Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Lipid Index bestämning av flytande fluorescens återhämtning i den svamp patogener Ustilago Maydis

doi: 10.3791/57279 Published: April 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla lipid droplet index (LD index) för att studera dynamiken i triacylglycerols i celler odlade i hög genomströmning experiment. LD index analysen är en enkel och tillförlitlig metod som använder BODIPY 493/503. Denna analys behöver inte dispendious lipid extraktion eller mikroskopi analys.

Abstract

Artikeln visar hur du implementerar LD index analysen, som är en känslig mikroplattan analys att bestämma ackumulering av triacylglycerols (Taggar) i lipid droppar (LDs). LD index erhålls utan lipid extraktion. Det gör att mäta LDs innehållet i hög genomströmning experiment under olika förhållanden såsom tillväxt i rika eller kväve utarmat media. Om än metoden beskrevs för första gången att studera den droplet lipidmetabolismen i Saccharomyces cerevisiae, det tillämpades till giftig Ustilago maydis. Intressant, och eftersom LDs är organeller fylogenetiskt bevarad i eukaryota celler, metoden kan tillämpas på en stor mängd celler, från jäst till däggdjursceller. LD indexet baseras på flytande fluorescens återhämtning analysen (LFR) av den BODIPY 493/503 släcka villkor, genom tillsats av celler fast med formaldehyd. Kalium jod används som en fluorescens törstsläckare. Förhållandet mellan fluorescensen och optisk densitet backarna heter LD index. Backarna är beräknade från de räta linjerna som erhålls när BODIPY fluorescens och optisk densitet vid 600 nm (OD600) ritas mot provet tillägg. Optimal datakvalitet återspeglas av korrelationskoefficienterna lika eller högre 0,9 (r ≥ 0.9). Flera prover kan läsas samtidigt som det kan genomföras i en mikroplattan. Eftersom BODIPY 493/503 är en lipofila fluorescerande färgämne som partitioner i lipid droppar, kan den användas i många typer av celler som ansamlas LDs.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Lipid droppar (LDs) är allestädes närvarande intracellulära fett organ består av en kärna av neutrala lipider, främst Taggar och sterolestrar (SE). Kärnan omges av en enskiktslager av fosfolipider som interagerar med proteiner som perilipin och enzymer involverade i syntesen av neutrala lipider, såsom diglyceridolja acyl-transferas, acetyl-CoA ribulosbisfosfatkarboxylas och acyl-CoA syntas1. På grund av dess dynamiska beteende innehåller den fosfolipid enskiktslager också triacylglycerol lipaser som hydrolyserar Taggar och SE2. Beroende på celltyp och organismen, lagrade neutrala lipider kan användas för att generera energi, eller syntetisera fosfolipider och signalmolekyler. I jäst och andra svampar, innehållet i LDs ändras som svar på variationer i kväve/kol förhållandet i kultur media, som visar att minskad kväve tillgänglighet kan vara nyckeln till öka neutrala lipid produktion3,4 ,5. Produktion av stora mängder Taggar i jäst har en potentiell användning inom bioteknik som källa till biobränslen och i livsmedelsindustrin. Vissa lagrade lipider innehåller höga andelen fleromättade fettsyror som omega 3 och omega 6, med närings- och kosttillskott vikten 6,7,8,9,10 , 11. LDs av däggdjursceller, inklusive mänskliga celler, även innehålla Taggar och kolesterol estrar. Den fosfolipid enskiktslager interagerar med den homologa är däggdjur av de proteiner som beskrivs i jästen LDs och med en extra protein, perilipin, som är frånvarande i S. cerevisiae12. En föreslagen roll för den fosfolipid enskiktslager och dess associerade proteiner är att stabilisera strukturen LDs och tillåta LDs interaktion med organeller som mitokondrier, endoplasmatiska nätverket, peroxisomes och vakuoler, främst för lipid exchange 13,14. Intressant, i människor verkar LDs vara inblandade i sjukdomar som typ 2-diabetes, åderförkalkning, steatohepatit och kranskärlssjukdom, där det finns en ökning av deras nummer 15,16,17 . Vissa typer av virus använda LDs som plattformar för att montera virioner 2,18,19.

På grund av konsekvenserna av LDs i mänskliga sjukdomar och deras potentiella bioteknisk användning är exakta Experimentell bestämning av LDs bildandet en viktig uppgift. Denna artikel beskriver en tillförlitlig analys baserat på återvinning av fluorescensen (LFR) av BODIPY 493/503 (4, 4-difluor-1, 3, 5, 7, 8-pentamethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene), att få ett relativt värde av innehållet i neutrala lipider i celler. Med denna analys är det möjligt att följa dynamiken i ansamling av neutrala lipider i svampar som U. maydis och S. cerevisiae, och även i däggdjursceller, utan behov av lipid utvinning 20. Metoden tillämpades för första gången i S. cerevisiae att identifiera de protein fosfataser och kinaser involverade i regleringen av lipidmetabolismen. Detta var möjligt utan lipid utvinning eller protein rening21,22. LFR har också använts för att fastställa dynamiken i LDs bildandet i peritoneal makrofager23. Användning av BODIPY 493/503 har vissa fördelar jämfört med andra neutrala lipid färgämnen som Nilen Red. BODIPY 493/503 är mycket specifika för neutrala lipider och har en smal emissionsspektrum, att underlätta samtidiga detektion av signaler från färgämnen som röd fluorescerande protein eller Mito-tracker, när proverna analyseras av konfokalmikroskopi. Tyvärr BODIPY 493/503 är känslig för fotoblekning, men denna process kan undvikas genom att använda ett antiquenching reagens under exponering för ljus24.

Utföra LFR analysen i jästceller, de är odlade på önskad näringsmässiga villkor och alikvoter återkallas vid olika tidpunkter. Nästa, cellerna fixeras med formaldehyd, som bevarar integriteten hos LDs månader när celler lagras vid 4 ° C. Andra fixering tekniker bör undvikas, särskilt de som använder metanol eller kall aceton, eftersom de leder till nedbrytning av LDs inom celler24. För att mäta indexet LD, är formaldehyd-fasta blodkropparna suspenderade i vatten för att få en definierad koncentration. Sedan läggs de till en lösning som innehåller fluorophore BODIPY 493/503 släckas av KI och när fluorophore kommer in i cellen och associates med LDs, finns det en återhämtning av dess fluorescens. Samtidig till fluorescens mätningen (485 nm/510 nm), koncentrationen av celler kvantifieras genom mätning av den optiska densiteten vid 600 nm. Varje prov läses fyra gånger genom att lägga till efterföljande 5 µL portioner av en formaldehyd-fasta cellsuspension till samma väl. Blanks av fluorescens och absorbansen är förvärvade före tillsats av celler. Kvaliteten på fluorescensen och absorbansen data utvärderas genom att bestämma Linjäriteten av mätningar: om r < 0,9, data ignoreras. R-värdet är viktigt eftersom i princip intensiteten av fluorescens bör producera en linjär respons till ökande cellen koncentrationer. Om cellkoncentrationen är för hög, förloras linearitet. LFR analysen ger en snabb, enkel och ekonomisk metod för att välja önskad LD fenotypen i hög genomströmning experiment. När du har valt de önska villkor, kan LD innehållet i enskilda celler studeras genom konfokalmikroskopi, använder samma formaldehyd-fast cellerna färgas med BODIPY, som ger en bild av LDs i cellen. Sina taggar och SE innehåll kan nu ytterligare analyseras med tunnskiktskromatografi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. beredning av buffrar och lösningar

  1. För att förbereda 1 L av fosfat buffrad saltlösning (PBS, pH 7), lös 8 g NaCl, 0,2 g kaliumklorid, 1,44 g av Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 i 800 mL destillerade vatten. Justera pH till 7,0 med HCl, och tillsätt sedan vatten för en slutlig volym av 1 L. PBS kan göras som en 10 x stamlösning och förvaras i rumstemperatur.
  2. För att förbereda 10 mL fastställande lösning, tillsätt 1 mL 37% formaldehyd till 9 mL PBS att nå en slutlig koncentration på 3,7%. Bered lösningen omedelbart före användning.
    Varning: Använd handskar för att hantera formaldehydlösning.
  3. För att förbereda den kylning-lösningen (500 mM), lös 8,3 g KI i 100 mL destillerat vatten. Bered lösningen före användning och förvara det i rumstemperatur.
  4. För att bereda BODIPY 10 mM stamlösning, lös 10 mg av BODIPY 493/503 i 3,8 mL av dimetyl sulfoxid (DMSO). Hålla 100 µL portioner i mörkret vid-70 ° C.
  5. För att förbereda BODIPY 5 µM-härdning lösning, tillsätt 1 µL 10 mM BODIPY 493/503 till 2 mL 500 mM dämpar lösning. För LFR analysen krävs en slutkoncentration på 5 µM av BODIPY.
  6. För att förbereda den mineral lösningen, tillsätt 0,06 g H3BO3, 0.14 g MnCl2-4 H2O, 0,4 g ZnCl2, 0,04 g Na2MoO4-2 H2O, 0,1 g av FeCl3-6 H2O och 0,4 g CuSO 4-5 H2O 1 l destillerat vatten.
  7. För att förbereda saltlösningen, tillsätt 16 g KH2PO4, 4 g Na24, 8 g KCl, 2 g MgSO4, 1 g CaCl2och 8 mL av mineral lösning till 1 L med destillerat vatten.
  8. Att förbereda det minimala mediet utan en kväve källa för U. maydis FB2 (a2b2), tillsätt 10 g glukos och 62,5 mL salt lösning till 1 liter destillerat vatten, enligt Holliday, o.a. 31. Justera pH till 7,0 och sedan fördela 100 mL för media i 250 mL kolvar och sterilisera dem. Autoklav under 20 minuter vid 15 psi (1,05 kg/cm2) på flytande cykel eller filter sterilisera.
  9. För att förbereda jäst pepton dextros medium (YPD), tillsätt 5 g jäst extrakt, pepton, 2,5 g och 5 g glukos till 1 L med destillerat vatten. Fördela 100 mL av lösningen i 250 mL kolvar och sterilisera dem. Autoklav under 20 minuter vid 15 psi (1,05 kg/cm2) på flytande cykel eller filter sterilisera.

2. kultur skick och Cell fixering

Obs: Bevara strukturen av LDs genom att fastställa cellerna så snart som möjligt. Upptagning kan göras i mikrocentrifugrör. Fast celler kan förvaras vid 4 ° C i upp till en månad om uttorkning undviks lämnar ett tunt lager vatten.

  1. Odla U. maydis cellerna under kultur förhållanden relevanta för studien. Starta kulturen med en inledande OD600 0,05 (1,15 × 106 celler / mL). Inkubera cellerna vid 28 ° C, 180 rpm för 24 h. En OD600 1 motsvarar 2,3 × 107 celler / mL.
  2. På utvalda tider, återkalla en alikvot av cellerna. För U. maydis, dra upp 5 mL varje 2 h under de första 8 h. Efter 8 h tillväxt räcker alikvoter av 2 mL.
  3. Mät den optiska densiteten vid 600 nm av varje delprov.
  4. Centrifugera cellsuspension vid 14 000 x g för 1 minuter vid 4 ° C med en bordsskiva centrifug. Kassera supernatanten.
  5. Centrifugerade cellerna på 1 mL PBS-formaldehyd 3,7% buffert. Inkubera cellerna för 15 min i rumstemperatur.
  6. Efter inkubering, Centrifugera cellsuspension vid 14 000 x g för 1 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten.
  7. Tvätta cellerna pelleten två gånger med en liknande mängd destillerat vatten (1 mL). Centrifugera cellsuspension vid 14 000 x g för 1 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten efter varje tvätt steg.
  8. Justera cellpelleten till 5 OD600 (1,15 x 108 cells / mL) med destillerat vatten (ekvation 1).
    Equation 1    Ekvation 1.
  9. Hålla provet vid 4 ° C fram till dess användning.

3. flytande fluorescens återhämtning Assay (LFR)

  1. Slå på spektrofotometern och öppna programvaran Skanlt. Klicka på ny SESSION, och välj START och sedan Varioskan Lux. Välj protokoll från trädet session, ange inställningar för fluorescens våglängder (excitation 485 nm/utsläpp 510 nm; optisk densitet 600 nm) och välj Automatisk fotomultiplikatorn vinst. För magnetisering bandbredd, Välj 12 nm. Välj top i optiken, (excitation av provet är från toppen av brunnen).
  2. Ange en skonsam och kontinuerlig agitation (300 rpm). Markera Kör plattan ut, och Paus tills den ANVÄNDARÅTGÄRD (tid används för tillägg av provet till brunnarna). Upprepa fem gånger för protokollet. Klicka på Spara och skriver ett namn för sessionen på SESSION NAMNFÄLTET. Protokollet är nu redo för analyserna som prover.
  3. Tillsätt 200 µL av BODIPY 5 µM - kylda lösningen till varje brunn en 96 väl svart-rensa botten pläterar.
  4. Placera plattan inne i spektrofotometer kammaren och inkubera 5 min vid 30 ° C. Från denna punkt, att skydda plattan från ljuset så mycket som möjligt.
  5. Klicka på knappen START och läsa fluorescensen (excitation 485/utsläpp 510) och OD600 motsvarar tomrummen.
  6. Tillsätt 5 µL formaldehyd-fasta cellsuspensionen till brunnarna under paus. Blanda proverna försiktigt med pipetten. Satte plattan släpper spektrofotometern och klicka på Fortsätt. Då kommer proverna att behandlas enligt det protokoll som utformats ovan.
  7. Upprepa tre successiva tillägg av 5 µL cellsuspension. Se till att cellerna inte fällningen. (Figur 1).

4. beräkningar av LD Index

  1. För varje prov i mikroplattan, rita ett diagram över fluorescens och absorbansen mot volymen av varje successiva tillägg (5 Poäng inklusive tomrummet). Använda Microsoft Excel programvara för beräkningarna i denna studie. Att rita data, ange volym, fluorescens och absorbansen data i första, andra och tredje kolumn i databladet respektive. Markera hela data med markören, klicka på Infoga och välj (XY) SCATTER.
  2. Välj punkterna för varje linje i grafen och infoga respektive TRENDKURVAN Visa ekvation kryssrutan. Skriv ned värdena av backarna i två raka linjer, enligt ekvation 2:
    Equation 2    Ekvation 2
    Där y = fluorescens eller optiska densitet, x = volym av provet (0, 5, 10, 15, 20 µL), m = lutningen på fluorescens eller optisk densitet linje, och b = y-axeln.
  3. Dela upp lutningen på linjen fluorescens av lutningen på linjen optisk densitet att få LD index, ekvation 3.
    Equation 3    Ekvation 3
    LD index motsvarar kvoten av fluorescens och optisk densitet skidbackar.

5. dataanalys kvalitet

  1. Beräkna korrelationskoefficienten för varje rak linje: klickar du på FUNKTIONSGUIDEN (fx) och välja KORREL. Om r < 0,9, ignorera data och upprepa avläsningarna. Om r ≥ 0.9, avläsningar är tillförlitliga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LFR, med BODIPY 493/503 som fluorescerande sonden är en pålitlig och enkel metod att studera dynamiska ansamling av LDs i U. maydis, oavsett tillväxten villkorar. När celler odlades i YPD-medium, fanns det en ökning av LD index under den exponentiella fasen, följt av en nedgång i den stationära fasen (figur 2A). Däremot i celler som odlas under kväve svält, fanns det en stadig ökning av LD index i både exponentiell och stationära faser (figur 2B). Eftersom båda kulturerna var igång med samma optiska densitet (liknande antal celler), visar resultaten LFR analysen hög kapacitet att upptäcka små förändringar i fettinnehållet (figur 2). Känsligheten för metoden bekräftades av konfokalmikroskopi: YPD-celler innehåller många små LDs i hela hela cellen, medan under kväve svält fanns det en viktig produktion av stora LDs, normalt 4-5 LDs per celler, (figur 2, just paneler A och B, respektive). Eftersom LD index inte är ett absolut värde av den neutrala fetthalten, bör en standardkurva som rör LD index med beloppet av triacylglycerols byggas. Denna metod användes för att studera dynamiken i Taggar syntes i S. cerevisiae20. Baserat på varje standardkurvan, LFR analysen kan vara används för att fastställa graden av lipid ackumulering i celler.

LD indexet kan följas i närvaro av soraphen A, en specifik hämmare av de acetyl-CoA ribulosbisfosfatkarboxylas, ett enzym som är nödvändigt för syntes av fettsyror som finns i de taggar som lagras i LDs25. Hämmaren lades till odlingsmediet efter 2 h tillväxt i avsaknad av en kväve källa, ett tillstånd där celler visade den högre frekvensen av lipid ackumulering (figur 2B). Enligt tidigare rapporter i S. cerevisiae, resulterade tillägg av soraphen-A i fullständig hämning av LD ansamling (figur 2B, ljusblå) 20,21.

För att ytterligare undersöka mobilizationen av LDs i U. maydis, överfördes celler som odlas under kväve svält för 72 h till YPD-medium (figur 3). LD index minskade efter en exponentiell funktion. Efter 24 h nådde LD index liknande värden som observerats i celler odlade i YPD-medium utan stress av kväve frånvaro (figur 2A). Eftersom cellerna skulle kunna mobilisera LDs ackumuleras under kväve svält, föreslår resultatet en minskning av halten taggar. Ett liknande svar rapporterades hos S. cerevisiae under studien av fosfataser inblandade i regleringen av lipid metabolism21.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av de olika stegen i LFR. Stegen i odlingsbetingelser är representativa för U. maydis jäst men kan anpassas till andra mikroorganism eller typ av celler. URF, enheter av återhämtning fluorescens; BD, bidistilled vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Dynamics av lipid droppar ackumulering i U. maydis. Jästceller var odlas för 24 h i YPD-medium, skördas och upphängd i a färskt YPD-medium (övre vänstra panelen) eller i (B) minimalmedium utan en kväve källa (nedre vänstra panelen-Mörk blå). Under kväve svält hämmades ökningen i LD index genom att lägga till 192 nM soraphen A i kultur media efter 2 h tillväxt (B, ljusblå). n = 3, data är det medelvärde ± SEM. Högra panelen: konfokalmikroskopi LDS i cell skördas på 24 h. (A) övre panelen: YPD-celler. (B) nedre panelen: celler utan en kväve-källa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: LDs mobilisering. Jästceller var odlas för 24 h i YPD-medium, skördas och odlas i färska YPD för 24 h (kontroll) eller i minimal medium utan en kväve källa för 72 h, sedan överförda till färsk-YPD medium och inkuberas för ytterligare 24 h. alikvoter var återkallat på indikerad tider för båda kulturerna att mäta mobilizationen av LDs av LFR. Data var försedd med en exponentiell förruttnelse formel (y = A·e-kt). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LFR är en ny metod som tillämpades för första gången att studera lipidmetabolism i S. cerevisiae och senare det var framgångsrikt genomfört i U. maydis20,21. Även om indexet LD inte ger ett absolut värde av de taggar som ackumuleras i cellerna, det ger en snabb bild av fettinnehållet av celler, och tolkningen av data är enkelt när LD index från två eller flera experimentella villkor jämförs. BODIPY 493/503 är mycket specifika för neutrala lipider, den viktigaste komponenten i LDs, och det har ett smalt emissionsspektrum underlätta samtidiga upptäckt av andra signaler som kommer från färgämnen som Mito-tracker eller CMAC blå när celler studeras av confocal mikroskopi26. Liksom många fluorescerande molekyler, BODIPY 493/503 är känslig för fotoblekning under fluorescence mikroskopi experiment, men denna process kan minskas genom att lägga till anti fotoblekning reagenser under exponering för ljus27. I sammandrag, kan BODIPY 493/503 användas i ett brett utbud av celler för att studera ackumulering och mobilisering av neutrala lipider21,22,23,28,29.

Metoden ska fungera måste någon gång beaktas. Eftersom den OD600 används för beräkning av indexet LD, bör morfologi av celler inte ha radikala förändringar under experimentet. Bevarandet av de intracellulära komponenterna under fixering av celler är också ett avgörande steg, och detta bevarande bör omfatta LDs, som är det huvudsakliga syftet med detta protokoll. Fastställande av cellerna med en lämplig förening är mycket viktigt för tillämpningen av denna metod till många typer av celler utan problem. Här, använde vi formaldehyd för att fixa strukturer i cellerna; aldehyden reagerar med amino grupperna av proteiner. Det har rapporterats att andra aldehyder också bevara strukturerar av ett brett utbud av celler och det verkar att det inte finns betydande förändringar i den protein struktur24,26. En nackdel med formaldehyd är att det inducerar små membran skador och vakuol formation nära den mitokondriella och nukleära membran, men dessa negativa effekter är gemensamma för alla aldehyd fixering metoder26. Organiska lösningsmedel som metanol eller aceton bör undvikas eftersom de bryts ned LDs i cellerna. Fixering med organiska lösningsmedel är baserad på uttorkning och utfällning av proteiner, som kan anses vara en negativ effekt. Dessutom, är användning av organiska lösningsmedel associerade med icke-specifik färgning.

Som någon annan teknik, kan LD index analysen ha begränsningar när den genomförs till andra system. Problem med spridning av BODIPY över svamp cellväggen, beroendet av fluorescensen på fettsyrasammansättning, typen av lipider och proteininnehållet i intracellulära lipid organ30, utgör hinder för en jämförelse av mängden Taggar mellan olika arter eller ens med samma celler odlas under olika näringsrika förhållanden. Även är stora morfologiska förändringar såsom övergången till mycel eller flockning av celler några av de problem som finns.

LD index-analysen är en hög genomströmning metod som kräver korta och små mängder av biomassa och reaktanterna. Analysen är tillförlitlig, och uppgifterna är exakta och reproducerbara. Dessutom, det ger riktlinjer för forskning om dynamiken i lipidmetabolismen i medicin, och det kan bli ett verktyg i bioteknik för high-throughput screening av oljehaltiga organismen för produktion av biobränslen eller foder oljor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att utlämnande

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag Instituto Politécnico Nacional-Secretaria de Investigación y Posgrado (IPN-SIP-20170864), Programa de Apoyo en Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT IN222117)-Universidad Nacional Autónoma de México () UNAM), och Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 254904-JPP och 256520-GGS). Fundação de Amparo en Pesquisa Rio de Janeiro (FAPERJ-Cientistas göra Nosso Estado: E 26/103.353/2011). Vi tack vare QFB. Oscar Iván Luqueño Bocardo för en schematisk översikt. Vi tackar Dr Miguel Tapia Rodríguez för värdefull hjälp i konfokalmikroskopi LDS. Vi vill tacka Dr Bruno Bozaquel Morais för hans banbrytande arbete med att utveckla tekniken i S. cerevisiae som vi anpassat för U. maydis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrophotometer Varioskan Lux multimode microplate reade D5879 Filter 493/503 or monochromator detector
Plate costar Corning Inc. 3615 96 well black-wall/clear bottom
Plate costar Corning Inc 3598 96 well cell culture plate costar
BODIPY 493/503 Invitrogen/ Thermofisher D3922 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene
Formaldehyde solution Sigma Aldrich 252549 ACS reagent, 37 wt % in H2O, contains 10-15% methanol to prevent polymerization
Potassium iodide Sigma Aldrich 60399 BioUltra, ≥ 99.5% (AT)
FB2 Ustilago maydis ATCC 201384 Basidiomycete-Yeast
Sodium chloride Sigma Aldrich 746398 ACS reagent, inorganic salt
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662 ACS reagent
Select Yeast Extract Sigma Aldrich Y100 Mixture of amini acids, peptides, water- soluble, vitamins and carbohydrates for culture media
N-Z case plus Sigma aldrich N4642 Casein enzymatic hydrolyzate from bovine milk
Glucose Sigma Aldrich G-8270 D (+) glucose
Skaker flask Pirex CLS4450250-6EA Borosiicate glass
Shaker SEV México INO650V-7 Orbital shaker
Centrifuge table Eppendorf 5415C Centrifuge
Microtubes Sigma Aldrich Z606340 Eppendorf
Pipet tips Axygen scientific T-200-Y Universal Pipet Tips with Bevelled End, 200 microliter, non sterile
mLine pipette Biohit 725130 8 channels, volume range 5-100 uL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. Journal of Cell Science. 122, (6), 749-752 (2009).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Current Biology. 25, (11), R470-R481 (2015).
  3. Sestric, R., Munch, G., Cicek, N., Sparling, R., Levin, D. B. Growth and neutral lipid synthesis by Yarrowia lipolytica on various carbon substrates under nutrient-sufficient and nutrient-limited conditions. Bioresource Technology. 164, 41-46 (2014).
  4. Raimondi, S., et al. Getting lipids from glycerol: new perspectives on biotechnological exploitation of Candida freyschussii. Microbial Cell Factories. 13, 83 (2014).
  5. Cescut, J., Fillaudeau, L., Molina-Jouve, C., Uribelarrea, J. L. Carbon accumulation in Rhodotorula glutinis induced by nitrogen limitation. Biotechnology for Biofuels. 7, 164 (2014).
  6. Galafassi, S., et al. Lipid production for second generation biodiesel by the oleaginous yeast Rhodotorula graminis. Bioresource Technology. 111, 398-403 (2012).
  7. Kot, A. M., Blazejak, S., Kurcz, A., Gientka, I., Kieliszek, M. Rhodotorula glutinis-potential source of lipids, carotenoids, and enzymes for use in industries. Applied Microbiology and Biotechnology. 100, (14), 6103-6117 (2016).
  8. Rakicka, M., Lazar, Z., Dulermo, T., Fickers, P., Nicaud, J. M. Lipid production by the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica using industrial by-products under different culture conditions. Biotechnology for Biofuels. 8, (2015).
  9. Zhu, Z. W., et al. Dynamics of the Lipid Droplet Proteome of the Oleaginous Yeast Rhodosporidium toruloides. Eukaryotic Cell. 14, (3), 252-264 (2015).
  10. Kolouchova, I., Mat'atkova, O., Sigler, K., Masak, J., Rezanka, T. Production of Palmitoleic and Linoleic Acid in Oleaginous and Nonoleaginous Yeast Biomass. International Journal of Analytical Chemistry. (2016).
  11. Radulovic, M., et al. The emergence of lipid droplets in yeast: current status and experimental approaches. Current Genetics. 59, (4), 231-242 (2013).
  12. Takahashi, Y., et al. Perilipin-Mediated Lipid Droplet Formation in Adipocytes Promotes Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1 Processing and Triacylglyceride Accumulation. Plos One. 8, (5), e64605 (2013).
  13. Thiam, A. R., Farese Jr, R. V., Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, (12), 775-786 (2013).
  14. Penno, A., Hackenbroich, G., Thiele, C. Phospholipids and lipid droplets. Biochimica et Biophysica Acta. 1831, (3), 589-594 (2013).
  15. Ageitos, J. M., Vallejo, J. A., Veiga-Crespo, P., Villa, T. G. Oily yeasts as oleaginous cell factories. Applied Microbiology and Biotechnology. 90, (4), 1219-1227 (2011).
  16. Athenstaedt, K., Daum, G. The life cycle of neutral lipids: synthesis, storage and degradation. Cellular and Molecular Life Sciences. 63, (12), 1355-1369 (2006).
  17. Marshall, L. L., Stimpson, S. E., Hyland, R., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Increased lipid droplet accumulation associated with a peripheral sensory neuropathy. Journal of Biological Chemistry. 7, (2), 67-76 (2014).
  18. Filipe, A., McLauchlan, J. Hepatitis C virus and lipid droplets: finding a niche. Trends in Molecular Medicine. 21, (1), 34-42 (2015).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. Journal of Clinical Investigation. 121, (6), 2102-2110 (2011).
  20. Aguilar, L. R., et al. Lipid droplets accumulation and other biochemical changes induced in the fungal pathogen Ustilago maydis under nitrogen-starvation. Archives of Microbiology. (2017).
  21. Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PLoS One. 5, (10), e13692 (2010).
  22. Madeira, J. B., et al. TORC1 Inhibition Induces Lipid Droplet Replenishment in Yeast. Molecular and Cellular Biology. 35, (4), 737-746 (2015).
  23. Maya-Monteiro, C. M., et al. Leptin induces macrophage lipid body formation by a phosphatidylinositol 3-kinase- and mammalian target of rapamycin-dependent mechanism. Journal of Biological Chemistry. 283, (4), 2203-2210 (2008).
  24. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Current Protocols in Cell Biology. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  25. Jump, D. B., Torres-Gonzalez, M., Olson, L. K. Soraphen A, an inhibitor of acetyl CoA carboxylase activity, interferes with fatty acid elongation. Biochemical Pharmacology. 81, (5), 649-660 (2011).
  26. Hobro, A. J., Smith, N. I. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  27. Chen, Y. T., Wan, L., Zhang, D. P., Bian, Y. Z., Jiang, J. Z. Modulation of the spectroscopic property of Bodipy derivates through tuning the molecular configuration. Photochemical & Photobiological Sciences. 10, (6), 1030-1038 (2011).
  28. Pagac, M., et al. SEIPIN Regulates Lipid Droplet Expansion and Adipocyte Development by Modulating the Activity of Glycerol-3-phosphate Acyltransferase. Cell Reports. 17, (6), 1546-1559 (2016).
  29. Qiu, B., Simon, M. C. BODIPY 493/503 Staining of Neutral Lipid Droplets for Microscopy and Quantification by Flow Cytometry. Bio-protocol. 6, (17), (2016).
  30. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
  31. Holliday, R. Ustilago maydis. Handbook of genetics. King, R. Plenum. New York. 575-595 (1974).
Lipid Index bestämning av flytande fluorescens återhämtning i den svamp patogener <em>Ustilago Maydis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).More

Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra- Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. J. Vis. Exp. (134), e57279, doi:10.3791/57279 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter