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Biochemistry

真菌病原体液体荧光恢复法测定脂质指数黑穗病玉米

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们描述了一个获得脂滴指数 (LD 指数) 的协议, 以研究在高通量实验中培养的细胞中甘油三酯的动力学。LD 指数法是一种使用 BODIPY 493/503 的简便可靠的方法。这种检测不需要 dispendious 脂提取或显微分析。

Abstract

本文介绍了应用 LD 指数法测定脂滴 (LDs) 中甘油三酯 (微板块) 积累的灵敏的检测方法。获得了不带脂质提取的 LD 指数。它允许测量在不同条件下的高吞吐量实验中的 LDs 含量, 如富含或氮气耗尽介质的生长。尽管该方法首次被描述为研究酿酒酵母中的脂滴代谢, 它成功地应用于担子黑穗病玉米。有趣的是, 由于 LDs 是真核细胞 phylogenetically 保存的细胞器, 这种方法可以应用于大量的不同的干细胞, 从酵母到哺乳动物细胞。LD 指数是基于 BODIPY 493/503 在淬火条件下的液体荧光恢复试验 (LFR), 通过添加与甲醛固定的细胞.碘钾用作荧光淬火。荧光与光密度斜率的比值为 LD 指数。斜坡是计算的直线, 当 BODIPY 荧光和光学密度在 600 nm (OD600) 绘制的样本添加。最佳数据质量是由相关系数等于或高于 0.9 (r ≥ 0.9) 反映出来的。可以同时读取多个示例, 因为它可以在微板块中实现。由于 BODIPY 493/503 是一种脂溶性荧光染料, 分成脂肪滴, 它可以用于许多类型的细胞积累 LDs。

Introduction

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脂滴 (LDs) 是无处不在的细胞内脂肪体组成的核心中性脂, 主要是标签和甾醇酯 (SE)。核心周围有一层磷脂, 与蛋白质如 perilipin 和酶参与合成中性脂, 如甘油酰基转移酶, 乙酰基 coa 酶和酰 coa 综合体,1。由于其动态行为, 磷脂单层还含有水解标记和 SE2的三酰甘油脂肪酶。根据细胞类型和有机体, 储存中性脂可以用来产生能量, 或合成磷脂和信号分子。在酵母和其他真菌中, LDs 的含量随培养基中氮/碳比值的变化而变化, 表明氮的可用性降低可能是提高中性脂产量的关键3,4 ,5。在酵母中生产大量的标签, 在生物技术中作为生物燃料的来源和食品工业中有潜在的用途。一些储存的脂质含有高比例的多不饱和脂肪酸, 如欧米茄3和欧米茄 6, 营养和膳食重要性6,7,8,9,10,11. 包括人类细胞在内的哺乳动物细胞的 LDs 也含有标记和胆固醇酯。磷脂单层与酵母 LDs 中描述的蛋白质的哺乳动物同源性相互作用, 另外一种蛋白质, perilipin, 在酵母12中不存在。磷脂单层及其相关蛋白的一个建议作用是稳定 lds 结构, 并允许 lds 与细胞器的相互作用, 如线粒体、内质网、过氧化物酶体和液泡, 主要用于脂交换13,14。有趣的是, 在人类中, LDs 似乎参与了2型糖尿病, 动脉粥样硬化, 脂肪性肝炎和冠心病的病理, 其中有增加的数字15,16,17.某些类型的病毒使用 LDs 作为平台来组装病毒2,18,19

由于 lds 在人类病理中的影响及其潜在的生物技术应用, 对 lds 形成的精确实验测定是一项重要的任务。本文描述了一个可靠的检测方法的基础上恢复荧光 (LFR) 的 BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-波拉-3 a, 4 a-diaza s indacene), 以获得相对价值的中性脂在细胞中的含量。通过这种分析, 可以跟踪真菌中中性脂类积累的动态, 如U. 玉米酿酒酵母, 还有哺乳动物细胞, 不需要脂质提取20.该方法首次在酿酒酵母中应用, 以确定参与调节脂质代谢的蛋白磷酸和激酶。这是可能的, 不用油脂提取或蛋白质纯化21,22。LFR 也被用来建立腹腔巨噬细胞的 LDs 形成的动力学23。BODIPY 493/503 的使用比其他中性脂质染料有一定的优势, 如尼罗河红色。BODIPY 493/503 是高度特异的中性脂质和有一个狭窄的放射频谱, 促进同时检测的信号, 如红色荧光蛋白或图面-跟踪, 当样品分析的共焦显微镜。不幸的是, BODIPY 493/503 对漂白很敏感, 但在暴露于光24中使用 antiquenching 试剂可以避免此过程。

在酵母细胞中进行 LFR 测定, 在理想的营养条件下培养, 整除数在不同时间被提取。其次, 细胞是固定的甲醛, 这保持了 LDs 的完整性数月, 当细胞存储在4摄氏度。其他固定技术应避免, 特别是使用甲醇或冷丙酮, 因为它们导致 LDs 在细胞内的退化24。为了测量 LD 指数, 甲醛固定细胞悬浮在水中, 以获得明确的浓度。然后, 它们被添加到包含荧光 BODIPY 493/503 的解决方案中, 当荧光进入细胞并与 LDs 关联时, 它的荧光就会恢复。伴随荧光测量 (485 nm/510 nm), 细胞的浓度通过测量 600 nm 的光学密度来量化。每一个样品被读四次通过增加随后5µL 整除数甲醛固定的细胞悬浮到同样井。荧光和吸光度的空白在细胞的加法之前获得。通过确定测量的线性度来评估荧光和吸光度数据的质量: 如果 r < 0.9, 数据被丢弃。r 值是重要的, 因为基本上荧光强度应该产生一个线性反应, 以增加细胞浓度。如果细胞浓度过高, 线性度就会丢失。LFR 法为高通量实验中选择所需的 LD 表型提供了一种快速、简便、经济的方法。在选择所需条件后, 可以通过共焦显微镜对单个细胞的 LD 含量进行研究, 使用与 BODIPY 染色的相同的甲醛固定细胞, 提供细胞中 LDs 的图像。用薄层色谱法进一步分析了它们的标记和硒含量。

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Protocol

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1. 缓冲和解决方案的准备工作

  1. 制备 1 L 磷酸缓冲盐水 (PBS, pH 值 7), 溶解8克氯化钠, 0.2 克氯化钾, 1.44 克 Na2HPO4, 0.24 g 的馏分2PO4在800毫升的水。用 HCl 将 pH 值调整为 7.0, 然后在1升的最终容积中加水. PBS 可作为10x 库存解决方案, 并存储在室温下。
  2. 要准备10毫升的固定溶液, 添加1毫升37% 甲醛到9毫升的 PBS, 达到最后浓度的3.7%。请在使用前准备此解决方案。
    注意: 使用手套处理甲醛溶液。
  3. 为制备淬火溶液 (500 毫米), 在100毫升蒸馏水中溶解8.3 克。在使用前准备此解决方案, 并将其存储在室温下。
  4. 准备 BODIPY 10 毫米的溶液, 溶解10毫克的 BODIPY 493/503 在3.8 毫升的二甲基亚砜 (亚砜)。保持100µL 整除数在黑暗中, 在-70 摄氏度。
  5. 要准备 BODIPY 5 µM 淬火溶液, 添加1µL 10 毫米 BODIPY 493/503 至2毫升的500毫米淬火溶液。对于 LFR 化验, 需要最终浓度为5µM 的 BODIPY。
  6. 要准备矿物溶液, 请添加0.06 克 H3BO3, 0.14 克 MnCl2-4H2O, 0.4 g ZnCl2, 0.04 g 的 Na2MoO42H2o, 0.1 g FeCl36H2o 和 0.4 g 丘索4-5H2O 到1升蒸馏水。
  7. 准备盐溶液, 添加 16 g 的2PO4, 4 克的 Na2所以4, 8 g 的氯化钾, 2 克 MgSO4, 1 克的 CaCl2, 和8毫升的矿物溶液的 1 L 的蒸馏水。
  8. 为准备无氮源的最小培养基用于U. 玉米 FB2 (a2b2),将10克葡萄糖和62.5 毫升盐溶液添加到蒸馏水的1升, 根据节假日, et等。31. 将 pH 值调整为 7.0, 然后在250毫升烧瓶中分配100毫升的培养基, 并对其进行消毒。在液体循环或过滤灭菌时, 在 15 psi (1.05 公斤/厘米2) 上的高压釜为20分钟。
  9. 制备酵母蛋白胨葡萄糖培养基 (YPD), 添加5克的酵母萃取物, 2.5 克的蛋白胨, 5 克葡萄糖到1升的蒸馏水。在250毫升烧瓶中分配100毫升溶液, 并对其进行消毒。在液体循环或过滤灭菌时, 在 15 psi (1.05 公斤/厘米2) 上的高压釜为20分钟。

2. 培养条件和细胞固定

注意: 通过尽快修复单元格来保留 LDs 的结构。可在离心管内进行固定。固定的细胞可以保持在摄氏4摄氏度, 一个月, 如果脱水是避免留下一层薄薄的水。

  1. 在与该研究相关的文化条件下生长玉米细胞。启动具有初始 OD600 (1.15 x 106单元格/mL) 的区域性。孵化细胞在28°c, 180 rpm 24 小时。OD600的1对应于 2.3 x 107单元格/mL。
  2. 在选定的时间, 撤回单元格的整除。对于U. 玉米,在前8小时内每2小时提取5毫升。经过8小时的生长, 整除数2毫升就足够了。
  3. 测量每整除 600 nm 的光学密度。
  4. 用台式离心机将细胞悬浮在 1.4万 x g 处以1分钟为4摄氏度。放弃上清。
  5. 在1毫升的 PBS 甲醛3.7% 缓冲器中悬浮细胞的颗粒。室温下孵化细胞15分钟。
  6. 孵化后, 离心机的细胞悬浮在 1.4万 x g 1 分钟4摄氏度。放弃上清。
  7. 用类似的蒸馏水量 (1 毫升) 清洗细胞颗粒两次。离心机细胞悬浮在 1.4万 x g 1 分钟在4°c。每次洗涤步骤后都要丢弃上清液。
  8. 用蒸馏水 (等式 8) 将单元颗粒调整为 5 OD600 (1.15 x 101细胞/毫升)。
    Equation 1    等式1。
  9. 保持样品在4摄氏度, 直到它的使用。

3. 液体荧光恢复试验 (LFR)

  1. 打开分光光度计 Skanlt 软件。单击新会话, 然后选择开始, 然后Varioskan 莱克丝。从会话树中选择协议, 输入荧光波长的设置 (激发 485 nm/发射 510 nm; 光学密度 600 nm) 并选择自动光电倍增管增益。对于励磁带宽, 请选择 12 nm。在光学中, 选择顶部 (样品的激发是从井的顶部)。
  2. 进入一个温和和连续的鼓动 (300 转每分钟)。选择 "运行板出",暂停直到用户操作(用于将示例添加到油井的时间)。重复该协议五次。单击保存, 并在会话名称字段上为会话编写名称。该协议现在已准备好进行样本分析。
  3. 将 BODIPY 5 µM 淬火液的200µL 添加到96井黑底板的每一个井中。
  4. 将盘子放在分光光度计室内, 在30摄氏度孵育5分钟。从这一点上, 尽可能多地保护盘子不受光线的侵害。
  5. 单击开始按钮, 并读取与空白对应的荧光 (激发 485/发射 510) 和 OD600
  6. 在暂停时间内, 将甲醛固定细胞悬浮液的5µL 添加到井中。用吸管仔细地混合样品。将盘子放在分光光度计内, 然后单击继续。然后, 将根据上面设计的协议处理样品。
  7. 重复三连续增加的5µL 细胞悬浮。确保细胞不会沉淀。(图 1)。

4. LD 指数的计算

  1. 对于微板块中的每个样本, 绘制一个荧光和吸光度的图, 对每一个连续加法 (包括空白的5点) 的体积。在本研究中, 使用 Microsoft Excel 软件进行计算。要绘制数据, 请分别在数据表的第一、第二和第三列中输入卷、荧光和吸光度数据。然后, 使用游标选择整个数据, 单击 "插入并选择 (XY) 散点"。
  2. 为图表中的每一行选择点, 并在选定的显示公式框中插入相应的趋势线。根据等式 2, 写下两条直线的斜率值:
    Equation 2    等式2
    其中 y = 荧光或光密度, x = 样本量 (0、5、10、15、20µL)、 m = 荧光或光密度线的斜率, 以及 b = y 截距。
  3. 将荧光线的斜率除以光密度线的斜率, 得到 LD 指数, 方程3。
    Equation 3    等式3
    LD 指数对应于荧光和光密度斜率的商。

5. 数据质量分析

  1. 计算每条直线的相关系数: 单击函数向导(fx), 然后选择CORREL。如果 r < 0.9, 丢弃数据并重复读数。如果 r ≥ 0.9, 读数是可靠的。

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Representative Results

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LFR, 与 BODIPY 493/503 作为荧光探针是一个可靠和容易的方法来研究 LDs 在U. 玉米,的动态积累, 无论生长条件如何。当细胞在 YPD 培养基中培养时, LD 指数在指数阶段增加, 其次是固定相的下降 (图 2A)。与此相反, 在氮饥饿下生长的细胞中, LD 指数在指数和固定相位上都有稳步增加 (图 2B)。由于两种区域性都是以相同的光密度 (类似的细胞数) 开始的, 结果显示 LFR 检测的高容量检测脂质含量的微小变化 (图 2)。通过共焦显微镜证实了该方法的灵敏度: YPD 细胞在整个细胞中含有许多小的 lds, 而在氮饥饿的情况下, 有一个重要的生产大 lds, 通常每单元 4-5 LDs (图 2,右面板 A 和 B 分别)。由于 ld 指数不是中性脂质含量的绝对值, 因此应建立与 ld 指数与甘油三酯量有关的标准曲线。该方法用于研究酵母20中标记合成的动态。根据每条标准曲线, LFR 法可用于测定细胞内脂质积累率。

在 soraphen a (乙酰 CoA 酶的特定抑制剂) 的存在下, 可以遵循 LD 指数, 这种酶对于在 LDs25中存储的标记中所包含的脂肪酸的合成是必不可少的。在没有氮源的情况下, 该抑制剂被添加到培养基中, 在2小时的生长后, 细胞显示出较高的脂质积累率 (图 2B)。根据酵母中的以前报告,添加了 soraphen, 导致 LD 累积的完全抑制 (图 2B, 浅蓝色) 20,21

为了进一步研究 LDs 在玉米中的动员, 在氮饥饿状态下生长的细胞被转移到了 YPD-介质 (图 3)。LD 指数随指数函数递减。24小时后, LD 指数达到了类似的值, 在 YPD 培养基培养的细胞中观察到, 没有氮缺乏的压力 (图 2A)。由于细胞能够动员在氮饥饿期间积累的 LDs, 结果表明标签的内容减少。在研究磷酸脂代谢调节的过程中, 对酵母也有类似的反应 (21)。

Figure 1
图 1: LFR 中涉及的步骤的示意图表示形式.培养条件的步骤对玉米酵母具有代表性, 但可以适应其他微生物或细胞类型。URF, 恢复荧光单位;bd, bidistilled 水。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:玉米中脂滴积累的动力学酵母细胞生长在 YPD 培养基中, 收获和悬浮在 (A) 新鲜 YPD 培养基 (左上板) 或 (B) 最小培养基无氮源 (左下板-深蓝色)。在氮饥饿条件下, 在2小时的生长 (B、浅蓝色) 后, 在培养基中加入 192 nM soraphen A 抑制 LD 指数的增加。n=3, 数据是平均的电子扫描电镜。右面板: 在24小时 (A) 顶部的细胞中, LDs 的共聚焦显微镜: YPD 细胞。(B) 底部面板: 没有氮源的细胞。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: LDs 动员.酵母细胞生长在 YPD 培养基中, 在新鲜 YPD 中收获和生长为 24 h (对照) 或在最小培养基中没有氮源72小时, 然后转移到新鲜的 YPD 培养基中, 并孵化额外的 24 h. 整除数被撤回在指示时间为两种文化衡量的动员 LDs 由 LFR。数据由指数衰减方程 (y = A·ekt) 安装。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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LFR 是首次应用于研究酵母中脂质代谢的新方法, 后来在U. 玉米20,21中成功实现。虽然 ld 指数并没有给出细胞中累积的标记的绝对值, 但它为细胞的脂质含量提供了一个快速的概念, 当比较两个或多个实验条件的 LD 指数时, 对数据的解释是直截了当的。BODIPY 493/503 是高度特异的中性脂, 主要成分的 LDs, 它有一个狭窄的发射频谱, 以促进同时检测其他信号来自染料, 如图面-跟踪或小脑蓝当细胞被共焦研究显微学26。与许多荧光分子一样, BODIPY 493/503 在荧光显微实验中对漂白敏感, 但在暴露于光照27期间加入抗漂白试剂可以降低这个过程。总之, BODIPY 493/503 可用于多种细胞研究中性脂质的积累和动员21,22,23,28,29

要使方法正常工作, 必须考虑到某一点。由于 OD600用于计算 LD 指数, 因此在实验过程中细胞的形态学不应发生根本性的变化。细胞内成分的保存也是关键的一步, 这种保存应该包括 LDs, 这是本议定书的主要目标。用合适的化合物固定细胞是非常重要的, 对于这种方法应用到许多类型的细胞没有任何问题。在这里, 我们用甲醛来修复细胞的结构;醛反应与蛋白质的氨基小组。据报道, 其他醛也保留了广泛的细胞结构, 似乎没有重大变化的蛋白质结构24,26。甲醛的一个缺点是它在线粒体和核膜附近诱导小膜损伤和液泡形成, 但是, 这些负面效应是所有醛固定方法中常见的26。应该避免像甲醇或丙酮这样的有机溶剂, 因为它们会降解细胞中的 LDs。有机溶剂的固定是基于蛋白质的脱水和沉淀, 可以被认为是一个负面的影响。此外, 有机溶剂的使用与非特异染色有关。

与任何其他技术一样, LD 指数检测在实施到其他系统时可能有限制。BODIPY 在真菌细胞壁上扩散的问题, 荧光对脂肪酸组成的依赖性, 血脂的类型和胞内脂质体内蛋白质含量的变化30, 排除了标记量的比较在不同的物种之间, 甚至在不同的营养条件下生长的相同细胞。此外, 大的形态学变化, 如过渡到菌丝或絮凝的细胞是一些问题, 可以找到。

LD 指数法是一种高通量的方法, 需要很短的时间, 少量的生物质和反应物。试验结果可靠, 所得数据准确, 重现性好。此外, 它还为研究药物中脂质代谢的动态提供了指导, 它可能成为生物技术中用于生产生物燃料或饲料油的油质生物的高通量筛选的工具。

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Disclosures

作者没有什么可透露的

Acknowledgments

这项工作得到了 Politécnico 国立 Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864)、方案 de 支持农场 Proyectos-Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-国立大学国立墨西哥的赠款的支持 (UNAM) 和委员会 Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP 和 256520-GGS)。Fundação de 宪法保护 Pesquisa 做里约热内卢 (FAPERJ Cientistas 做 Nosso: E 26/103.353/2011)。我们感谢 QFB。奥斯卡豪尔赫·伊万·莫拉·戈多伊 Luqueño Bocardo 为示意图概述。我们感谢米格尔博士 Tapia 罗德里格斯在 LDs 的共焦显微术中的宝贵帮助。我们要感谢布鲁诺 Bozaquel Morais 博士在开发酵母技术方面的开创性工作, 我们已经适应了U. 玉米

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

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References

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真菌病原体液体荧光恢复法测定脂质指数<em>黑穗病玉米</em>
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Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

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