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Biochemistry

곰 팡이 병원 체 Ustilago Maydis 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

여기, 우리가 셀 높은 처리량 실험에서 경작된에 triacylglycerols의 역학을 공부 하는 지질 작은 물방울 인덱스 (LD)를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. LD 인덱스 분석 결과 BODIPY 493/503을 사용 하는 쉽고 안정적인 방법입니다. 이 분석 결과 dispendious 지질 추출 또는 현미경 분석 필요 하지 않습니다.

Abstract

문서는 triacylglycerols (태그) 지질 작은 물방울 (LDs)에서 축적을 결정 하는 민감한 microplate 분석 결과 LD 인덱스 분석 결과 구현 하는 방법을 보여 줍니다. LD 인덱스 지질 추출 없이 얻은 것입니다. 그것은 풍부한 성장 또는 질소 고갈 미디어와 같은 다른 조건 하에서 높은 처리량 실험에서 LDs 콘텐츠 측정 있습니다. 메서드가 Saccharomyces cerevisiae 에 지질 작은 물방울 대사 연구를 처음으로 기술 되었다 쓰 신 담 Ustilago maydis에 성공적으로 적용 되었다. 흥미롭게도, LDs 세포 진 핵 세포에 phylogenetically 보존 하기 때문에 메서드를 적용할 수 있는 셀의 큰 다양성에 누 룩을 포유류 세포에서. LD 인덱스 기반 액체 형광 복구 분석 결과 (LFR)의 BODIPY 493/503 냉각 조건 하에서 포 름 알 데히드. 고정 셀의 추가 의해 칼륨 요오드 형광 끄는로 사용 됩니다. 형광 및 광학 밀도 슬로프 사이 비율 LD 인덱스를 이름입니다. 사면 때 얻은 직선에서 계산 됩니다 BODIPY 형광 및 광학 밀도 600 nm (OD600) 샘플 추가 대해 그려집니다. 최적의 데이터 품질 0.9 (r ≥ 0.9) 이상 동일한 상관 관계 계수에 의해 반영 된다. 미 판에서 구현 될 수 있습니다 여러 샘플을 동시에 읽을 수 있습니다. 이므로 BODIPY 493/503 닥터지 형광 염색 그 파티션을 지질 작은 물방울으로, 많은 유형의 LDs 누적 셀에 사용할 수 있습니다.

Introduction

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지질 작은 물방울 (LDs)는 중성 지질, 주로 태그와 sterol 에스테 르 (SE)의 핵심의 구성 하는 유비 쿼터 스 세포내 지방 시체. 핵심은 perilipin diacylglycerol acyl-전이 효소, 아 세 틸 coa carboxylase acyl CoA synthase1등 중립 지질 합성에 관련 된 효소 같은 단백질 상호 작용 하는 인지질 단층에 의해 둘러싸여 있습니다. 인지질 단층에는 그것의 동적 행동 때문은 태그와 SE2triacylglycerol lipases를 또한 포함 되어 있습니다. 셀 유형 및 유기 체에 따라 저장 된 중성 지질 에너지를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다 또는 합성 인지질 및 신호 분자. 효 모와 다른 균 류, LDs의 콘텐츠 변화 감소 질소 가용성 증가 중립 지질 생산3,4 키 수 있습니다 나타내는 배양에 질소/탄소 비율에 대 한 응답 변경 ,5. 효 모에 태그의 높은 금액의 생산에 생명 공학의 잠재적인 사용을 사용 하 여 식품 산업 및 바이오 연료의 소스로 합니다. 오메가 3와 오메가 6, 영양과 식이 중요성 6,7,8,,910 와 같은 고도 불포화 지방산의 높은 비율을 포함 하는 일부 저장 된 지질 , 11. 인간 세포를 포함 한 포유류 세포의 LDs 태그와 콜레스테롤 에스테 르를 포함. LDs, 효 모에 설명 된 단백질의 동종 포유류와 추가 단백질, 결 석 perilipin 인지질 단층 작용 하는 S. cerevisiae12. 하나 제안 인지질 단층 및 그 관련 된 단백질에 대 한 역할은 LDs 구조를 안정화 하 고 미토 콘 드리 아, 바인딩과 그물, peroxisomes, 및 그들, 주로 지질 exchange 에 대 한 세포와 LDs의 상호 작용 13,14. 흥미롭게도, 인간에서 LDs 것 처럼 타입 2 당뇨병, 동맥 경화, steatohepatitis, 그리고는 그들의 번호 15,16,17 증가 관상 동맥 심장 질환 같은 병 리에 관여 . 일부 유형의 바이러스 플랫폼으로 LDs를 사용 하 여 조립 virions 2,,1819.

때문에 인간의 병 리 및 그들의 잠재적인 바이오 사용에 LDs의 의미, LDs 형성의 정확한 실험 결정 중요 한 작업입니다. 이 문서에서는 신뢰할 수 있는 분석 결과 형광 (LFR) BODIPY 493/503의 회복에 따라 (4, 4-difluoro-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-보라-3a, 4a-diaza-s-indacene), 셀에 중립 지질 콘텐츠의 상대적 가치를 얻으려면. 이 분석 결과, 그것은 미국 maydis S. cerevisiae, 같은 균 류와 포유류 세포, 지질 추출 20. 의 필요 없이 중립 지질 축적의 역학에 따라 가능 방법은 단백질 가수분해를 식별 하기 위해 S. cerevisiae 에 처음으로 적용 된 및 kinases 지질 물질 대사의 규칙. 이것은 지질 추출 또는 단백질 정화21,22없이 가능 했다. LFR 또한 복 막 대 식 세포23에 LDs 형성의 역학을 설정할 사용 되었습니다. 사용 BODIPY 493/503의 나 일 빨강으로 다른 중립 지질 염료 몇 가지 이점이 있다. BODIPY 493/503 중립 지질에 대 한 매우 구체적인 이며 좁은 방출 스펙트럼, confocal 현미경 검사 법에 의해 샘플을 분석할 때 붉은 형광 단백질 또는 미토-추적기 같은 염료에서 신호의 동시 탐지를 촉진 합니다. 불행 하 게도, BODIPY 493/503 photobleaching에 민감 하지만 빛24노출 시 antiquenching 시 약을 사용 하 여이 프로세스를 피할 수 있다.

효 모 세포에서 LFR 시험을 수행 하기 그들은 원하는 영양 조건 하에서 경작 하 고 aliquots는 서로 다른 시간에 철회 된다. 다음으로, 셀 포 름 알 데히드, 4 ° c.에 세포는 저장 하는 때 달 동안 LDs의 무결성을 보존 고정 됩니다. 다른 고정 기법 피해 야 한다, 특히 그 이후 그들은 셀24내 LDs의 저하로 이어질 찬 아세톤 또는 메탄올을 사용 하 여. LD 색인을 측정 하기 위해 포름알데히드 고정 셀 정의 농도를 물에 중단 된다. 그리고, fluorophore BODIPY 493/503 기에 의해 침묵을 포함 하는 솔루션에 추가 되는 fluorophore 셀 들어가고 Ld와 때 그것의 형광의 복구는. 형광 측정 (485 nm/510 nm)에 수 반하는, 셀의 농도 600에서 광학 밀도 측정 하 여 정량 nm. 각 샘플 잘 같은 포름알데히드-고정 셀 서 스 펜 션의 후속 5 µ L aliquots를 추가 하 여 4 번 읽습니다. 형광 및 흡 광도의 공백 셀의 추가 하기 전에 획득 됩니다. 형광의 흡 광도 데이터 품질 측정의 선형성을 확인 하 여 평가: 만약 r < 0.9, 데이터는 삭제 됩니다. R 값은 기본적으로 형광의 강도 증가 셀 농도에 선형 응답을 생성 해야 하기 때문에 중요 하다. 세포 농도가 너무 높은 경우에, 선형 손실 됩니다. LFR 분석 결과 높은 처리량 실험에서 원하는 LD 표현 형을 선택 하려면 빠르고, 간단 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 원하는 조건을 선택한 후 개별 셀의 LD 콘텐츠 같은 포름알데히드-고정 셀 셀에서 Ld의 이미지를 제공 하는 BODIPY와 스테인드를 사용 하 여 하는 confocal 현미경 검사 법에 의해 공부 될 수 있다. 그들의 태그와 SE 콘텐츠 수 이제 더 분석 얇은 층 크로마토그래피에 의해.

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Protocol

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1입니다. 버퍼 솔루션의 준비

  1. 인산 염의 1 리터를 준비 하려면 식 염 수 (PBS, pH 7) 버퍼링, NaCl, KCl, 0.2 g Na2HPO4, KH24 distillated 물 800 ml에서의 0.24 g 1.44 g 8 g을 분해. HCl와 7.0에 pH를 조정 하 고 추가 물 1 L. PBS의 마지막 볼륨에 대 한 재고 솔루션 x 10로 만든 고 실내 온도에 저장 될 수 있습니다.
  2. 담합 솔루션의 10 mL를 준비 하려면 3.7%의 최종 농도 도달 하는 PBS의 9 mL을 37% 포름알데히드의 1 mL를 추가 합니다. 그냥 사용 하기 전에이 솔루션을 준비 합니다.
    주의: 글러브를 사용 하 여 포름알데히드 솔루션 처리.
  3. 냉각-솔루션 (500mm)를 준비 하려면 8.3 g 기의 100 mL의 증류수에 녹. 사용 하기 전에이 솔루션을 준비 하 고 상 온에서 저장.
  4. BODIPY 10 m m 재고 솔루션을 준비, 10 mg BODIPY 493/503의 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 3.8 mL에 녹. 어둠 속에서-70 ° c.에 100 µ L aliquots를 유지
  5. BODIPY 5 µ M 냉각 솔루션을 준비, 10 m m BODIPY 500 mM 냉각 솔루션의 493/503 2 mL의 1 µ L를 추가 합니다. LFR 분석 결과 대 한 BODIPY의 5 µ M의 최종 농도 필요 합니다.
  6. 미네랄 솔루션을 준비 하려면 추가 0.06 g H3보의3, MnCl2-4 H2O, ZnCl2, 나2의 0.04 g 0.4 g의 0.14 g MoO4-2 H2O, 0.1 g FeCl3-6 H2O와 CuSO의 0.4 g의 4-5 H2O 증류수 1 l.
  7. 소금 솔루션을 준비, KH242그래서4, KCl의 8 g, MgSO4의 2 세대, CaCl2, 1 g, 1 l의 미네랄 솔루션의 8 mL 증류수의 4 g 16 g를 추가 합니다.
  8. 준비 (a2b2), 미국 maydis f b 2에 대 한 질소 소스 없이 최소한의 매체 추가할 10 g의 포도 당 및 62.5 mL 소금 솔루션의 1 l 증류수, 할러데이, 외. 31. 7.0에 pH를 조정 하 고 분배 250 mL 플라스 크에 미디어의 100 mL 그들을 소독. 액체 주기 또는 필터에 15 psi (1.05 k g/c m2)에서 20 분 동안 오토 클레이 브 소독.
  9. 준비 효 모 펩 포도 당 매체 (YPD), 효 모 5 g 추출, 펩, 2.5 g 그리고 증류수 1 리터에 포도의 5 g을 추가 합니다. 250 mL 플라스 크에 솔루션의 100 mL를 분배 하 고 그들을 소독. 액체 주기 또는 필터에 15 psi (1.05 k g/c m2)에서 20 분 동안 오토 클레이 브 소독.

2. 문화 조건과 셀 고정

참고: 셀을 최대한 빨리 수정 하 여 Ld의 구조를 유지 합니다. Microcentrifuge 튜브에 고정을 할 수 있습니다. 고정된 셀 수 보관 4 ° C에서 최대 한 달 동안 경우 탈수는 물의 얇은 층을 떠나.

  1. 문화 조건 하에서 미국 maydis 세포 성장 관련 연구에 대 한. 0.05는 초기 세600 문화 시작 (1.15 × 106 셀 / mL). 28 ° C, 24 h에 대 한 180 rpm에서 세포를 품 어. 2.3 × 107 셀에 해당 하는 1의 OD600 / mL.
  2. 선택 된 셀의 약 수를 철회 하는 시간. 미국 maydis 에 대 한 첫 번째 8 h 동안 5 mL 매 2 시간을 철회 한다. 성장의 8 h 후 2 mL의 aliquots는 충분 하다.
  3. 600에서 광학 밀도 측정 각 약 수의 nm.
  4. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 ° C에서 1 분 동안 14000 x g에 세포 현 탁 액 원심 폐기는 상쾌한.
  5. 1 mL의 PBS 포름알데히드 3.7% 버퍼에 셀의 펠 릿을 일시 중단 합니다. 실 온에서 15 분에 대 한 셀을 품 어.
  6. 부 화 후 4 ° c.에 1 분 동안 14000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.
  7. 증류수 (1 mL)의 비슷한 볼륨으로 두 번 셀 펠 릿을 세척. 14000 x g 4 ° c.에 1 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심 각 세척 단계 후에 상쾌한 폐기.
  8. 5 세600 셀 펠 릿을 조정 (1.15 x 108 셀 / mL)와 증류수 (식 1).
    Equation 1    방정식 1입니다.
  9. 그것의 사용까지 4 ° C에서 샘플을 유지.

3. 액체 형광 복구 분석 결과 (LFR)

  1. 분 광 광도 계를 켜고 Skanlt 소프트웨어를 엽니다. 새 세션을 시작 하 고 Varioskan 럭 스를 선택. 세션 트리에서 프로토콜 을 선택 하 고 (여기 485 nm/방출 510 nm; 광학 밀도 600 nm) 형광 파장에 대 한 설정을 입력 한 자동 광 전 증폭 관 이득 선택. 여기 대역폭, 선택 12 nm 광학에서 위쪽을 선택 (샘플의 여기는 우물의 상단에서).
  2. 온화 하 고 지속적인 동요 (300 rpm)를 입력 합니다. 실행 판 밖으로, 그리고 일시 중지 될 때까지 사용자 액션 (우물에 샘플의 추가 대 한 사용 되는 시간)를 선택 합니다. 프로토콜 5 번 반복 합니다. 저장 을 클릭 하 고 세션 이름 세션 이름 필드에 쓰기. 프로토콜은 이제 샘플 분석에 대 한 준비.
  3. BODIPY 5 µ M의 200 µ L 래 96 잘 블랙 클리어 바닥판의 각 음에 솔루션을 추가 합니다.
  4. 챔버 내부에 분 광 광도 계는 접시를 놓고 30 ° c.에서 5 분을 품 어 이 시점에서 빛에서 접시를 최대한 보호 합니다.
  5. 시작 단추를 클릭 하 고 (여기 485/방출 510) 형광 및 OD600 에 해당 하는 공백.
  6. 일시 중지 시간 동안 우물을 포름알데히드 고정 셀 서 스 펜 션의 5 µ L를 추가 합니다. 신중 하 게 피펫으로 샘플 혼합. 분 광 광도 계 안에 접시를 넣어 하 고 계속을 클릭 합니다. 그런 다음 샘플 위에 설계 된 프로토콜에 따라 처리 됩니다.
  7. 세포 현 탁 액의 5 µ L의 3 개의 연속적인 추가 반복 합니다. 셀 침전 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. (그림 1)입니다.

4입니다. LD 색인의 계산

  1. 미 판에서 각 샘플에 대 한 형광 및 각 연속 추가 (5 포인트 블랭크를 포함 하 여)의 볼륨에 대 한 흡 광도 그래프를 플롯 합니다. 이 연구에서는 Microsoft Excel 소프트웨어를 사용 하 여 계산에 대 한. 데이터를 첫 번째, 볼륨, 형광, 및 흡 광도 데이터 입력, 데이터 시트의 두 번째 및 세 번째 열 각각. 그런 다음 커서를 사용 하 여 전체 데이터를 선택 하 고 삽입을 클릭 합니다 (XY) 분산형을 선택 합니다.
  2. 그래프에서 각 줄에 대 한 포인트를 선택 하 고 선택 표시 수식 상자와 해당 추세선 을 삽입. 2 개의 직선, 방정식 2에 따라의의 값을 적어:
    Equation 2    공식 2
    여기서 y = 형광 또는 광학 밀도, x = 샘플의 볼륨 (0, 5, 10, 15, 20 µ L), m 형광 또는 광학 밀도 라인과 b의 기울기 = = y 절편.
  3. LD 인덱스, 방정식 3 광학 밀도 선의 기울기에 의해 형광 선의 기울기를 나눕니다.
    Equation 3    식 3
    LD 인덱스 형광의 몫에 해당 하며 광학 밀도 슬로프.

5. 데이터 품질 분석

  1. 각 직선의 상관 계수를 계산: 함수 마법사 (fx)를 클릭 하 고 선택 CORREL. 만약 r < 0.9, 데이터를 삭제 하 고 읽기를 반복. R ≥ 0.9, 판독 하는 경우 신뢰할 수 있는입니다.

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Representative Results

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LFR, BODIPY와 493 일부/503 형광 프로브로 공부 미국 maydis, 관계 없이에 LDs의 동적 축적 성장 조건에 안정적이 고 쉬운 방법입니다. 셀 YPD 매체에 경작 되었다 때 증가 LD 인덱스 지 수 단계 뒤에 고정 단계 (그림 2A)에서 감소 했다. 반면, 질소 기아에서 성장 하는 셀에 모두 지 수 및 고정 단계에서 (그림 2B) LD 인덱스에 꾸준히 증가 했다. 두 문화는 동일한 광학 밀도 (셀의 유사한 수)와 함께 시작 했다, 때문에 결과 지질 내용 (그림 2)에서 작은 변화를 감지 하 LFR 분석 결과의 높은 용량을 보여. 방법의 감도 confocal 현미경 검사 법에 의해 뒷받침 했다: 동안 질소 기아에서 (그림 2, 큰 LDs, 셀 당 일반적으로 4-5 LDs의 중요 한 생산 한 전체 셀에 걸쳐 많은 작은 LDs를 포함 하는 YPD 셀 오른쪽 패널 A와 B, 각각). LD 인덱스 하지 중립 지질 콘텐츠의 절대 값 이기 때문에, triacylglycerols 양의 LD 인덱스 관련 된 표준 곡선을 건설 한다. 이 접근은 S. cerevisiae20에서 태그 합성의 역학을 공부 하 사용 되었다. 각 표준 곡선에 따라, LFR 분석 결과 수 세포에 지질 축적의 비율 결정 하는 데 사용.

LD 인덱스 soraphen A, 아 세 틸 coa carboxylase, LDs25에 저장 된 태그에 포함 된 지방산의 합성에 필수적인 효소의 특정 억제제의 다음 수 있습니다. 억제제 세포 지질 축적 (그림 2B)의 더 높은 속도 보여준 조건, 질소 소스의 부재에 성장의 2 h 후 문화 매체에 추가 되었습니다. S. cerevisiae, 이전 보고서에 따라 soraphen A의 추가 전체 억제 LD 축적 (그림 2B, 밝은 파란색) 20,21의 결과.

더 조사 하기 위하여 미국 maydis에 LDs의 동원, 72 h에 대 한 질소 기아에서 성장 하는 세포는 YPD 매체 (그림 3)로 옮겨 졌다. LD 인덱스 지 수 함수에 따라 감소합니다. 24 시간 후 LD 인덱스 질소 부재 (그림 2A)의 스트레스 없이 YPD 매체에 경작 하는 세포에서 관찰을 비슷한 값에 도달 했습니다. 이후 셀 질소 기아 동안 축적 된 Ld를 동원 수 있었다, 결과 태그 내용에 있는 감소를 제안 합니다. 비슷한 응답 S. cerevisiae 에 대 한 가수분해 지질 대사21의 규칙에 관련 된 연구 기간 동안 보고 되었다.

Figure 1
그림 1: 단계는 LFR의 도식 대표. 문화 조건의 단계 미국 maydis 효 모에 대 한 대표 하지만 다른 미생물 또는 세포의 유형에 적용할 수 있습니다. URF, 복구 형광;의 단위 bd, bidistilled 물 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 미국 maydis에 지질 방울 축적의 역학. 효 모 세포 YPD 매체에서 24 h 동안 성장, 수확 되었고 (A) 신선한 YPD-중간에 중단 (맨 위 왼쪽된 패널) 또는 질소 소스 (하단 왼쪽된 패널-다크 블루) 없이 (B) 최소한의 매체에서. 질소 기아에서 LD 인덱스 증가 성장 (B, 밝은 파란색)의 2 시간 후 문화 미디어에서 192 nM soraphen A를 추가 하 여 저해 했다. n = 3, 데이터는 평균 ± SEM. 오른쪽 패널: 셀에 LDs의 confocal 현미경 검사 법 (A) 상단 패널 24 h.에서 수확: YPD-셀. (B) 하단 패널: 질소 소스 없이 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: LDs 동원. 효 모 세포 YPD 매체에서 24 h 동안 성장, 수확 되었고 24 h (제어)에 대 한 신선한 YPD에 성장 또는 최소한의 72 h에 대 한 질소 소스 없이 중간 그리고 incubated 추가 24 h. Aliquots에 대 한 신선한 YPD 보통 전송에서 제시 된 철회 LFR에 의해 LDs의 동원을 측정 하기 위해 두 문화에 대 한 시간. 데이터는 지 수 감퇴 방정식에 의해 적합 했다 (y = A·e-kt). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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LFR은 성공적으로 했다 지질 대사 S. cerevisiae 에서 공부를 처음으로 적용 된 새로운 방법 미국 maydis20,21에서 구현. LD 인덱스 태그 셀에 축적의 절대 값에 영향을 주지 않는다, 비록 세포의 지질 콘텐츠의 빠른 생각을 LD 인덱스 두 개 이상의 실험 조건에서 비교 했을 때 데이터의 해석은 간단. BODIPY 493/503 중립 지질, 민 변의 주요 구성 요소에 대 한 매우 구체적인 이며 그것이 셀 confocal 여 공부는 미토 추적기 또는 CMAC 블루 같은 염료에서 오는 다른 신호의 동시 탐지를 용이 하 게 좁은 방출 스펙트럼 현미경 검사 법26. 많은 형광 분자 처럼 BODIPY 493/503 photobleaching에 민감한 형광 현미경 실험, 동안 이지만이 과정 photobleaching 시 약 안티 빛27노출 시 추가 하 여 감소 될 수 있습니다. 요약, 축적과 중립 지질21,22,23,,2829의 동원을 공부 하는 다양 한 범위의 셀에 BODIPY 493/503은 사용할 수 있습니다.

제대로 작동 하는 방법에 대 한 어떤 시점으로 적용 해야 합니다. OD600 LD 색인의 계산에 사용 되므로 세포의 형태학 하지 말았어야 급진적인 변화 실험 기간 동안. 셀의 고정 기간 동안 세포내 구성 요소의 보존도 중요 한 단계 이며이 보전이이 프로토콜의 주요 목표는 LDs를 포함 해야 합니다. 적절 한 화합물으로 세포를 고정 하는 것은 매우 많은 종류의 어떤 문제 없이 세포를이 방법의 응용 프로그램에 대 한 중요. 여기, 우리; 세포의 구조를 해결 하기 위해 포름알데히드를 사용 알데하이드 반응 단백질의 아미노 그룹. 그것은 다른 알데하이드는 또한 다양 한 세포의 구조를 보존 하 고는 하지 중요 한 변화는 단백질 구조24,26에 보인다 보고 되었습니다. 포 름 알 데히드의 단점은 작은 막 손상 유도 및 공포 형성 근처는 미토 콘 드리 아와 핵 막, 하지만, 이러한 부정적인 효과 모든 알데하이드 고정 방법26에 일반적입니다. 그들은 셀에서 Ld 저하 때문에 메탄올 이나 아세톤과 같은 유기 용 매를 피해 야 한다. 유기 용 매와 고정 탈수와 부정적인 영향 고려 될 수 있는 단백질의 강 수를 기반으로 합니다. 또한, 유기 용 매를 사용 하 여 일반적인 얼룩과 연결 됩니다.

다른 기법으로 LD 인덱스 분석 결과 다른 시스템에 구현 되는 경우 제한 할 수도 있습니다. 곰 팡이 세포 벽, 지방산 조성, 지질과 세포내 지질 시체30, 단백질 함량의 유형 형광의 의존에서 BODIPY의 보급에 문제 배제 태그의 금액의 비교 다른 종 사이 나 심지어 같은 세포와 다른 영양 조건 하에서 성장. 또한, 균 사체 또는 세포의 응집 전환 등 큰 형태학 변화 찾을 수 있는 문제 중 일부입니다.

LD 인덱스 분석 결과 짧은 시간 및 바이오 매스 및 반응의 적은 양을 요구 하는 높은 처리량 방법입니다. 분석 결과 신뢰할 수 있는, 그리고 얻은 데이터는 정확 하 고 재현 가능. 또한, 그것은 의학, 지질 물질 대사의 역학에 대 한 연구에 대 한 지침을 제공 합니다 그리고 그것은 생명 공학 바이오 연료의 생산을 위한 유성 유기 체의 높은 처리량 검열을 위한 도구가 될 수 있습니다 또는 오일 피드.

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Disclosures

저자는 아무것도 공개

Acknowledgments

이 작품은 교부 금에 의해 지원 되었다 Instituto Politécnico Nacional Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), 프로그램이 de Apoyo 있습니다 드 Investigación e Innovación 협력 (PAPIIT IN222117)-(대학 나시오날 Autónoma 드 멕시코 운 암)와 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (CONACyT 254904 JPP 및 256520 GGS). Fundação 드 Amparo를 검색 할 리오 데 자네이 (FAPERJ-Cientistas Nosso 스타 할: E 26/103.353/2011). QFB 덕분에 우리입니다. 오스카 이반 Luqueño Bocardo에 대 한 도식 개요입니다. LDs의 confocal 현미경 검사 법에서 귀중 한 도움에 감사 박사 미겔 Tapia 로드리게스 하 고. 우리가 미국 maydis에 대 한 적응 S. cerevisiae 에 기술 개발에 그의 개척 일 박사 브루노 Bozaquel Morais 감사 하 길.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122, (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25, (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100, (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14, (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59, (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8, (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831, (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90, (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63, (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7, (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21, (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121, (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5, (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35, (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283, (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81, (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10, (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17, (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6, (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. Plenum. New York. 575-595 (1974).
곰 팡이 병원 체 <em>Ustilago Maydis</em> 에 액체 형광 복구 하 여 지질 인덱스 결정
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Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

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