Summary
Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente para a preparação de grandes quantidades de protoplastas de soja estudar mecanismos complexos regulatórios e sinalização em células vivas.
Abstract
Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma espécie de cultura importante e tornou-se um modelo de vegetal para os estudos das vias genéticas e bioquímicas. Portanto, é importante estabelecer um sistema de expressão de gene transiente eficiente em soja. Aqui, nós relatamos um protocolo simples para a preparação de protoplastas de soja e sua aplicação para análises funcionais transitórias. Nós achamos que o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja resultaram em grandes quantidades de protoplastas de alta qualidade. Otimizando um método de transformação PEG-cálcio-mediada, atingimos a eficiência elevada de transformação usando protoplastas de unifoliate de soja. Este sistema fornece um modelo eficiente e versátil para exame dos complexos mecanismos de regulamentação e sinalização em células vivas de soja e pode ajudar a melhor compreender diversos processos celulares, fisiológicos e de desenvolvimento das leguminosas.
Introduction
Protoplastas são células vegetais que possuem paredes celulares removidas. Como eles mantêm a maioria dos recursos e atividades das células vegetais, protoplastas são um bom modelo sistema para observar e avaliar diversos eventos celulares e são ferramentas valiosas para estudar a hibridação somática1 e regeneração2da planta. Protoplastas tem sido também amplamente utilizados para planta transformação3,4,5, desde paredes celulares caso contrário iria bloquear a passagem de DNA para a célula. Protoplastas de possuam algumas das respostas fisiológicas e processos celulares de plantas intactas, oferecendo, portanto, o valor fundamental na pesquisa básica para estudar a localização Subcellular da proteína6,7,8, de9,de interações proteína-proteína10e o promotor atividade11,12,13 em células vivem.
O isolamento dos protoplastas de planta foi primeiramente relatado em 196014 e os protocolos para isolamento e transformação de protoplastas foram desenvolvidos e optimizados. Um procedimento padrão de isolamento de protoplastos envolve o corte de folhas e digestão enzimática das paredes celulares, seguido de separação de protoplastas lançados de restos de tecido não-digeridos. Estratégias de transformação inclui electroporation15,16, microinjeção17,18e baseadas em polietileno glicol (PEG)4,5,19 métodos. Uma grande variedade de espécies têm sido relatados bem sucedida para o isolamento de protoplastos, incluindo cítricas20, Brassica21, Solanaceae22 e outras famílias de plantas ornamentais23,24. Enquanto o tecido diversos tipos são usados em várias espécies, um sistema de expressão transiente em protoplastos de mesofilo de Arabidopsis (TEAMP) isolado de folhas da planta modelo Arabidopsis thaliana tem sido bem estabelecida25 e amplamente adotado para diversas aplicações.
Feijão de soja (Glycine max (L.) Merr.) é uma das mais importantes proteínas e óleo para as culturas26. Ao contrário de Arabidopsis e arroz, obtenção de plantas transgênicas de soja é conhecido por ser um pouco difícil e baixa eficiência. Agrobacterium tumefaciens-mediada por infiltração foi usada popularmente para estudos de expressão transiente gene nas células epidérmicas em tabaco27 e mudas em Arabidopsis28,29, Considerando que Agrobacterium rhizogenes tem sido usado para transformação de raízes peludas na soja30. Abordagens de silenciamento de gene induzida por vírus têm sido utilizadas para downregulation de alvo genes31,32 e transiente expressão33 de forma sistêmica. Protoplastas fornecem uma alternativa valiosa e versátil para essas abordagens. Protoplastas podem ser obtidos de materiais na superfície do feijão de soja e permitam a expressão do transgene rápida e sincronizada. No entanto, desde o isolamento de sucesso inicial de protoplastas de soja no 198334, houve limitados relatórios sobre a aplicação da protoplastas em soja35,36,37, 38, principalmente devido à relativamente baixos rendimentos de protoplastas de soja.
Aqui, descrevemos um protocolo simples e eficiente para o isolamento de protoplastas de soja e sua aplicação para estudos de expressão transiente de gene. Usando o jovens unifoliate folhas de plântulas de soja, fomos capazes de obter grandes quantidades de protoplastas vitais dentro de algumas horas. Além disso, otimizamos a um método de transformação de PEG-cálcio-mediada que é simples e de baixo custo para entregar o DNA nas protoplastas de soja com alta eficiência.
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Protocol
1. o crescimento das plantas
- 5-10 sementes de soja (82 Williams) em uma panela de 13 cm em estufa sob condições de longo-dia (16 h de luz em 1.500 µmol m-2 s-1) a 25 ° C, a mistura de solo personalizada da porca para soja (a 1: proporção de 1:1 de areia do solo, perlite e torpedo).
2. preparação do ADN do plasmídeo
- Usando a ponta da pipeta estéril ou palito de dente, escolher uma única colônia ou estoque de glicerol congelados de Escherichia coli , carregando o plasmídeo contendo o gene de interesse e inoculá-lo em 20 mL de meio líquido de Luria-Bertani (LB) com antibióticos apropriados em um balão de 50 mL.
- Incube o frasco a 37 ° C durante a noite em uma coqueteleira. Recolha as bactérias por centrifugação a suspensão a 12.000 x g, à temperatura ambiente por 5 min e descartar o sobrenadante. Extrair e purificar o plasmídeo seguindo o procedimento do fabricante de um kit de preparação do plasmídeo.
3. isolamento de protoplastos
- Corte recém-expandido unifoliate folhas de plântulas de soja 10 dias de idade (Figura 1).
Nota: A seleção das folhas em uma fase do desenvolvimento é a chave para o sucesso de preparação de protoplastos de soja. Só use folhas apenas expandidas em estágios iniciais do desenvolvimento. Como folhas maduras, paredes celulares tornam-se mais difícil de digerir. - Com uma lâmina de barbear fresca, retire a nervura central da folha unifoliate e em seguida, corte os restos em 0,5-1 mm tiras.
Nota: Duas folhas unifoliate digeridas em 10 mL de solução de enzima dará protoplastas suficientes para mais de 10 transformações. - Usando um par de pinças, transferência a folha retira imediatamente e suavemente em 10 mL de solução recentemente preparada de enzima (tabela 1) em um tubo de 15 mL. Vácuo infiltrar a folha tiras para 15 min à temperatura ambiente.
- Incube as tiras de folha na solução enzimática com agitação suave (40 rpm) sob condições de pouca luz para 4-6 h à temperatura ambiente. Certifique-se de que a solução de enzima ficar verde-amarelo, como os protoplastas são liberados. Verifique se a solução de enzima/protoplastas sob o microscópio (X10).
Nota: Os protoplastas lançados são esféricos, enquanto as células não digeridas tem forma oval ou irregular. - Transferir a 10 mL da solução de enzima/protoplastos em um tubo de 50ml derramando suavemente e adicionar 10 mL de solução de W5 (tabela 1) à temperatura ambiente para parar a digestão. Inverta o tubo suavemente várias vezes. Despeje delicadamente a solução enzimática/protoplastas em uma malha de nylon limpo 75 µm colocada em cima de um tubo de 50 mL para remover os tecidos da folha não digerido.
- Centrifugue a solução de fluxo através da enzima/protoplastas em 100 g de x no tubo de 50 mL por 1-2 min à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta sorológica 10ml sem perturbar o sedimento de protoplastos.
- Ressuspender os protoplastas e diluir para uma concentração de 2 x 105 mL-1 , na solução de W5 refrigerada a 4 ° C, contando número de protoplastos em um hemacytometer sob o microscópio (x10). Manter os protoplastas no gelo por 30 min.
- Centrifugar a suspensão de 100 g de x para 1-2 min à temperatura ambiente e remova cuidadosamente a solução W5 usando uma pipeta de 1ml sem perturbar o sedimento de protoplastos. Ressuspender os protoplastas em solução MMG (tabela 1) na concentração de 2 x 105 mL-1 , à temperatura ambiente.
4. transformação de protoplastos
- Faça 100 alíquotas µ l de protoplastas (2 x 104 protoplastas em 2 x 105 mL-1) em tubos de microcentrifuga de baixa adesão de 1,5 mL usando sem cortes pontas de pipetas 200 µ l. Colocar uma alíquota de lado para servir como controle negativo. Adicione 10 µ l de plasmídeo (10-20 µ g) em cada uma das parte alíquota do resto dos protoplastas.
- Lentamente, adicionar 110 µ l de solução recentemente preparada de PEG (tabela 1) na parede interna do tubo de microcentrifuga de 1,5 mL e depois inverta suavemente e rodar o tubo até que a solução se torne homogênea.
- Incube a mistura de transformação à temperatura ambiente por 15 min.
- Para parar a transformação, lentamente adicione 400 µ l de solução W5 no tubo de 1,5 mL à temperatura ambiente e inverta suavemente o tubo até que a solução se torne homogênea. Centrifugar o tubo a 100 g para 1-2 min à temperatura ambiente e descartar o sobrenadante com uma pipeta.
- Adicionar 1 mL de solução WI (tabela 1) para o tubo e ressuspender delicadamente pipetando 1 - 2 vezes. Adicione 1 mL de soro de 5% (vol/vol) bezerro estéril em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 6-poços para revestir a superfície e evitar os protoplastas de degola para a placa.
- Após alguns segundos, descarte o soro de vitela com uma pipeta. Transferi os protoplastas ressuspensão em um poço da placa de cultura. Cubra o prato com uma tampa.
5. protoplastos incubação e colheita
- Incube os protoplastas à temperatura ambiente durante 1-2 dias no escuro.
Nota: Achamos que dois dias de incubação rende mais forte sinal de proteína fluorescente, em geral, em relação à incubação de um dia, e que o sinal de proteína fluorescente pode durar até 3-4 dias. - Transferi a solução de protoplastos para um tubo de microcentrifugadora de baixa adesão de 1,5 mL. Centrifugar o tubo a 100 x g por 1-2 min à temperatura ambiente a colheita protoplastas. Remover o sobrenadante com uma pipeta e transferir 10 protoplastas µ l numa lâmina de vidro.
- Observe o sinal fluorescente sob fluorescência ou microscopia confocal. Use protoplastas não-transformadas como controlo negativo (nenhum sinal deve ser observado).
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Representative Results
Diferentes órgãos de soja 10 dia de idade foram testados para a preparação de protoplastos (Figura 1) e rendimentos foram observados ao microscópio (Figura 2). Paredes celulares do hypocotyl e epicotyl foram mal digeridas, e algumas células ficaram anexadas ao outro (Figura 2B, 2C). No cotilédone (Figura 2D) e raiz (Figura 2A), paredes celulares foram removidas somente em uma pequena porção de células. Em contraste, um grande número de protoplastas foram observado quando unifoliate foi usado (Figura 2E-G). Unifoliate folhas em diferentes estádios de desenvolvimento foram posteriormente examinadas (Figura 2 H). Enquanto ambas as folhas unifoliate não expandidas e expandidas só resultaram em rendimentos elevados de protoplastas, o tamanho dos protoplastas de apenas expandido unifoliate eram mais uniforme (Figura 2F) do que os não expandido unifoliate (Figura 2E). Para o totalmente expandida unifoliate, as paredes celulares estavam ainda intactas na maioria das células (Figura 2). Testamos as enzimas de parede celular-digestão de três fabricantes diferentes e obteve resultados comparáveis, conforme descrito acima. Baseia-se estas observações, concluiu-se que a seleção de materiais vegetais foi um fator crucial e que apenas expandidas unifoliate folhas de plântulas de soja jovens eram o melhor material para a preparação de protoplastos.
Uma gama de diferentes quantidades de plasmídeo (0.1 µ g, 1 µ g, 5 µ g e 20 µ g) foi testada para a eficiência de transformação ideal dos protoplastas de unifoliate de soja (Figura 3A-D). 20 µ g Plasmídeo mostrou a mais alta eficiência de transformação com mais do que a taxa de transformação de 50% (Figura 3D), enquanto que 0,1 µ g apresentou a mais baixa (menos de 1%) (Figura 3A). Obtivemos a eficiência de transformação comparáveis utilizando diferentes kits de purificação de DNA de três fabricantes. Este resultado sugere que quantidades maiores de ADN do plasmídeo ajudaria enormemente para aumentar a eficiência de transformação.
Figura 4 é imagens confocal de protoplastas de soja transformadas com a construção p2GWF7-E1, que expressa a GFP fundido ao gene vegetal específico E1 (Glyma.06G207800), conduzido pelo promotor CaMV 35S em p2GWF7 o vetor 39. a proteína de fusão E1-GFP mostra localização nuclear em protoplastas de soja, que é consistente com um estudo anterior usando o de sistema de protoplastos de Arabidopsis40. Dado que E1 é um gene vegetal específico, nosso resultado usando o sistema de protoplastos de soja fornece uma visão conclusiva a Localização subcellular da proteína E1.
Figura 1. Ilustração mostrando os órgãos de um seedling de soja que são testados para a preparação de protoplastos neste estudo, incluindo raiz, hypocotyl, cotilédone, epicotyl e unifoliate. Depois de um par de folhas unifoliate, mudas de soja desenvolvem folhas trifolioladas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Células de protoplastos preparadas a partir de diferentes órgãos e estádios de desenvolvimento de plântulas de soja. (A-D) Células preparadas a partir de diferentes órgãos de 10 dias de idade mudas de soja: raiz (A), hypocotyl (B), epicotyl (C), cotilédone (D). (E-G) Células de protoplastos preparadas a partir de folhas de unifoliate em diferentes estádios de desenvolvimento: não expandido (E), apenas expandido (F) e totalmente expandido (G) unifoliate, correspondente as mudas de soja em (H) à esquerda, meio e direito, respectivamente. Barra de escala é de 25 µm (A-G) ou 25 mm (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Confocal imagens mostrando a eficiência de transformação de soja unifoliate protoplastas com diferentes quantidades de ADN do plasmídeo. Imagens de GFP (representada em verde) e brilhante campo (cinza) são mescladas. Protoplastas transformaram-se com diferentes quantidades do plasmídeo p2GWF7-E1: 0,1 µ g (A), 1 µ g (B), 5 µ g (C) e 20 µ g (D). Sinal de fluorescência de GFP foi monitorado 24 horas após transformação sob microscopia. Barra de escala preta é 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imagens confocal, mostrando a Localização subcellular de E1-GFP no núcleo de soja protoplastas unifoliate. O plasmídeo p2GWF7-E1 foi usado para a transformação. Imagens de GFP (representada em verde) e brilhante campo (cinza) são mescladas. Sinal de fluorescência de GFP foi monitorado 24 horas após a transformação. Barra de escala preta é 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução de enzima (preparada na hora) | |
| MES, pH 5,7 | 20mM |
| Celulase CELF | 2% (p/v) |
| Pectolyase Y-23 | 0,1% (p/v) |
| Manitol | 0,75 M |
| CaCl2 | 0,2 mM |
| BSA | 0,1% (p/v) |
| DTT | 0.5 mM |
| Solução de W5 | |
| NaCl | 154 mM |
| CaCl2 | 125 mM |
| KCl | 5 mM |
| MES, pH 5,7 | 2 mM |
| Solução de MMg | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Manitol | 400 mM |
| MgCl2 | 15 mM |
| Solução de PEG (preparada na hora) | |
| PEG4000 | 20% (p/v) |
| Manitol | 200 mM |
| CaCl2 | 100 mM |
| Solução de WI | |
| MES, pH 5,7 | 4 mM |
| Manitol | 0,5 M |
| KCl | 20 mM |
Tabela 1. Soluções utilizadas para transformação e isolamento de protoplastos de soja.
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Discussion
Este protocolo para a isolação de protoplastas de soja e o aplicativo para estudos de expressão transiente tem sido exaustivamente testado e funciona muito bem em nosso laboratório. Os procedimentos são simples e fáceis e exigem equipamento normal e custo mínimo. Nosso protocolo produz grandes quantidades de protoplastas uniforme, de alta qualidade em comparação com métodos anteriormente relatados34,35,36,37,38. No entanto, uma vez que existem muitos fatores que afetam o rendimento de protoplastos e taxas de transformação, é altamente recomendável para os investigadores otimizar as condições de acordo com suas condições experimentais, resultados desejáveis e materiais utilizados. Enquanto este sistema é extremamente útil para análise de eventos bioquímicos e regulamentares imediatos em pilhas da planta, não é apropriado para a observação dos processos celulares de longo prazo e eventos que ocorrem no tecido ou dos níveis.
Nós achamos que a selecção das crescendo vigorosamente materiais vegetais numa fase do desenvolvimento ideal era o fator mais crucial para a preparação de protoplastos de soja. Ele determina não só os rendimentos de protoplastas, mas qualidade que afeta a transformação subsequente de DNA. É importante sempre crescer plantas de soja em um ambiente de constante longe de qualquer stress, tais como seca, enchentes, temperaturas extremas ou pragas. A mais alta eficiência de produção e transformação de protoplastos pode ser conseguida usando apenas expandidas unifoliate folhas de mudas jovens. Para iniciantes, é aconselhável usar folhas de unifoliate em diferentes estádios de desenvolvimento e fazer uma comparação para obter os melhores resultados.
Relação de protoplastos/DNA é um fator importante para a eficiência de transformação ideal. Geralmente é melhor começar com a proporção de 2 x 104 protoplastas/10-20 µ g de DNA, mas a otimização da relação para construções individuais é recomendado25. É recomendável o uso de DNA obtido por um kit de purificação de DNA de alta qualidade.
Para a escolha dos vetores para expressão transiente em protoplastas, número alto-cópia e vetores de pequeno porte são geralmente preferidos. Embora o binário vectores de Agrobacterium tumefaciens-transformação mediada de plantas pode ser usado para a transformação de protoplastos, o grande tamanho destes vetores pode resultar em menor eficiência de transformação ideal. Para a expressão da proteína GFP-fusão, normalmente usamos vetores que não possuem um marcador de seleção para plantas e são, portanto, relativamente pequenos (6-7kb), tais como p2GWF7 e p2FGW739 (https://gateway.psb.ugent.be).
Vários vetores podem ser usadas para transformar os protoplastas simultaneamente. Tivemos sucesso em expressar BiFC vetores para testar interações da proteína-proteína, bem como várias proteínas fluorescentes para a organela e rotulagem subcellular em protoplastas de soja. Além disso, a simplicidade e grandes rendimentos do nosso método oferece um sistema ideal para exame de eventos bioquímicos e regulamentares, o projeto de vetor gene-alvo, o isolamento de proteínas expressas transitoriamente e complexo de proteínas e purificação de específicos aproxima-se a organela como núcleos, permitindo que aplicativos mais emergentes genômica e proteômica.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa do genoma de plantas da National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MES | Sigma Aldrich | M8250-100G | |
| Cellulase CELF | Worthington Biological Corporation | LS002611 | |
| Pectolyase Y-23 | BioWorld | 9033-35-6 | |
| CELLULASE "ONOZUKA" R-10 | yakult | 10g | |
| MACEROZYME R-10 | yakult | 10g | |
| Mannitol | ICN Biomedicals | 152540 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500g | |
| BSA | NEB | R3535S | |
| DTT | Sigma Aldrich | D5545-5G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653-1kg | |
| KCl | Fisher | P217-500g | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100g | |
| PEG4000 | Fluka | 81240 | |
| nylon mesh | carolina | 652222N | |
| Tissue Culture Plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | |
| hemacytometer | hausserscientific | 1483 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| EZNA plasmid miniprep kit | Omega | D6942-01 | |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Centrifuge 5810 | eppendorf | 5811000827 | |
| Centrifuge 5424 | eppendorf | 22620401 | |
| Jencons Powerpette Plus Pipet Controller | Jencons | 14526-202 | |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss | N/A | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1018-P | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville | C1060-P | |
| Newborn Calf Serum | Thermo Scientific | 16010159 | |
| Soil | Ingram's Nursery | ||
| perlite | Vigoro | 100521091 | |
| Torpedo Sand | JKS Ventures | ||
| LB Broth, Lennox (Powder) | Fisher | BP1427-500 |
References
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