Isolere lymfocytter fra musen liten Intestinal immunsystemet
Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll for isolering av lymfocytter fra de induktive nettstedene inkludert gut-assosiert lymfoid vev Peyers oppdateringer og drenering hvem lymfeknuter og effektor områdene inkludert lamina propria og intestinal epitel i små intestinal immunsystemet.
Abstract
Intestinal immunsystemet spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen barriere i fordøyelsessystemet ved å generere tolerant Svar å kosttilskudd antigener og gram-negative bakterier mens montering effektiv immunreaksjoner til enteropathogenic mikrober. I tillegg har det blitt klart at lokale intestinal immunitet har en betydelig innflytelse på fjernt og systemisk immunitet. Derfor er det viktig å studere hvordan en intestinal immunrespons er indusert og hva immunologic utfallet av svaret. Her en detaljert protokoll er beskrevet for isolering av lymfocytter fra tynntarm induktiv nettsteder som gut-assosiert lymfoid vev Peyers oppdateringer og drenering hvem lymfeknuter og effektor nettsteder som lamina propria og intestinal epitel. Denne teknikken sikrer isolering av et stort antall lymfocytter fra små intestinal vev med optimal renhet og levedyktighet og minimal avdelingsflytting krysskontaminering innen akseptabel tidsbegrensninger. Teknisk mulighet til å isolere lymfocytter og andre immunceller fra intestinal vev gjør forståelsen av immunreaksjoner gastrointestinale infeksjon, kreft og inflammatoriske sykdommer.
Introduction
Fordøyelsessystemet (GI) har mange folder og utstikkende deler som representerer det største grensesnittet skille selve interne og eksterne miljøet. Intestinal immunsystemet spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen barriere i mage-tarmkanalen. Det er stadig utsatt kosttilskudd antigener og gram-negative bakterier patogene mikrober. Som sådan, må det være tolerant mat antigener og gram-negative bakterier samtidig bevare evnen til å raskt generere en effektiv immun respons til enteropathogenic mikrober1. Intestinal immunsystemet kan anatomisk deles inn i induktiv, hvor naiv er aktivert av antigen presentere celler bærer antigener fra tarmen, og effektor områder, der aktivert lymfocytter utøve bestemte effektor fungerer2. De induktive nettstedene utgjør organisert lymfoide strukturen Peyers lapper (PP) som undersøkelser av intestinal lumen direkte gjennom handlingen av spesialiserte M celler og regionale drenering hvem lymfeknuter (MLN). Webområdene effektor består av lamina propria (LP), som er bindevevet under kjelleren membranen og intestinal epitel, en enkeltcelle lag over kjelleren membranen som inneholder intraepithelial lymfocytter (IEL). Lymfocytter er viktige spillere av adaptiv immunitet som megle beskyttelse mot infeksjoner og kreft, og kan også bidra til immunopathology i inflammatoriske sykdommer. Det er viktig og svært relevant å studere lymfocytter i disse forskjellige anatomiske mucosal avdelinger å bedre forstå sine induksjon og effektor funksjoner.
En relativt enkel og enhetlig protokoll for isolering av lymfocytter fra seksjonene er nødvendig som antall etterforskere utforske immun hendelser som forekommer i tarmen akselererer. Flere forskningsgrupper har publisert protokoller som deler flere lignende prosesser for å isolere immunceller fra musen liten intestinal rom3,4,5,6,7 . Det er imidlertid flere tekniske forskjeller mellom dem avhengig av fokus for individuelle protokollen. For eksempel, med fokus på isolere immunceller fra LP, undersøker en protokoll virkningen av ulike enzymatisk digestions celle levedyktighet, celle overflaten markør uttrykk og sammensetningen av isolerte immunceller5. En annen protokoll fremhever en rask og reproduserbar metode for isolering av lymfocytter uten tetthet sentrifugering6. Til slutt finnes bestemte protokoller også for å isolere mononukleære phagocytes fra ulike vev lag av tynntarmen7. Her, presenteres en svært reproduserbar protokoll som tillater sekvensiell isolasjon av lymfocytt befolkningen fra MLN, PP, LP og IEL rommet i tynntarmen.
Vi fokuserer på isolere høyrenset bestander fra LP og IEL rom, som er hovedsakelig forurensninger fra andre intestinal avdelinger. Dette brukte protokollen gir en høy avkastning av maksimalt ren og levedyktig lymfocytter innen akseptabel tid begrensninger4,8,9,10,11,12. Denne protokollen sikrer også isolering av lymfocytter fra LP og IEL rommet med minimal avdelingsflytting krysskontaminering, slik at en bona fide mulighet til å studere lymfocytter i forskjellige seksjonene. Isolert lymfocytter kan utsettes for ytterligere manipulasjoner som flyt cytometric analyse eller funksjonell analyse. Denne protokollen utlignet ble til isolering av lymfocytter fra musen tynntarm og tykktarm under bakterielle infeksjoner som Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumog Yersinia pseudotuberculosis infeksjoner og inflammatoriske tilstander som kjemisk – og patogen-indusert kolitt. Denne protokollen kan også brukes til å isolere medfødte immunsystemet celler som dendrittiske celler, makrofager, nøytrofile og monocytter fra musen tynntarm og tykktarm.
Protocol
Representative Results
Discussion
En detaljert protokoll presenteres for isolering av lymfocytter fra den intestinal slimhinnene induktiv (MLN og PP) og effektor (LP og IEL rom). Protokollen er utviklet for å balansere (tid)-inngang og utgang (levedyktighet og avkastning) for å maksimere produktiviteten og resultater. Protokollen sikrer også minimal avdelingsflytting krysskontaminering mellom LP og IEL rom.
Flere protokoller for isolering av immunceller fra tynntarm musen har vært publisert3,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.S.S. støttes av NIH grant (R01 AI076457) og midler fra Stony Brook University. Z.Q. støttes av NIH gi (K12 GM102778).
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| L-glutamine | Sigma-aldrich | G3126-100G | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15710-072 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 21870-076 | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 26140-079 | |
| 10x Hanks' balanced salt solution | Sigma-aldrich | H4641-500ML | |
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-aldrich | D9680-5G | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575-020 | |
| Calsium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | 21108-500G | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-aldrich | M2670-100G | |
| Collagenase, Type I | Life Technologies | 17100-017 | |
| DG gradient stock solution (Percoll) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Biolegend | 420301 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | 352350 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Erlenmeyer flask | Kimble | 26500R-50mL | |
| Magnetic stirrer | Thermo Fisher | 50094596 | |
| Stir bar | Fisher Scientific | 14-512-148 |
References
- Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
- Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer’s patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , 19 (2001).
- Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , 19 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
- Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
- Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
- Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
- Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
- Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
- Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
- Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
- Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
- Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
