कवक रोगज़नक़ में तरल प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा लिपिड सूचकांक निर्धारण Ustilago मेडिस
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन लिपिड छोटी बूंद सूचकांक (LD सूचकांक) को प्राप्त करने के लिए उच्च प्रवाह प्रयोगों में प्रसंस्कृत कोशिकाओं में triacylglycerols की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए । LD सूचकांक परख एक आसान और विश्वसनीय तरीका है कि BODIPY 493/503 का उपयोग करता है । इस परख dispendious लिपिड निष्कर्षण या माइक्रोस्कोपी विश्लेषण की जरूरत नहीं है ।
Abstract
लेख दिखाता है कि कैसे LD सूचकांक परख है, जो एक संवेदनशील microplate परख के लिए triacylglycerols के संचय (टैग) लिपिड बूंदों (LDs) में निर्धारित है को लागू करने के लिए । LD सूचकांक लिपिड निष्कर्षण के बिना प्राप्त की है । यह विभिंन स्थितियों के तहत उच्च प्रवाह प्रयोगों में LDs सामग्री जैसे अमीर या नाइट्रोजन घट मीडिया में वृद्धि के रूप में मापने की अनुमति देता है । हालांकि विधि पहली बार के लिए Saccharomyces cerevisiae में लिपिड छोटी बूंद चयापचय का अध्ययन करने के लिए वर्णित किया गया था, यह सफलतापूर्वक basidiomycete Ustilago मेडिसकरने के लिए लागू किया गया था । दिलचस्प है, और क्योंकि LDs organelles phylogenetically eukaryotic कोशिकाओं में संरक्षित कर रहे हैं, विधि कोशिकाओं की एक बड़ी विविधता के लिए लागू किया जा सकता है, खमीर से स्तनधारी कोशिकाओं के लिए । LD सूचकांक BODIPY 493/503 के तरल प्रतिदीप्ति रिकवरी परख (LFR) शमन शर्तों के तहत, formaldehyde के साथ तय की कोशिकाओं के अलावा द्वारा पर आधारित है. पोटेशियम आयोडीन एक प्रतिदीप्ति शमन के रूप में प्रयोग किया जाता है । प्रतिदीप्ति और ऑप्टिकल घनत्व ढलानों के बीच अनुपात LD सूचकांक नाम है । ढलानों जब BODIPY प्रतिदीप्ति और 600 एनएम (ओडी600) पर ऑप्टिकल घनत्व नमूना अतिरिक्त के खिलाफ साजिश रची जाती है प्राप्त सीधे लाइनों से गणना कर रहे हैं । इष्टतम डेटा गुणवत्ता सहसंबंध गुणांक के बराबर या ऊपर 0.9 (r ≥ 0.9) द्वारा प्रतिबिंबित है । कई नमूने एक साथ पढ़ा जा सकता है के रूप में यह एक microplate में लागू किया जा सकता है । चूंकि BODIPY 493/503 एक lipophilic फ्लोरोसेंट डाई कि लिपिड बूंदों में विभाजन है, यह कोशिकाओं है कि LDs जमा के कई प्रकार में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
लिपिड बूंदों (LDs) सर्वव्यापी intracellular वसा शरीर तटस्थ लिपिड के एक कोर से बना रहे हैं, मुख्य रूप से टैग और स्टेरोल एस्टर (एसई) । कोर फॉस्फोलिपिड के एक monolayer से घिरा हुआ है जो perilipin और तटस्थ लिपिड के संश्लेषण में शामिल एंजाइमों जैसे प्रोटीन के साथ इंटरैक्ट करता है, जैसे कि diacylglycerol acyl-ट्रांस्फ़्रेज़, एसिटाइल-CoA carboxylase और acyl-CoA सिंथेस1। अपने गतिशील व्यवहार के कारण, फॉस्फोलिपिड monolayer भी triacylglycerol lipases शामिल है कि hydrolyze टैग और एसई2। कोशिका के प्रकार और जीव पर निर्भर करता है, तटस्थ लिपिड संग्रहीत करने के लिए ऊर्जा उत्पंन किया जा सकता है, या संश्लेषित फॉस्फोलिपिड और संकेत अणुओं । खमीर और अंय कवक में, संस्कृति मीडिया में नाइट्रोजन/कार्बन अनुपात में बदलाव के जवाब में LDs परिवर्तन की सामग्री, यह दर्शाता है कि कम नाइट्रोजन उपलब्धता को तटस्थ लिपिड उत्पादन में वृद्धि की कुंजी हो सकती है3,4 ,5. खमीर में टैग की उच्च मात्रा का उत्पादन जैव ईंधन के स्रोत के रूप में और खाद्य उद्योग में बायोटेक्नोलॉजी में एक संभावित उपयोग किया है । कुछ संग्रहीत लिपिड पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड के उच्च अनुपात होते हैं, ओमेगा 3 और ओमेगा 6 की तरह, पोषण और आहार महत्व के साथ 6,7,8,9,10 , 11. स्तनधारी कोशिकाओं के LDs, मानव कोशिकाओं सहित, भी टैग और कोलेस्ट्रॉल एस्टर होते हैं । फॉस्फोलिपिड monolayer खमीर LDs में वर्णित प्रोटीन के स्तनधारी मुताबिक़ के साथ बातचीत, और एक अतिरिक्त प्रोटीन, perilipin, जो एस cerevisiae12में अनुपस्थित है के साथ । एक फॉस्फोलिपिड monolayer और उसके जुड़े प्रोटीन के लिए प्रस्तावित भूमिका के लिए lds संरचना को स्थिर और mitochondria, endoplasmic जालिका, peroxisomes, और रिक्तिकाएं के रूप में organelles के साथ lds की बातचीत की अनुमति है, लिपिड एक्सचेंज के लिए मुख्य रूप से 13,14. दिलचस्प है, मनुष्यों में, LDs प्रकार की तरह विकृतियों में शामिल होने के लिए प्रकट 2 मधुमेह, atherosclerosis, steatohepatitis, और कोरोनरी हृदय रोग, जिसमें उनकी संख्या में वृद्धि 15है,16,17 . वायरस के कुछ प्रकार के प्लेटफार्मों के रूप में LDs का उपयोग करें virions 2,18,19इकट्ठा ।
मानव विकृतियों और उनके संभावित तकनीकी उपयोग में lds के निहितार्थ के कारण, lds गठन के सटीक प्रयोगात्मक निर्धारण एक महत्वपूर्ण काम है । इस लेख का वर्णन एक विश्वसनीय प्रतिदीप्ति की वसूली पर आधारित परख (LFR) के BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-बोरा-ए, 4a-diaza-एस-indacene), कोशिकाओं में तटस्थ लिपिड की सामग्री का एक रिश्तेदार मूल्य प्राप्त करने के लिए । इस परख के साथ, यह संभव है कि यू मेडिस और एस cerevisiaeजैसे कवक में तटस्थ लिपिड के संचय की गतिशीलता का पालन करें, और भी स्तनधारी कोशिकाओं में, लिपिड निष्कर्षण 20की आवश्यकता के बिना। विधि cerevisiae में पहली बार के लिए लागू किया गया था प्रोटीन phosphatases और kinases लिपिड चयापचय के विनियमन में शामिल की पहचान करने के लिए । यह लिपिड निष्कर्षण या प्रोटीन शुद्धि21,22के बिना संभव था । LFR भी पेरिटोनियल मैक्रोफेज23में LDs गठन की गतिशीलता स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । BODIPY 493/503 का उपयोग नील लाल के रूप में अंय तटस्थ लिपिड रंजक से अधिक कुछ लाभ है । BODIPY 493/503 तटस्थ लिपिड के लिए अत्यधिक विशिष्ट है और एक संकीर्ण उत्सर्जन स्पेक्ट्रम है, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन या मिळो-tracker की तरह रंजक से संकेतों का एक साथ पता लगाने की सुविधा, जब नमूनों फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । दुर्भाग्य से, BODIPY 493/503 photobleaching के प्रति संवेदनशील है, लेकिन इस प्रक्रिया को प्रकाश24के लिए जोखिम के दौरान एक antiquenching एजेंट का उपयोग करके बचा जा सकता है ।
बाहर खमीर कोशिकाओं में LFR परख ले, वे वांछित पोषण की स्थिति के तहत संस्कृति रहे हैं, और aliquots अलग समय पर वापस ले रहे हैं । अगले, कोशिकाओं formaldehyde, जो महीनों के लिए LDs की अखंडता को बरकरार रखता है जब कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित कर रहे है के साथ तय कर रहे हैं । अंय निर्धारण तकनीक से बचना चाहिए, विशेष रूप से उन मेथनॉल या ठंड एसीटोन का उपयोग कर, क्योंकि वे24कोशिकाओं के भीतर LDs के क्षरण के लिए सीसा । LD सूचकांक को मापने के लिए, formaldehyde-फिक्स्ड कोशिकाओं को एक परिभाषित एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पानी में निलंबित कर रहे हैं । फिर, वे एक fluorophore BODIPY 493/503 के द्वारा बुझती है युक्त समाधान के लिए जोड़ रहे हैं, और जब fluorophore सेल और LDs के साथ सहयोगियों में प्रवेश करती है, वहां अपनी प्रतिदीप्ति की वसूली है । प्रतिदीप्ति माप (485 एनएम/510 एनएम), कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए सहवर्ती 600 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा quantified है । प्रत्येक नमूना एक formaldehyde-फिक्स्ड सेल निलंबन के बाद 5 µ एल aliquots जोड़कर चार बार एक ही अच्छी तरह से पढ़ा है । कोशिकाओं के जोड़ से पहले प्रतिदीप्ति और अवशोषित के रिक्त स्थान प्राप्त कर रहे हैं । प्रतिदीप्ति की गुणवत्ता और अवशोषक डेटा माप की रैखिकता का निर्धारण करके मूल्यांकन कर रहे हैं: यदि r < 0.9, डेटा छोड़ दिया जाता है । r मान महत्वपूर्ण है क्योंकि मूल रूप से प्रतिदीप्ति की तीव्रता सेल सांद्रता बढ़ाने के लिए एक रैखिक प्रतिक्रिया का उत्पादन करना चाहिए । यदि कक्ष एकाग्रता बहुत अधिक है, रैखिकता खो जाती है । LFR परख उच्च प्रवाह प्रयोगों में वांछित LD phenotype का चयन करने के लिए एक तेज, सरल और आर्थिक विधि प्रदान करता है । वांछित शर्तों का चयन करने के बाद, व्यक्तिगत कोशिकाओं के LD सामग्री फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, एक ही formaldehyde-फिक्स्ड BODIPY के साथ दाग कोशिकाओं का उपयोग कर, सेल में LDs की एक छवि प्रदान करते हैं । उनके टैग और एसई सामग्री अब आगे पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR एक उपंयास विधि है कि पहली बार के लिए एस cerevisiae में लिपिड चयापचय का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था और बाद में इसे सफलतापूर्वक मेडिस20,21में लागू किया गया था । ld अनुक्रमणिका क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम पलाश Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-२०१७०८६४), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117) द्वारा समर्थित था-Universidad Nacional Autónoma de México ( उणां), व Consejo Nacional डे Ciencia y Tecnología (CONACyT २५४९०४-JPP व २५६५२०-GGS). Fundação de Amparo a Pesquisa do रियो डी जनेरियो (FAPERJ-Cientistas do Nosso Estado: E 26/103.353/2011) । हम QFB के लिए धंयवाद । योजनाबद्ध सिंहावलोकन के लिए ऑस्कर Iván Luqueño Bocardo. हम LDs के फोकल माइक्रोस्कोप में बहुमूल्य मदद के लिए Dr. Miguel टापिया Rodríguez धंयवाद । हम एस cerevisiae में तकनीक विकसित करने में अपने अग्रणी काम के लिए डॉ ब्रूनो Bozaquel मोरैस शुक्रिया अदा करना चाहता हूं कि हम यू. मेडिसके लिए अनुकूलित ।
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
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