अलग माउस से लिम्फोसाइटों छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली
Summary
यहां हम आंत से जुड़े लसीकावत् ऊतक है Peyer पैच और draining mesenteric लिम्फ नोड्स सहित आगमनात्मक साइटों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है, और लेमिना propria और सहित प्रभाव साइटों छोटे आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली के आंत्र उपकला ।
Abstract
आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली enteropathogenic के लिए प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं बढ़ते जबकि आहार एंटीजन और खाना खानेवाला बैक्टीरिया को सहिष्णु प्रतिक्रियाओं पैदा करके जठरांत्र संबंधी मार्ग के बैरियर समारोह को बनाए रखने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है रोगाणुओं. इसके अलावा, यह स्पष्ट हो गया है कि स्थानीय आंत्र प्रतिरक्षा दूर और प्रणालीगत प्रतिरक्षा पर एक गहरा प्रभाव है । इसलिए, यह अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि कैसे एक आंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित है और क्या प्रतिक्रिया के immunologic परिणाम है । यहां, एक विस्तृत प्रोटोकॉल आंत की तरह छोटी आंत आगमनात्मक साइटों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए वर्णित है लसीकावत् ऊतक Peyer है पैच और draining mesenteric लिम्फ नोड्स और लेमिना propria की तरह प्रभाव साइटों और आंतों उपकला । इस तकनीक को स्वीकार्य समय की कमी के भीतर इष्टतम शुद्धता और व्यवहार्यता और ंयूनतम पार कंपार्टमेंट संदूषण के साथ छोटे आंत्र ऊतकों से लिम्फोसाइटों की एक बड़ी संख्या का अलगाव सुनिश्चित करता है । लिम्फोसाइटों और आंतों के ऊतकों से अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए तकनीकी क्षमता जठरांत्र संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की समझ में सक्षम बनाता है, कैंसर, और भड़काऊ रोगों.
Introduction
जठरांत्र (सैनिक) पथ के आंतरिक शरीर और बाहरी वातावरण को अलग करने का सबसे बड़ा इंटरफेस का प्रतिनिधित्व करता है कि कई परतों और दखलंदाजी है । आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली सैनिक पथ के बैरियर समारोह को बनाए रखने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है । यह लगातार आहार एंटीजन, खाना खानेवाला बैक्टीरिया, और रोगजनक रोगाणुओं के संपर्क में है । जैसे, यह खाद्य एंटीजन और खाना खानेवाला बैक्टीरिया के प्रति सहिष्णु रहना चाहिए, जबकि क्षमता के संरक्षण के लिए तेजी से enteropathogenic रोगाणुओं के लिए एक प्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पंन 1 । आंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली anatomically आगमनात्मक साइटों में विभाजित किया जा सकता है, जहां भोले लिम्फोसाइटों प्रतिजन आंतों म्यूकोसा से ले जाने वाले कोशिकाओं को पेश करके सक्रिय कर रहे हैं, और प्रभाव साइटों, जहां सक्रिय लिम्फोसाइटों लागू विशिष्ट प्रभाव2कार्य करता है । आगमनात्मक साइटों Peyer के पैच (पीपी) है कि विशेष एम कोशिकाओं और क्षेत्रीय draining mesenteric लिम्फ नोड्स (मिलियन) की कार्रवाई के माध्यम से सीधे आंत्र लुमेन सर्वेक्षण का आयोजन लसीकावत् संरचना शामिल । प्रभाव साइटों लेमिना propria (एल. पी.), जो तहखाने झिल्ली के नीचे संयोजी ऊतक है से मिलकर बनता है, और आंतों उपकला, एक एकल कोशिका परत तहखाने झिल्ली कि intraepithelial लिम्फोसाइटों (IEL) शामिल है के ऊपर स्थित है । लिम्फोसाइटों संक्रमण और कैंसर के खिलाफ संरक्षण मध्यस्थता और भी भड़काऊ रोगों में immunopathology के लिए योगदान कर सकते हैं कि अनुकूली उन्मुक्ति के प्रमुख खिलाड़ी हैं । यह महत्वपूर्ण है और उच्च इन विशिष्ट संरचनात्मक श्लैष्मिक डिब्बों में लिम्फोसाइटों अध्ययन करने के लिए बेहतर उनके प्रेरण और प्रभाव कार्यों को समझने के लिए प्रासंगिक है ।
इन डिब्बों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और एकीकृत प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा आंतों में होने वाली घटनाओं की खोज जांचकर्ताओं की संख्या में तेजी लाने के रूप में की जरूरत है । कई अनुसंधान समूहों प्रोटोकॉल है कि माउस से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए कई समान प्रक्रियाओं साझा प्रकाशित किया है छोटे आंत्र डिब्बों3,4,5,6,7 . हालांकि, व्यक्तिगत प्रोटोकॉल के फ़ोकस के आधार पर उनमें कई तकनीकी अंतर होते हैं । उदाहरण के लिए, एल. पी. से प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने पर ध्यान देने के साथ, एक प्रोटोकॉल सेल व्यवहार्यता, कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति, और अलग प्रतिरक्षा कोशिकाओं की संरचना पर विभिन्न एंजाइमी के प्रभाव का परीक्षण5. एक अंय प्रोटोकॉल घनत्व केंद्रापसारक6के बिना लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए एक तेजी से और reproducible विधि पर प्रकाश डाला गया । अंत में, विशिष्ट प्रोटोकॉल भी छोटी आंत के विभिंन ऊतक परतों से mononuclear फ़ैगोसाइट अलग करने के प्रयोजन के लिए मौजूद7। यहां, एक उच्च reproducible प्रोटोकॉल है कि मिलियन से लिम्फोसाइट आबादी की अनुक्रमिक अलगाव की अनुमति देता है, पीपी, एल. पी., और छोटी आंत के IEL डिब्बे प्रस्तुत किया है ।
हम एल. पी. और IEL डिब्बों से अत्यधिक शुद्ध आबादी को अलग करने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो अन्य आंतों के डिब्बों से संदूषणों से काफी हद तक मुक्त हैं. यह व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल स्वीकार्य समय की कमी4,8,9,10,11,12के भीतर अधिक से अधिक शुद्ध और व्यवहार्य लिम्फोसाइटों की एक उच्च उपज पैदा करता है । यह प्रोटोकॉल भी एल ई सी और IEL डिब्बे से लिम्फोसाइटों के अलगाव को ंयूनतम पार कंपार्टमेंट संदूषण के साथ सुनिश्चित करता है, एक बोना के लिए इन विशिष्ट डिब्बों में लिम्फोसाइटों अध्ययन के अवसर की अनुमति । अलग लिम्फोसाइटों प्रवाह cytometric विश्लेषण या कार्यात्मक विश्लेषण की तरह आगे जोड़तोड़ के अधीन किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक माउस से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए लागू किया गया है छोटी आंत और इस तरह के रूप में बैक्टीरियल संक्रमण के दौरान बृहदांत्र लिस्टिरिया monocytogenes, साल्मोनेला typhimurium, और Yersinia pseudotuberculosis रासायनिक और रोगज़नक़ प्रेरित कोलाइटिस के रूप में संक्रमण और भड़काऊ स्थितियों । इस प्रोटोकॉल भी वृक्ष कोशिकाओं, मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल, और माउस छोटी आंत और बृहदांत्र से monocytes जैसे जंमजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक विस्तृत प्रोटोकॉल आंत्र श्लैष्मिक आगमनात्मक (मिलियन और पीपी) और प्रभाव (एल पी एस और IEL डिब्बे) साइटों से लिम्फोसाइटों के अलगाव के लिए प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल उत्पादकता और परिणाम को अधिकतम करने क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. NIH अनुदान (R01 AI076457) और पथरीले ब्रूक विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई निधियों द्वारा समर्थित है । Z.Q. को NIH ग्रांट (K12 GM102778) द्वारा सपोर्ट किया जाता है ।
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
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