Isolera lymfocyter från mus små Intestinal immunförsvaret
Summary
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för isolering av lymfocyter från de induktiva webbplatser inklusive Peyers plack i tarmen-associerade lymfoida vävnad och dränerande mesenteriala lymfkörtlar, och effektor webbplatser inklusive lamina propria och intestinal epitel av små tarmens immunförsvar.
Abstract
Intestinal immunsystemet spelar en viktig roll i att upprätthålla barriärfunktionen i mag-tarmkanalen genom att generera tolerant Svaren till kosten antigener och kommensaler bakterier medan montering effektivt immunsvar mot enteropathogenic mikrober. Dessutom har det blivit tydligt att lokala intestinal immunitet har en djupgående inverkan på avlägsna och systemisk immunitet. Det är därför viktigt att studera hur ett intestinal immunsvar induceras och vad immunologisk resultatet av svaret. Här, ett detaljerat protokoll beskrivs för isolering av lymfocyter från tunntarmen induktiva platser som Peyers plack i tarmen-associerade lymfoida vävnad och dränerande mesenteriala lymfkörtlar och effektor sajter som lamina propria och intestinal epitel. Denna teknik garanterar isolering av ett stort antal lymfocyter från små intestinal vävnader med optimal renhet och livskraft och minimal compartmental korskontaminering inom godtagbar tidsbegränsningar. Teknisk kapacitet att isolera lymfocyter och andra immunceller från intestinal vävnader kan förståelsen av immunsvar mot gastrointestinala infektioner, cancer och inflammatoriska sjukdomar.
Introduction
Mag-(GI) tarmkanalen har många veck och utskjutande delar som representerar den största gränssnitt skiljer den inre kroppen och den yttre miljön. Intestinal immunsystemet spelar en viktig roll i att upprätthålla funktionen hinder i mag-tarmkanalen. Det utsätts ständigt för kosten antigener, kommensaler bakterier och patogena mikrober. Som sådan, måste det vara tolerant mot livsmedels antigener och kommensaler bakterier samtidigt bevara kapacitet att snabbt generera ett effektivt immunsvar mot enteropathogenic mikrober1. Intestinal immunsystemet kan delas anatomiskt i induktiva, där naiva lymfocyter aktiveras av antigenpresenterande celler bär antigener från tarmslemhinnan, och effektor platser, där aktiverade lymfocyter utöva viss Effector funktioner2. De induktiva platserna omfattar organiserad lymfoida struktur Peyers plack (PP) att undersökningar intestinala lumen direkt genom åtgärder av specialiserade M celler och regionala dränerande mesenteriala lymfkörtlar (MUSD). Effector webbplatser består av lamina propria (LP), som är bindväv under basalmembranet och intestinala epitelet, ett enda cell lager ovanför basalmembranet som innehåller intraepitelial (IEL). Lymfocyter är stora aktörer av adaptiv immunitet som medla skydd mot infektioner och cancer och kan också bidra till immunopathology i inflammatoriska sjukdomar. Det är viktigt och mycket relevant att studera lymfocyter i dessa skilda anatomiska slemhinnor fack att bättre förstå deras induktion och effektor funktioner.
Ett relativt enkla och enhetliga protokoll för isolering av lymfocyter från dessa avdelningar behövs eftersom antalet utredare att utforska immun händelser som inträffar i tarmen accelererande. Flera forskargrupper har publicerat protokoll som delar flera liknande processer för att isolera immunceller från mus små intestinal fack3,4,5,6,7 . Det finns dock flera tekniska skillnader bland dem beroende på fokus för enskilda protokollet. Exempelvis med fokus på isolera immunceller från LP, undersöker protokoll effekterna av olika enzymatisk tumörheterogenitet på cellernas viabilitet, cell surface markör uttryck och sammansättningen av isolerade immunceller5. Ett annat protokoll belyser en snabb och reproducerbar metod för isolering av lymfocyter utan densitet centrifugering6. Slutligen finns också särskilda protokoll i syfte att isolera mononukleära fagocyter från olika vävnad skikt av tunntarmen7. Här presenteras en mycket reproducerbara protokoll som tillåter sekventiell isolering av lymfocyter befolkningen från MLN, PP, LP och IEL facket av tunntarmen.
Vi fokuserar på isolera högrenade populationer från LP och IEL facken, som är gratis på föroreningar från andra intestinala fack. Ofta används detta protokoll ger en hög avkastning av maximally ren och livskraftig lymfocyter inom godtagbar tid begränsningar4,8,9,10,11,12. Detta protokoll garanterar också isoleringen av lymfocyter från LP och IEL facket med minimal compartmental korskontaminering, att låta en bona fide möjlighet att studera lymfocyter i dessa skilda avdelningar. Isolerade lymfocyterna kan genomgå ytterligare manipulationer som flödet flödescytometrisk analys eller funktionell analys. Detta protokoll har framgångsrikt tillämpats på isoleringen av lymfocyter från mus tunntarmen och tjocktarmen under bakterieinfektioner såsom Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumoch Yersinia pseudotuberculosis infektioner och inflammatoriska tillstånd såsom kemiska – och patogen-inducerad kolit. Detta protokoll kan också användas för att isolera innate immuna celler såsom dendritiska celler, makrofager, neutrofiler och monocyter från mus tunntarm och kolon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett detaljerat protokoll presenteras för isolering av lymfocyter från den intestinal mucosal induktiva (MUSD och PP) och effektor (LP och IEL fack) webbplatser. Protokollet har utvecklats för att balansera input (tid) och output (lönsamhet och avkastning) för att maximera produktivitet och resultat. Protokollet garanterar också minimal compartmental korskontaminering mellan LP och IEL fack.
Flera protokoll för isolering av immunceller från mus tunntarmen har varit publicerade<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. stöds av NIH grant (R01 AI076457) och medel från Stony Brook University. Z.Q. stöds av NIH bevilja (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
