Lipid Index bestämning av flytande fluorescens återhämtning i den svamp patogener Ustilago Maydis
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla lipid droplet index (LD index) för att studera dynamiken i triacylglycerols i celler odlade i hög genomströmning experiment. LD index analysen är en enkel och tillförlitlig metod som använder BODIPY 493/503. Denna analys behöver inte dispendious lipid extraktion eller mikroskopi analys.
Abstract
Artikeln visar hur du implementerar LD index analysen, som är en känslig mikroplattan analys att bestämma ackumulering av triacylglycerols (Taggar) i lipid droppar (LDs). LD index erhålls utan lipid extraktion. Det gör att mäta LDs innehållet i hög genomströmning experiment under olika förhållanden såsom tillväxt i rika eller kväve utarmat media. Om än metoden beskrevs för första gången att studera den droplet lipidmetabolismen i Saccharomyces cerevisiae, det tillämpades till giftig Ustilago maydis. Intressant, och eftersom LDs är organeller fylogenetiskt bevarad i eukaryota celler, metoden kan tillämpas på en stor mängd celler, från jäst till däggdjursceller. LD indexet baseras på flytande fluorescens återhämtning analysen (LFR) av den BODIPY 493/503 släcka villkor, genom tillsats av celler fast med formaldehyd. Kalium jod används som en fluorescens törstsläckare. Förhållandet mellan fluorescensen och optisk densitet backarna heter LD index. Backarna är beräknade från de räta linjerna som erhålls när BODIPY fluorescens och optisk densitet vid 600 nm (OD600) ritas mot provet tillägg. Optimal datakvalitet återspeglas av korrelationskoefficienterna lika eller högre 0,9 (r ≥ 0.9). Flera prover kan läsas samtidigt som det kan genomföras i en mikroplattan. Eftersom BODIPY 493/503 är en lipofila fluorescerande färgämne som partitioner i lipid droppar, kan den användas i många typer av celler som ansamlas LDs.
Introduction
Lipid droppar (LDs) är allestädes närvarande intracellulära fett organ består av en kärna av neutrala lipider, främst Taggar och sterolestrar (SE). Kärnan omges av en enskiktslager av fosfolipider som interagerar med proteiner som perilipin och enzymer involverade i syntesen av neutrala lipider, såsom diglyceridolja acyl-transferas, acetyl-CoA ribulosbisfosfatkarboxylas och acyl-CoA syntas1. På grund av dess dynamiska beteende innehåller den fosfolipid enskiktslager också triacylglycerol lipaser som hydrolyserar Taggar och SE2. Beroende på celltyp och organismen, lagrade neutrala lipider kan användas för att generera energi, eller syntetisera fosfolipider och signalmolekyler. I jäst och andra svampar, innehållet i LDs ändras som svar på variationer i kväve/kol förhållandet i kultur media, som visar att minskad kväve tillgänglighet kan vara nyckeln till öka neutrala lipid produktion3,4 ,5. Produktion av stora mängder Taggar i jäst har en potentiell användning inom bioteknik som källa till biobränslen och i livsmedelsindustrin. Vissa lagrade lipider innehåller höga andelen fleromättade fettsyror som omega 3 och omega 6, med närings- och kosttillskott vikten 6,7,8,9,10 , 11. LDs av däggdjursceller, inklusive mänskliga celler, även innehålla Taggar och kolesterol estrar. Den fosfolipid enskiktslager interagerar med den homologa är däggdjur av de proteiner som beskrivs i jästen LDs och med en extra protein, perilipin, som är frånvarande i S. cerevisiae12. En föreslagen roll för den fosfolipid enskiktslager och dess associerade proteiner är att stabilisera strukturen LDs och tillåta LDs interaktion med organeller som mitokondrier, endoplasmatiska nätverket, peroxisomes och vakuoler, främst för lipid exchange 13,14. Intressant, i människor verkar LDs vara inblandade i sjukdomar som typ 2-diabetes, åderförkalkning, steatohepatit och kranskärlssjukdom, där det finns en ökning av deras nummer 15,16,17 . Vissa typer av virus använda LDs som plattformar för att montera virioner 2,18,19.
På grund av konsekvenserna av LDs i mänskliga sjukdomar och deras potentiella bioteknisk användning är exakta Experimentell bestämning av LDs bildandet en viktig uppgift. Denna artikel beskriver en tillförlitlig analys baserat på återvinning av fluorescensen (LFR) av BODIPY 493/503 (4, 4-difluor-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), att få ett relativt värde av innehållet i neutrala lipider i celler. Med denna analys är det möjligt att följa dynamiken i ansamling av neutrala lipider i svampar som U. maydis och S. cerevisiae, och även i däggdjursceller, utan behov av lipid utvinning 20. Metoden tillämpades för första gången i S. cerevisiae att identifiera de protein fosfataser och kinaser involverade i regleringen av lipidmetabolismen. Detta var möjligt utan lipid utvinning eller protein rening21,22. LFR har också använts för att fastställa dynamiken i LDs bildandet i peritoneal makrofager23. Användning av BODIPY 493/503 har vissa fördelar jämfört med andra neutrala lipid färgämnen som Nilen Red. BODIPY 493/503 är mycket specifika för neutrala lipider och har en smal emissionsspektrum, att underlätta samtidiga detektion av signaler från färgämnen som röd fluorescerande protein eller Mito-tracker, när proverna analyseras av konfokalmikroskopi. Tyvärr BODIPY 493/503 är känslig för fotoblekning, men denna process kan undvikas genom att använda ett antiquenching reagens under exponering för ljus24.
Utföra LFR analysen i jästceller, de är odlade på önskad näringsmässiga villkor och alikvoter återkallas vid olika tidpunkter. Nästa, cellerna fixeras med formaldehyd, som bevarar integriteten hos LDs månader när celler lagras vid 4 ° C. Andra fixering tekniker bör undvikas, särskilt de som använder metanol eller kall aceton, eftersom de leder till nedbrytning av LDs inom celler24. För att mäta indexet LD, är formaldehyd-fasta blodkropparna suspenderade i vatten för att få en definierad koncentration. Sedan läggs de till en lösning som innehåller fluorophore BODIPY 493/503 släckas av KI och när fluorophore kommer in i cellen och associates med LDs, finns det en återhämtning av dess fluorescens. Samtidig till fluorescens mätningen (485 nm/510 nm), koncentrationen av celler kvantifieras genom mätning av den optiska densiteten vid 600 nm. Varje prov läses fyra gånger genom att lägga till efterföljande 5 µL portioner av en formaldehyd-fasta cellsuspension till samma väl. Blanks av fluorescens och absorbansen är förvärvade före tillsats av celler. Kvaliteten på fluorescensen och absorbansen data utvärderas genom att bestämma Linjäriteten av mätningar: om r < 0,9, data ignoreras. R-värdet är viktigt eftersom i princip intensiteten av fluorescens bör producera en linjär respons till ökande cellen koncentrationer. Om cellkoncentrationen är för hög, förloras linearitet. LFR analysen ger en snabb, enkel och ekonomisk metod för att välja önskad LD fenotypen i hög genomströmning experiment. När du har valt de önska villkor, kan LD innehållet i enskilda celler studeras genom konfokalmikroskopi, använder samma formaldehyd-fast cellerna färgas med BODIPY, som ger en bild av LDs i cellen. Sina taggar och SE innehåll kan nu ytterligare analyseras med tunnskiktskromatografi.
Protocol
Representative Results
Discussion
LFR är en ny metod som tillämpades för första gången att studera lipidmetabolism i S. cerevisiae och senare det var framgångsrikt genomfört i U. maydis20,21. Även om indexet LD inte ger ett absolut värde av de taggar som ackumuleras i cellerna, det ger en snabb bild av fettinnehållet av celler, och tolkningen av data är enkelt när LD index från två eller flera experimentella villkor jämförs. BODIPY 493/503 är mycket specifika f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo en Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autónoma de México () UNAM), och Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP och 256520-GGS). Fundação de Amparo en Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas göra Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Vi tack vare QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo för en schematisk översikt. Vi tackar Dr Miguel Tapia Rodríguez för värdefull hjälp i konfokalmikroskopi LDS. Vi vill tacka Dr Bruno Bozaquel Morais för hans banbrytande arbete med att utveckla tekniken i S. cerevisiae som vi anpassat för U. maydis.
Materials
| Spectrophotometer | Varioskan Lux multimode microplate reade | D5879 | Filter 493/503 or monochromator detector |
| Plate costar | Corning Inc. | 3615 | 96 well black-wall/clear bottom |
| Plate costar | Corning Inc | 3598 | 96 well cell culture plate costar |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen/ Thermofisher | D3922 | 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | 252549 | ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization |
| Potassium iodide | Sigma Aldrich | 60399 | BioUltra, ≥ 99.5% (AT) |
| FB2 Ustilago maydis | ATCC | 201384 | Basidiomycete-Yeast |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 746398 | ACS reagent, inorganic salt |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | ACS reagent |
| Select Yeast Extract | Sigma Aldrich | Y100 | Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media |
| N-Z case plus | Sigma aldrich | N4642 | Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk |
| Glucose | Sigma Aldrich | G-8270 | D (+) glucose |
| Skaker flask | Pirex | CLS4450250-6EA | Borosiicate glass |
| Shaker | SEV México | INO650V-7 | Orbital shaker |
| Centrifuge table | Eppendorf | 5415C | Centrifuge |
| Microtubes | Sigma Aldrich | Z606340 | Eppendorf |
| Pipet tips | Axygen scientific | T-200-Y | Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile |
| mLine pipette | Biohit | 725130 | 8 channels, volume range 5-100 uL |
References
- Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122 (6), 749-752 (2009).
- Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25 (11), R470-R481 (2015).
- Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
- Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
- Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
- Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
- Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (14), 6103-6117 (2016).
- Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
- Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14 (3), 252-264 (2015).
- Kolouchova, I., Mat’atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. , (2016).
- Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59 (4), 231-242 (2013).
- Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8 (5), e64605 (2013).
- Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 775-786 (2013).
- Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 589-594 (2013).
- Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90 (4), 1219-1227 (2011).
- Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63 (12), 1355-1369 (2006).
- Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7 (2), 67-76 (2014).
- Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21 (1), 34-42 (2015).
- Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
- Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. , (2017).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35 (4), 737-746 (2015).
- Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283 (4), 2203-2210 (2008).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. . Current Protocols in Cell Biology. , (2001).
- Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81 (5), 649-660 (2011).
- Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10 (6), 1030-1038 (2011).
- Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17 (6), 1546-1559 (2016).
- Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6 (17), (2016).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Holliday, R., King, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. , 575-595 (1974).
