Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להשיג את השומנים droplet אינדקס (אינדקס LD) ללמוד את הדינמיקה של triacylglycerols בתאים בתרבית בניסויים תפוקה גבוהה. LD אינדקס וזמינותו היא שיטה קלה ומהימנה של המשתמשת BODIPY 493/503. Assay הזה אינו צריך שאיבת השומנים dispendious או ניתוח מיקרוסקופ.

Abstract

המאמר מראה כיצד ליישם את הבדיקה אינדקס LD, אשר הוא רגיש microplate assay כדי לקבוע את הצטברות triacylglycerols (TAGs) בטיפות השומנים (LDs). אינדקס LD מתקבל ללא חילוץ השומנים. היא מאפשרת מדידה התוכן LDs בניסויים תפוקה גבוהה בתנאים שונים כגון צמיחה עשיר או חנקן דלה מדיה. אף על פי השיטה שתוארה לראשונה לחקור את חילוף החומרים של השומנים droplet של האפייה, הוחל בהצלחה אל basidiomycete פחמון זקן התירס. מעניין לציין, כי LDs organelles phylogenetically שמור ב התאים האיקריוטים, השיטה וניתן להחילם למגוון גדול של תאים, מ שמרים בתרבית של תאים. מדד LD מבוססת על וזמינותו שחזור פלורסצנטיות נוזלי (LFR) של BODIPY 493/503 בתנאים שכבתה, על ידי התוספת של תאים קבוע עם פורמלין. יוד האשלגן משמש כ'חטיף זריחה. היחס בין זריחה על המדרונות צפיפות אופטית נקרא מדד LD. מדרונות מחושבים מתוך הקווים ישרים מתקבל כאשר BODIPY פלורסצנטיות, צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) מותוות נגד מדגם תוספת. איכות הנתונים אופטימלית משתקף על ידי מקדמי המתאם שווה או מעל 0.9 (r ≥ 0.9). מספר דוגמאות ניתן לקרוא בו זמנית כמו זה ניתן להטמיע את microplate. מאחר BODIPY 493/503 פלורסנט lipophilic לצבוע את המחיצות לתוך טיפות השומנים, ניתן להשתמש בסוגים רבים של תאים שנצברים LDs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השומנים טיפות (LDs) הינם גופים שומן תאיים בכל מקום מורכב גרעין של שומנים נייטרלי, בעיקר תגיות, סטרול אסטרים (SE). הליבה מוקף טפט של פוספוליפידים המקיימת אינטראקציה עם חלבונים כמו perilipin ואנזימים המעורבים הסינתזה של שומנים נייטרלי, כגון diacylglycerol ליפיד-טרנספראז, אצטיל קואנזים a קרבוקסילאז ו ליפיד-CoA סינתאז1. בשל התנהגות דינמית שלה, טפט פוספוליפיד מכיל גם lipases triacylglycerol זה hydrolyze תגיות ו- SE2. בהתאם לסוג התא באורגניזם, ליפידים נייטרלי מאוחסנות יכול לשמש כדי לייצר אנרגיה, או לסנתז phospholipids ו מולקולות איתות. שמרים ופטריות אחרים, התוכן של LDs משתנה בתגובה בווריאציות יחס פחמן/חנקן בתקשורת תרבות, המציין כי חנקן ירידה בזמינות עשוי להיות המפתח כדי להגדיל את השומנים נייטרלי ייצור3,4 ,5. הייצור של כמויות גבוהות של תגים בשמרים יש שימוש פוטנציאלי בביוטכנולוגיה כמקור של דלק ביולוגי, בתעשיית המזון. כמה שומנים מאוחסנות מכילים הפרופורציות גבוהה של חומצות שומן רב בלתי רווי, כמו אומגה 3 ואומגה 6, עם חשיבות התזונתיים וההתפתחותיים 6,7,8,9,10 , 11. LDs בתרבית של תאים, כולל תאים אנושיים, גם להכיל תגי ואסטרים כולסטרול. טפט פוספוליפיד אינטראקציה עם מידע יונקים הומולוגיים של החלבונים שמתואר שמרים LDs, ועם חלבון נוסף, perilipin, אשר נעדר cerevisiae ס12. אחד הציע תפקיד עבור טפט פוספוליפיד וחלבונים הקשורים שלה הוא לייצב את המבנה LDs ולאפשר את האינטראקציה של תעודות זהות עם organelles כמו המיטוכונדריה, רשתית תוך-פלזמית, peroxisomes וקואלות, בעיקר עבור exchange השומנים 13,14. מעניין, בבני אדם, LDs מופיעים להיות מעורב פתולוגיות כמו סוכרת מסוג 2, טרשת עורקים, steatohepatitis מחלת לב כלילית, בהם יש גידול שלהם מספר 15,16,17 . כמה סוגים של וירוסים להשתמש LDs פלטפורמות להרכיב את18, 2,virions19.

בשל ההשלכות של זיהוי פתולוגיות האנושי ולהשתמש ביוטכנולוגי הפוטנציאלי שלהם, בקביעה ניסויית המדויק של היווצרות LDs היא משימה חשובה. מאמר זה מתאר וזמינותו אמין המבוסס על החזרתה של זריחה (LFR) של BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-בורה-3a, 4a-diaza-s-indacene), כדי לקבל ערך היחסי של התוכן של ליפידים נייטרלי בתאים. עם זה assay, זה אפשרי לעקוב אחר הדינמיקה של ההצטברות של שומנים נייטרלי בפטריות כמו זקן התירס בארצות הברית ו cerevisiae ס, וגם בתרבית של תאים, ללא הצורך של השומנים החילוץ 20. השיטה הוחל לראשונה ב cerevisiae ס כדי לזהות את חלבון phosphatases, kinases מעורב ברגולציה של חילוף החומרים של השומנים. זה היה אפשרי ללא שאיבת שומנים בדם או חלבון טיהור21,22. LFR גם שימש כדי לבסס את הדינמיקה של היווצרות LDs מקרופאגים הצפק23. השימוש של BODIPY 493/503 יש כמה יתרונות לעומת אחרים צבעים ניטרליים השומנים כמו הנילוס אדום. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי ליפידים נייטרליים ויש ספקטרום פליטה צר, הקלת הגילוי סימולטני של אותות צבע כמו חלבון פלואורסצנטי אדום או Mito-גשש, כאשר הדגימות מנותחים על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. למרבה הצער, רגיש/ה photobleaching BODIPY 493/503, אך תהליך זה ניתן למנוע על-ידי שימוש של ריאגנט antiquenching במהלך חשיפה אור24.

כדי לבצע את הבדיקה LFR בתאים שמרים, הם בתרבית בתנאים תזונתי הרצוי, aliquots הם מסוגר בזמנים שונים. בשלב הבא, תאים קבועים עם פורמלין, השומרת על היושרה של LDs חודשים כאשר תאים מאוחסנים ב 4 º C. טכניקות קיבוע אחרות יש להימנע, במיוחד אלה באמצעות מתנול או אצטון קר, שכן הן יובילו ההשפלה של LDs בתוך תאים24. כדי למדוד את האינדקס LD, תאים פורמלדהיד-קבוע מושעים במים בריכוז מוגדרים. לאחר מכן, הם מתווספים פתרון המכיל את fluorophore BODIPY 493/503 מתרצה מאת KI, כאשר fluorophore חודרים לתא ומשייך תעודות זהות, יש החלמה של זריחה שלה. במקביל למדידה קרינה פלואורסצנטית (485 nm/510 ננומטר), הריכוז של תאים הוא לכמת על ידי מדידת צפיפות אופטית על 600 ננומטר. כל מדגם נקראים ארבע פעמים על-ידי הוספת אותו aliquots µL 5 עוקבות של השעיה תא פורמלדהיד-קבוע טוב. כדורי סרק של זריחה, ספיגת נרכש לפני התוספת של תאים. האיכות של זריחה ואת הנתונים ספיגת יוערכו על-ידי קביעת על ליניאריות של המדידות: אם r < 0.9, הנתונים יימחקו. הערך חשוב כי בעיקרון עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך לייצר תגובה לינארית הגדלת ריכוזים התא. אם התא ריכוז גבוה מדי, ליניאריות אובד. וזמינותו LFR מספק שיטה מהירה, פשוטה וכלכלית כדי לבחור את פנוטיפ LD הרצוי בניסויים תפוקה גבוהה. לאחר בחירת התנאים הרצויים, LD התוכן של תאים בודדים ניתן יהיה ללמוד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית, באמצעות פורמלין-קבוע לאותם תאים מוכתם BODIPY, מתן תמונה של LDs בתא. שלהם תגים ותוכן SE יכול עכשיו להיות בהמשך נותחו על ידי שכבה דקה כרומטוגרפיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת מאגרי ופתרונות

  1. להכנת 1 ליטר של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS, pH 7), לפזר 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של אשלגן כלורי, 1.44 גר' נה2HPO4, 0.24 גר' ח'2PO4 ב- 800 מ ל מים distillated. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם HCl, ולאחר מכן להוסיף מים עבור אמצעי אחסון הסופי של PBS ל' 1 ניתן בתפקיד 10 x פתרון מניות, בטמפרטורת החדר.
  2. כדי להכין 10 מ"ל של תיקון פתרון, להוסיף 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד 9 מ של PBS להגיע ריכוז סופי של 3.7%. להכין פתרון זה רק לפני השימוש.
    התראה: שימוש בכפפות כדי להתמודד עם הפתרון פורמלדהיד.
  3. כדי להכין את שכבתה-הפתרון (500 מ מ), לפזר 8.3 g של קי ב- 100 מ של מים מזוקקים. להכין את הפתרון הזה לפני השימוש ולאחסן אותה בטמפרטורת החדר.
  4. כדי להכין פתרון מניות BODIPY 10 מ מ, לפזר 10 מ ג של BODIPY 493/503 ב מ 3.8 ל דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). להשאיר 100 µL aliquots באפלה ב-70 מעלות צלזיוס.
  5. כדי להכין BODIPY 5 מיקרומטר שכבתה פתרון, להוסיף 1 µL 10 מ מ BODIPY מ 493/503-2 ל 500 מ מ שכבתה פתרון. עבור LFR וזמינותו, נדרש ריכוז הסופי של 5 מיקרומטר של BODIPY.
  6. כדי להכין את הפתרון מינרלי, להוסיף 0.06 גרם של H3בו3, 0.14 גר' MnCl2-4 H2O, 0.4 g של ZnCl2, g 0.04 של נה2MoO4-2 H2O, 0.1 g של FeCl3-6 H2O ו- 0.4 גר' CuSO 4-5 H2O ל- 1 ליטר של מים מזוקקים.
  7. כדי להכין את תמיסת מלח, להוסיף 16 גר'2פו ח'4, 4 g של Na2כדי4, 8 גרם של אשלגן כלורי, 2 גר' MgSO4, 1 גר' CaCl2ו- 8 מ של מינרלים לפתרון 1 ליטר של מים מזוקקים.
  8. כדי להכין את המדיום מינימלי ללא מקור חנקן עבור U. זקן התירס FB2 (a2b2), להוסיף 10 גרם של גלוקוז ושל 62.5 מ"ל של תמיסת מלח 1 ליטר של מים מזוקקים, על-פי הולידיי, et al. 31. להתאים את ה-pH אל 7.0 ואז לוותר על 100 מ של אמצעי התקשורת מבחנות 250 מ ל, לעקר אותם. אוטוקלב כעשרים דקות בבית 15 psi (1.05 ק ג/cm2) מחזור נוזלי או מסנן לחטא.
  9. כדי להכין המדיום דקסטרוז peptone שמרים (YPD), הוסף 5 גר' שמרים לחלץ, 2.5 גר' peptone, ו- 5 גר' גלוקוז כדי 1 ליטר של מים מזוקקים. לוותר על 100 מ של הפתרון ב- 250 מ ל מבחנות ולחטא אותם. אוטוקלב כעשרים דקות בבית 15 psi (1.05 ק ג/cm2) מחזור נוזלי או מסנן לחטא.

2. תרבות מצבו ואת קיבוע תאים

הערה: לשמר את המבנה של תעודות זהות על ידי תיקון התאים בהקדם האפשרי. הקיבעון יכול להיעשות microcentrifuge צינורות. תאים קבוע ניתן לשמור ב 4 ° C עד לחודש אם התייבשות נמנעת להשאיר שכבה דקה של מים.

  1. לגדל זקן התירס בארצות הברית תאים בתנאים תרבות הרלוונטיים לצורך המחקר. נתחיל את התרבות יתר ראשונית600 של 0.05 (1.15 × 106 תאים / mL). דגירה התאים ב 28 ° C, סל ד 180 במשך 24 שעות ביממה. יתר600 1 מקביל 2.3 × 107 תאים / מ ל.
  2. ב שנבחר פעמים, לסגת aliquot של התאים. עבור U. זקן התירס, לסגת מ ל כל 2 h במהלך הראשון 8 שעות. אחרי 8 שעות של צמיחה, aliquots של 2 מ ל הם מספיק.
  3. מודדים את צפיפות אופטית על 600 nm של כל aliquot.
  4. Centrifuge התליה תא-14,000 g x עבור 1 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגה שולחן. למחוק את תגובת שיקוע.
  5. להשעות בגדר של התאים ב- 1 מ"ל PBS-פורמלדהיד 3.7% המאגר. דגירה התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. לאחר הדגירה, centrifuge התליה תא-14,000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע.
  7. לשטוף את צניפה תאים פעמיים עם נפח דומה של מים מזוקקים (1 מ"ל). Centrifuge התליה תא-14,000 g x עבור 1 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. למחוק את תגובת שיקוע לאחר כל שלב כביסה.
  8. להתאים בגדר תא כדי 5 OD600 (1.15 x 108 תאים / מ ל) עם מים (משוואה 1) מזוקקים.
    Equation 1    משוואה 1.
  9. לשמור את הדגימה ב 4 ° C עד השימוש.

3. נוזלי פלורסצנטיות שחזור Assay (LFR)

  1. להפעיל את ספקטרופוטומטרים ופתחו את תוכנת Skanlt. לחץ על חדש הפעלה, ובחרו ' התחל ולאחר מכן Varioskan Lux. בחר פרוטוקול מן העץ הפעלה, הזן את ההגדרות עבור אורכי הגל קרינה פלואורסצנטית (עירור 485 nm/פליטה 510 ננומטר; צפיפות אופטית 600 ננומטר) ובחר רווח אוטומטי האופטיקה. עירור רוחב פס, בחר 12 ננומטר. המערכת האופטית, בחר העליון (עירור של המדגם הוא מהחלק העליון של הבאר).
  2. הזן של עצבנות עדינה ורציפה (300 סל ד). לבחור להפעיל את הצלחת לצאת עד ה משתמש בפעולת השהיה (זמן המשמש עבור התוספת של המדגם לבארות). חזור על הפרוטוקול חמש פעמים. לחץ על שמור וכתוב שם עבור ההפעלה על השדה שם הפעלה. הפרוטוקול מוכן כעת עבור הניתוחים דגימות.
  3. להוסיף 200 µL מיקרומטר BODIPY 5-מתרצה לפתרון כל טוב של צלחת התחתון טוב שחור-נקי 96.
  4. למקם את הצלחת בתוך החדר ספקטרופוטומטרים, דגירה 5 דקות ב 30 º C. מנקודה זו, להגן על צלחת מאור במידת האפשר.
  5. לחץ על הלחצן התחל , לקרוא את קרינה פלואורסצנטית (עירור 485/פליטה 510) ואת ה OD600 התואם החסר.
  6. להוסיף 5 µL של התליה תא פורמלדהיד-קבוע הבארות במהלך זמן השהיה. מערבבים את הדוגמאות בזהירות עם פיפטה. לשים את הצלחת בתוך ספקטרופוטומטרים ' ולחץ על ' המשך'. לאחר מכן, הדגימות יעובדו לפי הפרוטוקול תוכנן לעיל.
  7. חזור על שלוש תוספות רצופים של 5 µL תא השעיה. ודא כי התאים לא לזרז. (איור 1).

4. חישובים של מדד LD

  1. כל מדגם microplate, מגרש גרף של זריחה, ספיגת כנגד הנפח של כל הוספה רצופים (5 נקודות כולל הריק). במחקר זה, השתמש בתוכנת Microsoft Excel עבור החישובים. כדי להתוות את הנתונים, הזן את עוצמת הקול, קרינה פלואורסצנטית ונתונים ספיגת הראשון, השני והשלישי עמודה בגליון הנתונים, בהתאמה. לאחר מכן, בחר את הנתונים כולה עם הסמן, לחץ על הוסף ובחר פיזור (XY).
  2. בחר את הנקודות עבור כל קו הגרף ולהוסיף בהתאמה קו המגמה כאשר התיבה הצג משוואה מסומנת. תכתוב את הערכים של המדרונות של שני הקווים ישרים, על פי משוואה 2:
    Equation 2    משוואה 2
    איפה y = זריחה או צפיפות אופטית, x = נפח דגימה (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = שיפוע של זריחה או קו צפיפות אופטית, b = חיתוך-y.
  3. לחלק את השיפוע של קו זריחה מאת השיפוע של קו צפיפות אופטית כדי לקבל מדד LD, משוואה 3.
    Equation 3    משוואה 3
    מדד LD מקביל המנה של קרינה פלואורסצנטית ומדרונות צפיפות אופטית.

5. נתונים ותמרוקים

  1. חשב את מקדם המתאם של כל קו ישר: לחץ על אשף פונקציה (fx) ובחרו CORREL. אם r < 0.9, למחוק את הנתונים וחזור על הקריאות. אם r ≥ 0.9, קריאות אמינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LFR, עם BODIPY 493/503 כמו החללית פלורסנט היא שיטה אמין וקל ללמוד הצטברות דינמי של זיהוי זקן התירס בארצות הברית, ללא קשר לתנאי הגידול. כאשר התאים היו תרבותי YPD-בינוני, חלה עלייה במדד LD במהלך שלב מעריכית, ולאחריו ירידה בשלב נייח (איור 2 א). לעומת זאת, בתאי גדל תחת חנקן הרעבה, הייתה עלייה קבועה באינדקס LD בשלבים שני מעריכי, נייח (איור 2B). כי שתי תרבויות הופעלו עם הצפיפות האופטית אותו (דומה מספר תאים), התוצאות מציגות את קיבולת גבוהה של וזמינותו LFR כדי לזהות שינויים קטנים בתוכן השומנים (איור 2). רגישות השיטה היה שחלקית מיקרוסקופיה קונפוקלית: תאי-YPD מכילות LDs קטנים רבים ברחבי כל התא, בעוד תחת חנקן הרעב היה הייצור החשוב של LDs גדולים, בדרך כלל 4-5 תעודות זהות לכל התאים, (איור 2, נכון לוחות A ו- B, בהתאמה). מאז מדד LD אינה בערכו המוחלט של התוכן השומנים נייטרלי, יש אפשרות לבנות עיקול רגיל הנוגעות מדד LD עם הכמות של triacylglycerols. בגישה זו נעשה שימוש כדי ללמוד את הדינמיקה של תגיות הסינתזה cerevisiae ס20. על סמך כל עקומה סטנדרטי, וזמינותו LFR ניתן היה קבוע קצב הצטברות השומנים בתאים.

מדד LD ניתן בעקבות בנוכחות soraphen A, מעכב ספציפי של אצטיל קואנזים a קרבוקסילאז, אנזים חיוני לסינתזה של חומצות שומן הכלול התגים מאוחסנים LDs25. החומר המדכא נוספה המדיום תרבות לאחר שעתיים של צמיחת בהיעדר מקור חנקן, מצב שבו תאים הראו שיעור גבוה יותר של הצטברות שומנים בדם (איור 2B). על פי הדיווחים הקודמים cerevisiae ס, התוספת של soraphen-A גרמו עיכוב מלא של LD הצטברות (איור 2B, תכלת) 20,21.

להמשיך לחקור הגיוס של זיהוי זקן התירס בארצות הברית, תאים גדל תחת חנקן רעב במשך 72 h הועברו YPD-בינוני (איור 3). אינדקס LD ירד בעקבות פונקציה מעריכית. לאחר 24 שעות, הגיע מדד LD ערכים דומה לזה שנצפה בתאים תרבותי YPD-בינוני בלי הלחץ של היעדרות חנקן (איור 2 א). מאז התאים היו מסוגלים לגייס את LDs שנצבר במהלך הרעב חנקן, התוצאה מרמזת על צמצום תוכן תגיות. תגובה דומה דווח על cerevisiae ס במהלך המחקר של phosphatases מעורב בוויסות חילוף החומרים של השומנים21.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של הצעדים הכרוכים LFR. השלבים של תרבות תנאים נציג עבור U. זקן התירס שמרים אך ניתן להתאים מיקרואורגניזם או סוג של תאים אחרים. URF, יחידות של זריחה שחזור; bd, מים bidistilled. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: הדינמיקה של השומנים הצטברות טיפות ב זקן התירס U. . תאי שמרים היו גדל במשך 24 שעות ביממה YPD-בינוני, שנקטפו והחזיקה ב- YPD (א) טריים-בינוני (החלונית השמאלית העליונה) או בינוני (ב) מינימלי ללא מקור חנקן (כחול לוח-כהה השמאלי התחתון). תחת חנקן הרעבה, עליית מדד LD היה מעוכבים על-ידי הוספת nM 192 soraphen A בתקשורת תרבות לאחר שעתיים של צמיחה (B, תכלת). n = 3, הנתונים אינם זאת אומרת ± ב- SEM. לוח נכון: מיקרוסקופיה קונפוקלית של LDs בתא נקצרו ה 24 (א) הדף פאנל: YPD-תאים. (ב) בתחתית החלונית: תאים ללא מקור חנקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: גיוס LDs. תאי שמרים היו גדל במשך 24 שעות ביממה YPD-בינוני, שנקטפו, גדלו ב YPD טריים במשך 24 שעות ביממה (בקרה) או מינימלי בינונית ללא מקור חנקן במשך 72 h, ולאחר מכן הועברו לבינונית טרי-YPD ו מודגרות עבור ה 24 נוספים Aliquots היו מופנמים הצביעו זמני עבור שתי תרבויות למדוד את הגיוס של תעודות זהות על-ידי LFR. הנתונים היה מצויד ידי משוואה דעיכה מעריכית (y = A·e-קאפה -טאו). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LFR היא שיטה שהוחל בפעם הראשונה ללמוד מטבוליזם השומנים ב cerevisiae ס ומעלה זה היה בהצלחה מיושמת ב- U. זקן התירס20,21. למרות מדד LD אינו נותן בערכו המוחלט של תגי שהצטברו בתאים, הוא מספק רעיון מהיר של התוכן השומנים של תאים, הפרשנות של הנתונים היא פשוטה כאשר אינדקס LD מתנאי הניסוי שניים או יותר מושווים. BODIPY 493/503 הוא מאוד ספציפי שומנים נייטרלי, המרכיב העיקרי של תעודות זהות, ויש בו ספקטרום פליטה צר הקלת הגילוי סימולטני של אותות אחרים מגיעים צבעים כמו Mito-tracker או CMAC כחול כאשר תאים נלמדים על ידי קונפוקלי מיקרוסקופ26. כמו הרבה מולקולות פלורסנט, BODIPY 493/503 רגישה photobleaching במהלך ניסויים מיקרוסקופ פלורסצנטיות, אבל ניתן להקטין את התהליך הזה על-ידי הוספת אנטי photobleaching ריאגנטים במהלך החשיפה עד אור27. לסיכום, ניתן להשתמש BODIPY 493/503 ללמוד את הצטברות והתגייסות של ליפידים נייטרלי21,22,23,28,29במגוון רחב של תאים.

עבור פעולת השירות יפעל כהלכה, בשלב כלשהו חייב להילקח בחשבון. כי ה OD600 משמש לחישוב מדד LD, המורפולוגיה של תאי לא צריך שינויים רדיקליים במהלך הניסוי. שימור המרכיבים תאיים במהלך הקיבעון של תאים גם הוא שלב קריטי, שימור זו צריכה לכלול את תעודות זהות, אשר המטרה העיקרית של פרוטוקול זה. תיקון התאים עם תרכובת המתאימה חשוב מאוד של יישום שיטה זו עבור סוגים רבים של תאים ללא כל בעיה. כאן השתמשנו פורמלדהיד לתקן את המבנים של התאים; אלדהיד מגיב עם קבוצות אמינו של חלבונים. בעבר דווח aldehydes אחרים גם לשמר את המבנים של מגוון רחב של תאים. ונראה שלא יהיו שינויים משמעותיים בחלבון מבנה24,26. חיסרון של פורמלדהיד הוא זה גורם נזק הממברנה קטן, חלולית היווצרות ליד את מיטוכונדריאלי גרעיני ממברנות, אבל אלה השפעות שליליות המשותפות שיטות קיבוע אלדהיד כל26. יש להימנע ממיסים אורגניים כמו מתנול או אצטון כי הם לבזות את LDs בתאים. קיבוע עם ממיסים אורגניים מבוסס על התייבשות, משקעים של חלבונים, אשר יכול להיחשב השפעה שלילית. בנוסף, השימוש של הממס האורגני משויכת שאינם ספציפיים מכתים.

כמו כל טכניקה אחרת, וזמינותו אינדקס LD אולי יש מגבלות כאשר מיושמת למערכות אחרות. בעיות בפעפוע של BODIPY על פני קיר התא פטרייתי, התלות של זריחה הרכב חומצות השומן, את סוג ליפידים ואת התוכן של חלבונים תאיים השומנים גופות30, למנוע את ההשוואה כמות תגיות בין מינים שונים או אפילו עם אותם התאים גדלו בתנאים תזונתיים שונים. בנוסף, שינויים מורפולוגיים גדולים כמו: מעבר תפטיר או flocculation של תאים הן חלק מהבעיות שניתן למצוא.

LD אינדקס וזמינותו היא שיטה תפוקה גבוהה הדורשת לזמנים קצרים וכמויות קטנות של ביומסה, המגיבים. הבדיקה אמינה, ויש הנתונים שהתקבלו לשחזור ומדויקים. בנוסף, הוא מספק הנחיות עבור המחקר על הדינמיקה של חילוף החומרים של השומנים ברפואה, שזה הפך כלי בביוטכנולוגיה להקרנה תפוקה גבוהה של האורגניזם השמנונית הייצור של דלק ביולוגי או להאכיל שמנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין שום גילוי

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים אינסטיטוטו Politécnico Secretaria נאסיונאל דה Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Apoyo דה פרוגרמה e Proyectos דה Investigación Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(אוניברסיטת נאסיונאל Autónoma de México UNAM), ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnología (CONACyT 254904-JPP ו- 256520-GGS). Fundação דה אמפרו Pesquisa לעשות את ריו דה ז'ניירו (FAPERJ-Cientistas לעשות Nosso Estado: E 26/103.353/2011). אנחנו הודות QFB. אוסקר Iván Luqueño Bocardo עבור סקירה סכמטי. אנו מודים ד ר מיגל Tapia רודריגס על העזרה יקר מיקרוסקופיה קונפוקלית של תעודות זהות. אנו מאחלים תודה ד ר ברונו Bozaquel Morais על עבודתו החלוצית בחקר פיתוח הטכניקה cerevisiae ס זה אנחנו מותאם זקן התירס בארצות הברית.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122, (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25, (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100, (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14, (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59, (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8, (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831, (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90, (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63, (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7, (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21, (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121, (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5, (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35, (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283, (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81, (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10, (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17, (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6, (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. Plenum. New York. 575-595 (1974).
השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות <em>זקן התירס פחמון</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter