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Biochemistry

Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso Ustilago Maydis

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'indice di gocciolina del lipido (indice di LD) per studiare la dinamica dei triacilgliceroli in cellule coltivate in esperimenti di alto-rendimento. Il dosaggio di indice di LD è un metodo facile e affidabile che utilizza BODIPY 493/503. Questo test non necessita di estrazione lipidica dispendious o analisi di microscopia.

Abstract

L'articolo viene illustrato come implementare l'analisi di indice di LD, che è un test sensibile micropiastra per determinare l'accumulo di trigliceridi (tag) in goccioline del lipido (LDs). Indice di LD è ottenuto senza estrazione lipidica. Esso permette di misurare il contenuto di LDs negli esperimenti di alto-rendimento in condizioni diverse, come la crescita in ricchi o media di azoto impoverito. Anche se il metodo è stato descritto per la prima volta di studiare il metabolismo di gocciolina del lipido in Saccharomyces cerevisiae, è stato applicato con successo per il basidiomicete Ustilago maydis. Interessante, e perché LDs sono organelli filogeneticamente conservati nelle cellule eucariotiche, il metodo può essere applicato a una grande varietà di cellule, da lievito per cellule di mammifero. L'indice di LD è basato sull'analisi di recupero liquido di fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 in condizioni di tempra, con l'aggiunta di cellule fissato con formaldeide. Lo iodio potassio è usato come un quencher di fluorescenza. Il rapporto fra la fluorescenza e i pendii di densità ottica è denominato indice di LD. Piste sono calcolate da linee rette ottenute quando BODIPY fluorescenza e densità ottica a 600 nm (OD600) vengono confrontate con aggiunta dei campioni. Qualità ottimale dei dati si riflette dai coefficienti di correlazione pari o sopra 0,9 (r ≥ 0,9). Campioni multipli possono essere letti contemporaneamente, poiché può essere implementata in una micropiastra. Poiché BODIPY 493/503 è un fluorescente lipofilico tingere che partizioni nelle gocce di lipidi, può essere utilizzato in molti tipi di cellule che si accumulano LDs.

Introduction

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Le goccioline del lipido (LDs) sono corpi grassi intracellulari onnipresenti composti da un nucleo di lipidi neutri, principalmente tag ed esteri dello sterolo (SE). Il nucleo è circondato da un monostrato di fosfolipidi che interagisce con le proteine come perilipina ed enzimi coinvolti nella sintesi di lipidi neutri, come il diacilglicerolo acil-transferasi, acetil-CoA carbossilasi e acil-CoA sintasi1. A causa del suo comportamento dinamico, strato monomolecolare del fosfolipide contiene anche triacilglicerolo lipasi che idrolizzano tag e SE2. A seconda del tipo di cellula e l'organismo, stored lipidi neutri possono essere utilizzati per generare energia, o sintetizzano fosfolipidi e molecole di segnalazione. In lieviti e altri funghi, il contenuto di LDs cambia in risposta a variazioni nel rapporto carbonio/azoto in terreni di coltura, che indica che la disponibilità di azoto in diminuzione potrebbe essere la chiave per aumentare la produzione di lipidi neutri3,4 ,5. La produzione di elevate quantità di tag in lievito ha un potenziale impiego in biotecnologia come fonte di biocarburanti e nell'industria alimentare. Alcuni lipidi stored contengono proporzioni elevate degli acidi grassi polinsaturi, come omega 3 e omega 6, con dietetica e nutrizionale 6,7,8,9,10 , 11. LDs di cellule di mammiferi, tra cui le cellule umane, anche contenere tag ed esteri del colesterolo. Il monostrato di fosfolipide interagisce con i mammiferi omologo delle proteine descritto nel lievito LDs e con una proteina supplementare, Perilipina, che è assente in S. cerevisiae12. Una proposta di ruolo per il monostrato di fosfolipidi e le proteine associate è per stabilizzare la struttura LDs e consentire l'interazione di LDs con organelli come mitocondri, reticolo endoplasmatico, peroxisomes e vacuoli, principalmente per lo scambio dei lipidi 13,14. È interessante notare che, negli esseri umani, LDs sembrano essere coinvolti in patologie come il diabete di tipo 2, aterosclerosi, steatoepatite e malattia coronarica, in cui vi è un aumento nel loro numero di 15,16,17 . Alcuni tipi di virus utilizzano LDs come piattaforme per assemblare i virioni 2,18,19.

Dovuto le implicazioni della SSL in patologie umane e loro potenziale utilizzo biotecnologica, l'esatta determinazione sperimentale della formazione di LDs è un compito importante. Questo articolo descrive un'analisi affidabile basata sul recupero della fluorescenza (LFR) di BODIPY 493/503 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentametil-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), per ottenere un valore relativo del contenuto di lipidi neutri in cellule. Con questa analisi, è possibile seguire le dinamiche dell'accumulo di lipidi neutri in funghi come U. maydis e S. cerevisiaee anche in cellule di mammifero, senza la necessità di lipidi estrazione 20. Il metodo è stato applicato per la prima volta in S. cerevisiae per identificare le proteine fosfatasi e chinasi coinvolte nella regolazione del metabolismo dei lipidi. Ciò era possibile senza estrazione dei lipidi o proteine purificazione21,22. LFR è stato utilizzato anche per stabilire le dinamiche di formazione di LDs in macrofagi peritoneali23. L'uso di BODIPY 493/503 ha alcuni vantaggi rispetto ad altri coloranti di lipidi neutri come Nilo rosso. BODIPY 493/503 è altamente specifico per lipidi neutri e con uno spettro di emissione stretto, facilitando la rilevazione simultanea di segnali da coloranti come proteina fluorescente rossa o Mito-Tracking, quando i campioni sono analizzati mediante microscopia confocale. Purtroppo, BODIPY 493/503 è sensibile al photobleaching, ma questo processo può essere evitato utilizzando un reagente antiquenching durante l'esposizione a luce24.

Per eseguire il test LFR in cellule di lievito, che vengono allevati nelle condizioni nutrizionali desiderate, e le aliquote siano revocate in momenti diversi. Successivamente, le cellule sono fissate con formaldeide, che preserva l'integrità della LDs per mesi quando le cellule sono conservate a 4 ° C. Altre tecniche di fissaggio dovrebbero essere evitati, soprattutto quelli che utilizzano metanolo o acetone freddo, poiché conducono alla degradazione di LDs nelle cellule24. Per misurare l'indice di LD, formaldeide-fisso cellule sono sospese in acqua per ottenere una concentrazione definita. Quindi, vengono aggiunti a una soluzione che contiene il fluoroforo BODIPY 493/503 bonificato di KI, e quando il fluoroforo entra nella cella e associa il LDs, c'è una ripresa della sua fluorescenza. Concomitante alla misurazione della fluorescenza (485 nm/510 nm), la concentrazione di cellule è quantificata misurando la densità ottica a 600 nm. Ogni campione viene letto quattro volte con l'aggiunta di successivi 5 aliquote µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso per lo stesso bene. Spazii in bianco di fluorescenza e di assorbanza sono acquisite prima dell'aggiunta delle cellule. La qualità della fluorescenza e i dati di assorbanza sono valutati determinando la linearità delle misurazioni: se r < 0,9, i dati vengono eliminati. Il valore di r è importante perché fondamentalmente l'intensità della fluorescenza deve produrre una risposta lineare a concentrazioni crescenti di cella. Se la concentrazione delle cellule è troppo alta, la linearità viene persa. Il dosaggio LFR fornisce un metodo veloce, semplice ed economico per selezionare il fenotipo desiderato di LD in esperimenti di alto-rendimento. Dopo aver selezionato le condizioni desiderate, il contenuto di LD di singole celle possa essere studiato mediante microscopia confocale, utilizzando le stesse cellule di formaldeide-fisso macchiate con BODIPY, fornendo un'immagine di LDs nella cella. Tag e il loro contenuto SE ora può essere ulteriormente analizzati mediante cromatografia su strato sottile.

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Protocol

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1. preparazione del buffer e soluzioni

  1. Per preparare 1 L di fosfato tampone (PBS, pH 7), sciogliere 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4, 0,24 g di KH2PO4 in 800 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7.0 con HCl e poi aggiungere acqua per un volume finale di 1 L. PBS può essere fatto come una soluzione di riserva di 10x e conservato a temperatura ambiente.
  2. Per preparare 10 mL di soluzione di fissaggio, aggiungere 1 mL di formaldeide al 37% o 9 mL di PBS per raggiungere una concentrazione finale del 3,7%. Preparare la soluzione prima dell'uso.
    Attenzione: Utilizzare guanti per gestire la soluzione di formaldeide.
  3. Per preparare la soluzione di tempra (500 mM), sciogliere 8,3 g di KI in 100 mL di acqua distillata. Preparare questa soluzione prima dell'uso e conservarle a temperatura ambiente.
  4. Per preparare la soluzione di riserva di BODIPY 10 mM, sciogliere 10 mg di BODIPY 493/503 in 3,8 mL di solfossido dimetilico (DMSO). Mantenere le aliquote di 100 µ l al buio a-70 ° C.
  5. Per preparare la soluzione di BODIPY 5 µM-tempra, aggiungere 1 µ l di 10 mM BODIPY 493/503-2 mL di 500 mM tempra di soluzione. Per il dosaggio LFR, una concentrazione finale di 5 µM di BODIPY è richiesta.
  6. Per preparare la soluzione minerale, aggiungere 0,06 g di H3BO3, 0,14 g di MnCl2-4 H2O, 0,4 g di ZnCl2, 0,04 g di Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g di FeCl3-6 H2O e 0,4 g di CuSO 4-5h2O a 1 L di acqua distillata.
  7. Per preparare la soluzione di sale, aggiungere 16 g di KH2PO4, 4 g di Na2modo4, 8 g di KCl, 2 g di MgSO4, 1 g di CaCl2e 8 mL di soluzione minerale a 1 L di acqua distillata.
  8. Per preparare il terreno minimo senza una fonte di azoto per U. maydis FB2 (a2b2), aggiungere 10 g di glucosio e 62,5 mL di soluzione salina a 1 L di acqua distillata, secondo Holliday, et al. 31. aggiustare il pH a 7.0 e quindi versare 100 mL di media in matracci da 250 mL e sterilizzarli. Sterilizzare in autoclave per 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) il ciclo liquido o filtro.
  9. Per preparare il mezzo di lievito peptone destrosio (YPD), aggiungere 5 g di lievito estratto, 2,5 g di peptone, e 5 g di glucosio a 1 L di acqua distillata. Dispensare 100 mL della soluzione in matracci da 250 mL e sterilizzarli. Sterilizzare in autoclave per 20 min a 15 psi (1,05 kg/cm2) il ciclo liquido o filtro.

2. cultura condizione e fissazione delle cellule

Nota: Conservare la struttura di LDs fissando le cellule appena possibile. Il fissaggio può essere fatto in microcentrifuga. Celle fisse possono essere mantenute a 4 ° C fino ad un mese se la disidratazione è evitata lasciando un sottile strato d'acqua.

  1. U. maydis cellule in condizioni di coltura crescere pertinenti per lo studio. Avviare la cultura con un iniziale OD600 di 0.05 (1,15 × 106 cellule / mL). Incubare le cellule a 28 ° C, 180 giri/min per 24 h. Un OD600 di 1 corrisponde a 2,3 × 107 cellule / mL.
  2. Ai selezionati volte, prelevare un'aliquota delle cellule. Per U. maydis, prelevare 5 mL ogni 2 h durante le prime 8 ore. Dopo 8 ore di crescita, le aliquote di 2 mL sono sufficienti.
  3. Misurare la densità ottica a 600 nm di ciascuna aliquota.
  4. Centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C, utilizzando una centrifuga da tavolo. Scartare il surnatante.
  5. Sospendere il pellet di cellule in 1 mL di PBS-formaldeide 3,7% tampone. Incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente.
  6. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  7. Lavare il pellet di cellule due volte con un simile volume di acqua distillata (1 mL). Centrifugare la sospensione cellulare a 14.000 x g per 1 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante dopo ogni fase di lavaggio.
  8. Regolare il pellet cellulare a 5 OD600 (1,15 x 108 cell / mL) con acqua distillata acqua (equazione 1).
    Equation 1    Equazione 1.
  9. Conservare il campione a 4 ° C fino al suo utilizzo.

3. analisi di fluorescenza di liquido recupero (LFR)

  1. Accendere lo spettrofotometro e aprire il software di Skanlt. Fare clic su nuova sessionee scegliere Avvia e quindi Varioskan Lux. Selezionare protocollo dall'albero della sessione, immettere le impostazioni per le lunghezze d'onda di fluorescenza (eccitazione 485 nm/emissione 510 nm; densità ottica 600 nm) e scegliete guadagno automatico fotomoltiplicatore. Per larghezza di banda di eccitazione, selezionare 12 nm. Nell'ottica, seleziona top (eccitazione del campione è dalla parte superiore del pozzo).
  2. Immettere una delicata e continua agitazione (300 giri/min). Selezionare RUN piastra OUTe Pausa fino a quando l'azione dell'utente (tempo impiegato per l'aggiunta del campione nei pozzetti). Ripetere il protocollo cinque volte. Fare clic su Salva e scrivere un nome per la sessione sul Campo nome sessione. Il protocollo è ora pronto per l'analisi di campioni.
  3. Aggiungere 200 µ l della BODIPY 5 µM - estiguuto soluzione in ciascun pozzetto di una piastra 96 ben nero-chiaro inferiore.
  4. Posizionare la piastra all'interno della camera di spettrofotometro e incubare per 5 minuti a 30 ° C. Da questo punto, proteggere la piastra dalla luce quanto più possibile.
  5. Fare clic sul pulsante START e leggere la fluorescenza (eccitazione 485/emissione 510) e il OD600 corrispondente per gli spazii in bianco.
  6. Aggiungere 5 µ l di sospensione cellulare formaldeide-fisso ai pozzetti durante la pausa. Mescolare accuratamente i campioni con la pipetta. Mettere la piastra all'interno dello spettrofotometro e fare clic su continua. Quindi, i campioni saranno trattati secondo il protocollo progettato sopra.
  7. Ripetere tre aggiunte successive di 5 µ l di sospensione cellulare. Assicurarsi che le celle non precipitare. (Figura 1).

4. calcolo dell'indice LD

  1. Per ciascun campione in micropiastra, tracciare un grafico della fluorescenza e assorbanza contro il volume di ogni successiva aggiunta (5 punti tra cui il vuoto). In questo studio, è necessario utilizzare software Microsoft Excel per i calcoli. Per tracciare i dati, immettere il volume, fluorescenza e dati di assorbanza nella prima, seconda e terza colonna del foglio dati, rispettivamente. Quindi, selezionare tutti i dati con il cursore, fare clic su Inserisci e selezionare a dispersione (XY).
  2. Selezionare i punti per ogni linea nel grafico e inserire la rispettiva Linea di tendenza con la casella Visualizza equazione selezionata. Annotare i valori delle piste delle due linee rette, secondo l'equazione 2:
    Equation 2    Equazione 2
    Dove y = fluorescenza o densità ottica, x = volume del campione (0, 5, 10, 15, 20 µ l), m = pendenza della fluorescenza o linea di densità ottica e b = intercetta.
  3. Dividere la pendenza della retta di fluorescenza dalla pendenza della linea densità ottica per ottenere l'indice di LD, equazione 3.
    Equation 3    Equazione 3
    L'indice di LD corrisponde al quoziente della fluorescenza e piste di densità ottica.

5. analisi dei dati qualità

  1. Calcolare il coefficiente di correlazione di ogni linea retta: fare clic su Creazione guidata funzione (fx) e scegliete la correlazione. Se r < 0,9, scartare i dati e ripetere le letture. Se r ≥ 0.9, letture sono affidabili.

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Representative Results

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LFR, con BODIPY 493/503 come la sonda fluorescente è un metodo semplice e affidabile per studiare l'accumulo dinamico di LDs in U. maydis, a prescindere le condizioni di crescita. Quando le cellule sono state coltivate nel terreno di YPD, c'era un aumento nell'indice LD durante la fase esponenziale, seguito da un declino in fase stazionaria (Figura 2A). Al contrario, in cellule coltivate in fame di azoto, c'era un costante aumento nell'indice di LD in entrambe le fasi stazionarie ed esponenziale (Figura 2B). Perché entrambe le culture sono state avviate con la stessa densità ottica (numero simile di cellule), i risultati mostrano l'elevata capacità del dosaggio LFR per rilevare piccole variazioni nel contenuto lipidico (Figura 2). La sensibilità del metodo è stata confermata da microscopia confocale: YPD-celle contengono molti piccoli LDs in tutta l'intera cellula, mentre sotto la fame di azoto ci fu un'importante produzione di grandi LDs, in genere 4-5 LDs per cellule, (Figura 2, proprio pannelli A e B, rispettivamente). Poiché l'indice di LD non è un valore assoluto del tenore di lipidi neutri, deve essere costruita una curva standard relativi all'indice di LD con la quantità di triacilgliceroli. Questo approccio è stato utilizzato per studiare la dinamica della sintesi tag in S. cerevisiae20. Basato su ogni curva standard, il dosaggio LFR può essere utilizzato per determinare il tasso di accumulazione del lipido in cellule.

L'indice di LD possa essere seguito in presenza di soraphen A, un inibitore specifico di acetil-CoA carbossilasi, un enzima che è essenziale per la sintesi degli acidi grassi contenuti nei tag memorizzati in LDs25. L'inibitore è stato aggiunto al terreno di coltura dopo 2 h di crescita in assenza di una fonte di azoto, una condizione in cui le cellule hanno mostrato il più alto tasso di accumulo di lipidi (Figura 2B). Secondo i rapporti precedenti in S. cerevisiae, l'aggiunta di soraphen-A ha provocato l'inibizione completa di LD accumulo (Figura 2B, blu chiaro) 20,21.

Per indagare ulteriormente la mobilitazione di LDs in U. maydis, cellule coltivate in fame di azoto per 72 h sono state trasferite a YPD-medio (Figura 3). LD è diminuita a seguito di una funzione esponenziale. Dopo 24 h, l'indice di LD ha raggiunto valori simili a quello osservato in cellule coltivate in YPD-medium senza lo stress di assenza di azoto (Figura 2A). Poiché le cellule erano in grado di mobilitare il LDs accumulato durante l'inedia di azoto, il risultato suggerisce una riduzione nel contenuto del tag. Una risposta simile è stata segnalata per S. cerevisiae durante lo studio delle fosfatasi coinvolti nella regolazione del metabolismo di lipidi21.

Figure 1
Figura 1: rappresentazione schematica dei passaggi coinvolti nel LFR. I passaggi di condizioni di coltura sono rappresentativi per U. maydis lievito ma possono essere adattati ad altri microrganismi o tipo di cellule. URF, unità di recupero fluorescenza; BD, acqua bidistillata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: dinamica di accumulo di goccioline di lipidi in U. maydis. Cellule di lievito sono state coltivate per 24 h nel mezzo di YPD, raccolte e sospeso nel mezzo di YPD (A) fresco (pannello di sinistra superiore) o in medium (B) minimo senza una fonte di azoto (inferiore sinistro pannello-colore blu scuro). Sotto fame di azoto, l'aumento nell'indice di LD è stata inibita aggiungendo 192 nM soraphen A nel mezzo di coltura dopo 2 h di crescita (B, blu chiaro). n = 3, i dati sono la media ± SEM Pannello di destra: microscopia confocal di LDs nella cella raccolte a 24 h. (A) pannello superiore: YPD-cellule. (B) pannello inferiore: cellule senza una fonte di azoto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: LDs mobilitazione. Cellule di lievito sono state coltivate per 24 h nel mezzo di YPD, raccolte e coltivate in fresco YPD per 24 h (controllo) o in minimo medio senza una fonte di azoto per 72 h, poi trasferito al mezzo fresco-YPD e incubate per altre 24 h. aliquote sono stati ritirati presso l'indicato volte per entrambe le culture misurare la mobilizzazione di LDs di LFR. Dati è stati montati da un'equazione del decadimento esponenziale (y = A·e-kt). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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LFR è un nuovo metodo che è stato applicato per la prima volta studiare il metabolismo dei lipidi in S. cerevisiae e versioni successive è stato correttamente implementato in U. maydis20,21. Anche se l'indice di LD non dà valore assoluto dei tag accumulati nelle cellule, esso fornisce una rapida idea del contenuto lipidico delle cellule, e l'interpretazione dei dati è semplice, quando vengono confrontati con indice di LD da due o più condizioni sperimentali. BODIPY 493/503 è altamente specifico per lipidi neutri, il componente principale di LDs, ed ha un stretto spettro di emissione facilitando la rilevazione simultanea di altri segnali provenienti da coloranti come Mito-tracker o CMAC blu quando le cellule sono studiate da confocale la microscopia26. Come molte molecole fluorescenti, BODIPY 493/503 è sensibile al photobleaching durante gli esperimenti di microscopia di fluorescenza, ma questo processo può essere diminuito aggiungendo anti photobleaching reagenti durante l'esposizione a luce27. In sintesi, utilizzabile in una vasta gamma di cellule BODIPY 493/503 per studiare l'accumulazione e la mobilizzazione dei lipidi neutri21,22,23,28,29.

Per il metodo funzionare correttamente, un certo punto deve tener conto. Poiché il OD600 viene utilizzato per il calcolo dell'indice LD, la morfologia delle cellule non dovrebbe avere cambiamenti radicali durante l'esperimento. La conservazione dei componenti intracellulari durante la fissazione delle cellule inoltre è un passaggio fondamentale, e tale conservazione dovrebbe includere il LDs, che sono l'obiettivo principale del presente protocollo. Fissare le cellule con un composto appropriato è molto importante per l'applicazione di questo metodo per molti tipi di cellule senza alcun problema. Qui, abbiamo usato la formaldeide per correggere le strutture delle cellule; l'aldeide reagisce con i gruppi amminici delle proteine. È stato segnalato che altre aldeidi anche preservare le strutture di una vasta gamma di celle e sembra che non ci sono cambiamenti significativi nella struttura della proteina24,26. Uno svantaggio di formaldeide è che induce danno della membrana piccola e formazione di vacuolo vicino mitocondriale e membrane nucleari, ma, questi effetti negativi sono comuni a tutti i aldeide fissazione metodi26. Solventi organici come metanolo o acetone dovrebbero essere evitati perché si degradano il LDs nelle cellule. Fissazione con solventi organici si basa sulla disidratazione e la precipitazione delle proteine, che può essere considerato un effetto negativo. Inoltre, l'uso di solventi organici è associato con colorazione aspecifica.

Come qualsiasi altra tecnica, il dosaggio di indice LD potrebbe avere limitazioni quando implementato ad altri sistemi. Problemi nella diffusione di BODIPY attraverso la parete cellulare fungina, la dipendenza della fluorescenza della composizione in acidi grassi, il tipo di lipidi e il contenuto di proteine all'interno dei lipidi intracellulari corpi30, osta a che il confronto tra la quantità di tag tra le diverse specie o anche con le stesse cellule coltivate in condizioni nutrizionali diverse. Inoltre, grandi cambiamenti morfologici quali la transizione al micelio o flocculazione delle cellule sono alcuni dei problemi che si possono trovare.

LD indice analisi è un metodo di alto-rendimento che richiede tempi brevi e piccole quantità di biomassa e reagenti. Il test è affidabile, e i dati ottenuti sono accurati e riproducibili. Inoltre, fornisce le linee guida per la ricerca sulla dinamica del metabolismo dei lipidi in medicina, e potrebbe diventare uno strumento in biotecnologie per lo screening di alto-rendimento dell'organismo oleaginosa per la produzione di biocarburanti o mangimi oli.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a divulgazione

Acknowledgments

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y integrados (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-(Universidad Nacional Autónoma de México UNAM) e il Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP e 256520-GGS). Fundação de Amparo un Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-scienziati do Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Abbiamo grazie QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo per la descrizione schematica. Ringraziamo il dottor Miguel Tapia Rodríguez per l'aiuto prezioso nella microscopia confocal di LDs. Desideriamo ringraziare il Dr. Bruno Bozaquel Morais per il suo lavoro pionieristico nello sviluppo della tecnica in S. cerevisiae che abbiamo adattato per U. maydis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Determinazione indice del lipido di recupero liquido di fluorescenza nel agente patogeno fungoso <em>Ustilago Maydis</em>
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Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

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