在这里, 我们描述了一个获得脂滴指数 (LD 指数) 的协议, 以研究在高通量实验中培养的细胞中甘油三酯的动力学。LD 指数法是一种使用 BODIPY 493/503 的简便可靠的方法。这种检测不需要 dispendious 脂提取或显微分析。
本文介绍了应用 LD 指数法测定脂滴 (LDs) 中甘油三酯 (微板块) 积累的灵敏的检测方法。获得了不带脂质提取的 LD 指数。它允许测量在不同条件下的高吞吐量实验中的 LDs 含量, 如富含或氮气耗尽介质的生长。尽管该方法首次被描述为研究酿酒酵母中的脂滴代谢, 它成功地应用于担子黑穗病玉米。有趣的是, 由于 LDs 是真核细胞 phylogenetically 保存的细胞器, 这种方法可以应用于大量的不同的干细胞, 从酵母到哺乳动物细胞。LD 指数是基于 BODIPY 493/503 在淬火条件下的液体荧光恢复试验 (LFR), 通过添加与甲醛固定的细胞.碘钾用作荧光淬火。荧光与光密度斜率的比值为 LD 指数。斜坡是计算的直线, 当 BODIPY 荧光和光学密度在 600 nm (OD600) 绘制的样本添加。最佳数据质量是由相关系数等于或高于 0.9 (r ≥ 0.9) 反映出来的。可以同时读取多个示例, 因为它可以在微板块中实现。由于 BODIPY 493/503 是一种脂溶性荧光染料, 分成脂肪滴, 它可以用于许多类型的细胞积累 LDs。
脂滴 (LDs) 是无处不在的细胞内脂肪体组成的核心中性脂, 主要是标签和甾醇酯 (SE)。核心周围有一层磷脂, 与蛋白质如 perilipin 和酶参与合成中性脂, 如甘油酰基转移酶, 乙酰基 coa 酶和酰 coa 综合体,1。由于其动态行为, 磷脂单层还含有水解标记和 SE2的三酰甘油脂肪酶。根据细胞类型和有机体, 储存中性脂可以用来产生能量, 或合成磷脂和信号分子。在酵母和其他真菌中, LDs 的含量随培养基中氮/碳比值的变化而变化, 表明氮的可用性降低可能是提高中性脂产量的关键3,4 ,5。在酵母中生产大量的标签, 在生物技术中作为生物燃料的来源和食品工业中有潜在的用途。一些储存的脂质含有高比例的多不饱和脂肪酸, 如欧米茄3和欧米茄 6, 营养和膳食重要性6,7,8,9,10,11. 包括人类细胞在内的哺乳动物细胞的 LDs 也含有标记和胆固醇酯。磷脂单层与酵母 LDs 中描述的蛋白质的哺乳动物同源性相互作用, 另外一种蛋白质, perilipin, 在酵母12中不存在。磷脂单层及其相关蛋白的一个建议作用是稳定 lds 结构, 并允许 lds 与细胞器的相互作用, 如线粒体、内质网、过氧化物酶体和液泡, 主要用于脂交换13,14。有趣的是, 在人类中, LDs 似乎参与了2型糖尿病, 动脉粥样硬化, 脂肪性肝炎和冠心病的病理, 其中有增加的数字15,16,17.某些类型的病毒使用 LDs 作为平台来组装病毒2,18,19。
由于 lds 在人类病理中的影响及其潜在的生物技术应用, 对 lds 形成的精确实验测定是一项重要的任务。本文描述了一个可靠的检测方法的基础上恢复荧光 (LFR) 的 BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-波拉-3 a, 4 a-diaza s indacene), 以获得相对价值的中性脂在细胞中的含量。通过这种分析, 可以跟踪真菌中中性脂类积累的动态, 如U. 玉米和酿酒酵母, 还有哺乳动物细胞, 不需要脂质提取20.该方法首次在酿酒酵母中应用, 以确定参与调节脂质代谢的蛋白磷酸和激酶。这是可能的, 不用油脂提取或蛋白质纯化21,22。LFR 也被用来建立腹腔巨噬细胞的 LDs 形成的动力学23。BODIPY 493/503 的使用比其他中性脂质染料有一定的优势, 如尼罗河红色。BODIPY 493/503 是高度特异的中性脂质和有一个狭窄的放射频谱, 促进同时检测的信号, 如红色荧光蛋白或图面-跟踪, 当样品分析的共焦显微镜。不幸的是, BODIPY 493/503 对漂白很敏感, 但在暴露于光24中使用 antiquenching 试剂可以避免此过程。
在酵母细胞中进行 LFR 测定, 在理想的营养条件下培养, 整除数在不同时间被提取。其次, 细胞是固定的甲醛, 这保持了 LDs 的完整性数月, 当细胞存储在4摄氏度。其他固定技术应避免, 特别是使用甲醇或冷丙酮, 因为它们导致 LDs 在细胞内的退化24。为了测量 LD 指数, 甲醛固定细胞悬浮在水中, 以获得明确的浓度。然后, 它们被添加到包含荧光 BODIPY 493/503 的解决方案中, 当荧光进入细胞并与 LDs 关联时, 它的荧光就会恢复。伴随荧光测量 (485 nm/510 nm), 细胞的浓度通过测量 600 nm 的光学密度来量化。每一个样品被读四次通过增加随后5µL 整除数甲醛固定的细胞悬浮到同样井。荧光和吸光度的空白在细胞的加法之前获得。通过确定测量的线性度来评估荧光和吸光度数据的质量: 如果 r < 0.9, 数据被丢弃。r 值是重要的, 因为基本上荧光强度应该产生一个线性反应, 以增加细胞浓度。如果细胞浓度过高, 线性度就会丢失。LFR 法为高通量实验中选择所需的 LD 表型提供了一种快速、简便、经济的方法。在选择所需条件后, 可以通过共焦显微镜对单个细胞的 LD 含量进行研究, 使用与 BODIPY 染色的相同的甲醛固定细胞, 提供细胞中 LDs 的图像。用薄层色谱法进一步分析了它们的标记和硒含量。
LFR 是首次应用于研究酵母中脂质代谢的新方法, 后来在U. 玉米20,21中成功实现。虽然 ld 指数并没有给出细胞中累积的标记的绝对值, 但它为细胞的脂质含量提供了一个快速的概念, 当比较两个或多个实验条件的 LD 指数时, 对数据的解释是直截了当的。BODIPY 493/503 是高度特异的中性脂, 主要成分的 LDs, 它有一个狭窄的发射频谱, 以促进同时检测…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了 Politécnico 国立 Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864)、方案 de 支持农场 Proyectos-Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-国立大学国立墨西哥的赠款的支持 (UNAM) 和委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP 和 256520-GGS)。Fundação de 宪法保护 Pesquisa 做里约热内卢 (FAPERJ Cientistas 做 Nosso: E 26/103.353/2011)。我们感谢 QFB。奥斯卡豪尔赫·伊万·莫拉·戈多伊 Luqueño Bocardo 为示意图概述。我们感谢米格尔博士 Tapia 罗德里格斯在 LDs 的共焦显微术中的宝贵帮助。我们要感谢布鲁诺 Bozaquel Morais 博士在开发酵母技术方面的开创性工作, 我们已经适应了U. 玉米。
Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |