루션은 균질 됩니다 때까지 튜브를 회전.
- 15 분 동안 실 온에서 변환 혼합물을 품 어.
- 중지 하려면 변환, 천천히 실내 온도에 1.5 mL 튜브에 W5 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고 솔루션은 균질 됩니다 때까지 부드럽게 튜브를 반전 합니다. 실 온에서 1-2 분 100 g에 튜브 원심 하 고 상쾌한을 피 펫을 사용 하 여 삭제.
- 튜브를 무선 솔루션 (표 1)의 1 mL을 추가 하 고 1-2 회 부드럽게 pipetting으로 resuspend. 코트 표면 하 고는 protoplasts 접시에 집착 하는 것을 방지 하 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 5% (vol/vol) 메 마른 송아지 혈 청 1 mL를 추가 합니다.
- 몇 초 후, 송아지 혈 청을 피 펫을 사용 하 여 삭제 합니다. Resuspended protoplasts 문화 접시의 우물으로 전송 합니다. 커버 뚜껑 접시.
5. 원생 동물 부 화 및 수확
- 어둠 속에서 1-2 일 동안 실 온에서 protoplasts를 품 어.
참고: 우리는 2 일 보육 일일 보육에 비해 일반적으로 더 강한 형광 단백질 신호 하 고 형광 단백질 신호 최대 3-4 일 동안 지속 될 수 있습니다 발견. - 원생 동물 솔루션 낮은 접착 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송. Protoplasts 수확을 실 온에서 1-2 분 x 100g에 튜브 원심 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 유리 슬라이드에 10 µ L protoplasts를 전송.
- Confocal 현미경 검사 법 또는 형광 형광 신호를 관찰 합니다. 변형 비 protoplasts를 사용 하 여 부정적인 제어 (신호가 관찰 한다).
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Representative Results
다른 장기 10 일 오래 된 콩의 원생 동물 준비 (그림 1)에 대 한 테스트 및 수율 (그림 2) 현미경 관찰 했다. Hypocotyl 및 epicotyl에서 세포 벽 거의 소화 했다, 하 고 일부 셀 (그림 2B, 2 C) 서로 게 연결 된. 떡 (그림 2D)와 루트 (그림 2A), 세포 벽은 세포의 작은 부분에만 제거 되었습니다. 반면, 많은 수의 protoplasts unifoliate 때 관찰 되었다 (그림 2E-G)을 사용. 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎 시험된 (그림 2 H) 추가 했다. 모두 확장 되지 않은 고 그냥 확장 unifoliate 잎 protoplasts의 높은 수확량 귀착되 었 다, unifoliate 단지 확장에서 protoplasts의 크기 더 했다 보다는 확장 되지 않은 unifoliate (그림 2E) 유니폼 (그림 2F). 완전히 확장 된 unifoliate, 세포 벽 했다 그대로 셀 (그림 2G)의 대부분. 우리 3 다른 제조 업체에서 세포 벽 소화 효소를 테스트 하 고 위에서 설명한 대로 비슷한 결과 얻은. 이러한 관찰을 바탕으로, 우리가 결론 식물 재료의 선택은 중요 한 요소는 젊은 콩 모 종에서 그냥 확장된 unifoliate 잎 원생 동물 준비에 대 한 최고의 소재 했다.
다양 한 플라스 미드 DNA (0.1 µ g, 1 µ g, 5 µ g와 20 µ g)의 서로 다른 양의 콩 unifoliate protoplasts (그림 3A-D)의 최적의 변환 효율에 대 한 테스트 되었습니다. 20 µ g 플라스 미드 DNA 0.1 µ g 보여주었다 가장 낮은 하는 동안 50% 변환 속도 (그림 3D) 보다 더 높은 변환 효율을 보였다 (1% 미만) (그림 3A)입니다. 우리는 3 제조 업체에서 다른 DNA 정제 키트를 사용 하 여 비교 변환 효율을 얻었다. 이 결과 플라스 미드 DNA의 다량 변환 효율 증가에 크게 도움이 될 것을 제안 합니다.
그림 4 는 구문 p2GWF7-E1, GFP 융합 하는 콩과 식물 관련 유전자 E1 (Glyma.06G207800), CaMV 35S 발기인 벡터 p2GWF7에 의해 구동을 표현으로 변형 콩 protoplasts의 공초점 이미지 39. E1-GFP 융해 단백질에서는 핵 지역화 콩 protoplasts는 애기 원생 동물 시스템40을 사용 하 여 이전 연구와 일치 하는. E1 콩과 식물 관련 유전자는, 콩 원생 동물 시스템을 사용 하 여 우리의 결과 E1 단백질의 subcellular 지 방화의 결정적인 통찰력을 제공 합니다.
그림 1입니다. 이 연구에서 루트, hypocotyl, 떡, epicotyl를 포함 하 여 원생 동물 준비에 대 한 테스트는 콩 모 종의 장기를 보여주는 그림 및 unifoliate. Unifoliate 잎의 쌍, 콩 모 종 세 잎 개발. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 다른 장기와 콩 묘 목의 발달 단계에서 준비 하는 원생 동물 세포. (A-D) 셀 일 이전-10의 다른 장기에서 콩 모 종 준비: 루트 (A), hypocotyl (B), (C), epicotyl 떡 (D). (E-G) 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎에서 준비 하는 원생 동물 세포: 확장 되지 않은 (E), 그냥 (F), 확장 하 고 완전히 확장 (G) unifoliate, 각각 해당 왼쪽, 가운데 및 오른쪽에 (H)에 콩 모 종 하. 눈금 막대 25 µ m (A-G) 또는 25 m m (H)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 공초점 이미지 플라스 미드 DNA의 다른 양의 unifoliate protoplasts 콩의 변환 효율을 보여주는. GFP (녹색에서 표시) 하 고 밝은 이미지 필드 (회색) 병합 됩니다. Protoplasts 플라스 미드 p2GWF7-E1의 다른 금액으로 변형 되었다: 0.1 µ g (A), 1 µ g (B), 5 µ g (C)와 20 µ g (D). GFP의 형광 신호 현미경 아래 변환 후 24 시간을 모니터링 했다. 검은 눈금 막대는 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. Unifoliate protoplasts 콩의 핵에서 E1-GFP의 subcellular 지 방화를 보여주는 confocal 이미지. 플라스 미드 p2GWF7-E1 변환을 위해 사용 되었다. GFP (녹색에서 표시) 하 고 밝은 이미지 필드 (회색) 병합 됩니다. GFP의 형광 신호 변환 후 24 시간을 모니터링 했다. 검은 눈금 막대는 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 효소 솔루션 (갓 준비) | |
| MES, pH 5.7 | 20 mM |
| Cellulase CELF | 2% (w/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0.1% (w/v) |
| 마 니 톨 | 0.75 M |
| CaCl2 | 0.2 m m |
| BSA | 0.1% (w/v) |
| DTT | 0.5 m m |
| W5 솔루션 | |
| NaCl | 154 m m |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5.7 | 2 mM |
| MMg 솔루션 | |
| MES, pH 5.7 | 4 m m |
| 마 니 톨 | 400 m m |
| MgCl2 | 15 m m |
| 못 솔루션 (갓 준비) | |
| PEG4000 | 20% (w/v) |
| 마 니 톨 | 200 mM |
| CaCl2 | 100 m m |
| 무선 솔루션 | |
| MES, pH 5.7 | 4 m m |
| 마 니 톨 | 0.5 M |
| KCl | 20 mM |
표 1입니다. 콩 원생 동물 격리 및 변환 사용 하는 솔루션.
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Discussion
콩 protoplasts 및 과도 식 연구에 응용 프로그램의 격리에 대 한이 정서의 철저 하 게 테스트 하 고 우리의 실험실에서 아주 잘 작동. 절차는 간단 하 고 쉽게 고 일반 장비 및 최소 비용 요구. 우리의 프로토콜 이전에 보고 된 방법34,35,36,,3738에 비해 균일 한 고품질 protoplasts의 대량을 생성 합니다. 그러나, 원생 동물 수율과 변환 속도 영향을 미칠 많은 요인이 있기 때문에, 그것은 좋습니다 연구자의 실험 조건, 바람직한 결과 사용 되는 재료에 따라 조건 최적화에 대 한. 이 시스템은 식물 세포에 즉시 규제 및 생 화 확 적인 사건의 검사를 위해 아주 유용 하다, 그러나 장기 세포 프로세스 및 조직 또는 organismal 수준에서 발생 하는 이벤트의 관찰을 위해 적당 하다.
우리가 적극적으로 성장 하는 식물 재료는 이상적인 발달 단계에서의 선택 콩 원생 동물 준비에서 가장 중요 한 요소 발견. 뿐만 아니라 protoplasts, 하지만 후속 DNA 변화에 영향을 주는 품질의 수확량을 결정 합니다. 그것은 항상 어떤 스트레스, 가뭄, 홍수, 극단적인 온도 또는 해충 등에서 일정 한 환경에서 콩 식물을 성장 하는 것이 중요. 젊은 묘 종에서 그냥 확장된 unifoliate 잎을 사용 하 여 최고 원생 동물 수율 및 변환 효율을 얻을 수 있습니다. 초보자를 위한, 그것은 다른 발달 단계에서 unifoliate 잎을 사용 하 여 최상의 결과 얻으려면 비교 좋습니다.
원생 동물/DNA 비율은 최적의 변환 효율에 대 한 중요 한 요소입니다. 그것은 일반적으로 시작으로 2 × 104 protoplasts/10-20 µ g DNA의 비율 하지만 개별 구문에 대 한 비율의 최적화 권장25최고의. 높은 품질 DNA 정제 키트에 의해 얻어진 DNA의 사용이 좋습니다.
Protoplasts에 과도 식에 대 한 벡터의 선택에 대 한 높은 복사 번호와 소형 벡터는 일반적으로 선호 됩니다. 비록 Agrobacterium tumefaciens에 대 한 이진 벡터-식물의 중재 변환 원생 동물 변환에 사용할 수 있습니다,이 벡터의 큰 크기는 덜 최적의 변환 효율에 발생할 수 있습니다. GFP 융합 단백질 표정, 우리가 일반적으로 벡터를 p2GWF7 및 p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be) 등 식물과 따라서 상대적으로 작은 (6-7 킬로바이트)에 대 한 선택 마커를 소유 하지 않는 사용 합니다.
여러 개의 벡터 protoplasts를 동시에 변환 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 단백질 단백질 상호 작용, 세포 기관이 및 subcellular 라벨 콩 protoplasts에 대 한 여러 형광 단백질 테스트 BiFC 벡터 표현에 성공을 했다. 또한, 단순 하 고 우리의 방법의 큰 수익률 규제 및 생 화 확 적인 이벤트, 유전자를 대상으로 벡터 디자인, 뚜렷이 표현 단백질과 단백질 복잡 한, 절연 시험 및 특정의 정화에 대 한 이상적인 시스템 제공 핵, 신흥 genomic와 proteomic 추가 응용 프로그램 활성화 등 세포 기관이 접근 한다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (NSF-PGRP-IOS-1339388)에서 식물 게놈 연구 프로그램에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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