Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generere transgene planter med enkelt-kopi innsettinger bruker BIBAC-GW binære vektor

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Bruke en pBIBAC-GW binære vektor gjør genererer transgene planter med intakt enkelt-kopi innsettinger, en enkel prosess. Her presenteres en rekke protokoller som veileder leseren gjennom prosessen med å generere transgene Arabidopsis planter og testing planter for intactness og kopierer antall skivene.

Abstract

Når du genererer transgene planter, vanligvis er målet å ha stabilt uttrykk for en transgene. Dette krever en enkelt, intakt integrasjon av transgene, som flere kopier integrasjoner ofte gjennomgår genet stanse. Gateway-kompatible binære vektor basert på bakteriell kunstig kromosomene (pBIBAC-GW), som andre pBIBAC derivater, tillater innsetting av enkelt-kopi effekter av transgener med høy effektivitet. Som en forbedring til den opprinnelige pBIBAC, er en Gateway kassett blitt klonet i pBIBAC-GW, slik at sekvenser av interesse kan nå enkelt innlemmes i vektor overføring DNA (T-DNA) av Gateway kloning. Vanligvis transformasjonen med pBIBAC-GW resulterer i en virkningsgrad på 0,2-0,5%, der halvparten av transgenics bære en intakt enkelt-kopi integrasjon av T-DNA. PBIBAC-GW vektorer er tilgjengelig med motstand mot Glufosinate-ammonium eller DsRed fluorescens i frø frakker velges i planter, og motstand mot kanamycin som en markering i bakterier. Her en rekke protokoller er presentert som veileder leseren gjennom prosessen med å generere transgene planter ved hjelp av pBIBAC-GW: fra recombining sekvenser av interesse i pBIBAC-GW vektoren valgfrihet, plante transformasjon med Agrobacterium, transgenics, og teste planter for intactness og kopierer antall innsettinger bruker DNA blotting. Oppmerksomhet er gitt til utforme en DNA blotting strategi å gjenkjenne enkelt - og multi - kopi integreringer på én eller flere loci.

Introduction

Når du genererer transgene planter, er vanligvis målet å ha integrert transgene(s) stabilt uttrykt. Dette kan oppnås ved intakt enkeltutgave integrasjoner av en transgene. Flere integrasjoner kan føre til økt uttrykk for en transgene, men også å slå av genet. Stanse effekter av transgener er mer sannsynlig hvis innsatte sekvenser er ordnet i tandem eller invertert gjentar1,2,3,4. Binær vektorer er brukt som transport i Agrobacterium-mediert transformasjon eksperimenter for å levere sekvenser av interesse i anlegget genomer. Hvor mange integreringer til et anlegg genom er avhengig av kopien antall binære vektoren i Agrobacterium tumefaciens5,6. Mange brukte binære vektorer er høy kopi vektorer, og dermed gi en høy gjennomsnittlig transgene kopi nummer: 3,3 til 4.9 kopier i Arabidopsis5.

Antall T-DNA integrasjoner kan senkes ved hjelp av binær vektorer som har en lav-kopi nummer i A. tumefaciens, som BIBAC7, eller ved å lansere en T-DNA fra A. tumefaciens kromosom5. Gjennomsnittlig antall transgene integrasjoner i slike tilfeller er under 25,8,9,10. Grunn til å være enkelt-kopi i A. tumefaciens, og også i Escherichia coli, BIBAC-derivater kan opprettholde og levere konstruksjoner opptil 150 kb11.

GW-kompatible BIBAC vektorer10,12 tillate enkel innføring av gener av interesse i vektoren bruker Gateway kloning. Bruk av Nøkkelteknologien forenkler kloning prosedyren, men overvinner også vanlige problemer forbundet med store antall lav-Kopier vektorer13,14, som en lav DNA avkastning og et begrenset utvalg av unike begrensning nettsteder tilgjengelig for kloning7,11. PBIBAC-GW derivater er tilgjengelig med enten motstand mot Glufosinate-ammonium (pBIBAC-BAR-GW) eller DsRed fluorescens i frø strøk (pBIBAC-RFP-GW) velges i planter (figur 1)10,12. For både vektorer brukes en kanamycin motstand genet som markøren i bakterier.

PBIBAC-GW vektorer kombinere: (1) lett design og genetisk manipulasjon i E. coli, (2) intakt enkelt-kopi integrasjoner og planta med høy effektivitet. PBIBAC-GW vektorer avkastningen på gjennomsnittlig 1,7 integreringer i Arabidopsis omtrent halvparten av transgene planter bærer en enkelt integrert T-DNA10.

Stabil uttrykk for effekter av transgener er en forutsetning for de fleste transgenics generert. Stabil transgene uttrykk kan oppnås ved intakt, enkelt-kopi integrasjoner. Arbeide med transgene planter bærer intakt, enkelt-kopi integrasjoner er enda mer viktig hvis for eksempel målet er å studere effektiviteten i chromatin prosesser, som mutagenese, rekombinasjon, eller reparer og avhengigheten av disse prosesser på hvor genomisk og chromatin strukturen ved innsetting site. For vår interesse, for å studere avhengigheten av oligonucleotide regissert mutagenese (ODM) på lokal genomisk sammenheng, ble et sett med reporter linjer med intakt, enkelt-kopi integrasjoner med et mutagenese reporter generert (figur 2)10. Bruker dette settet med linjer, ble det vist at ODM effektiviteten varierer mellom transgene loci integrert på forskjellige genomisk steder, til tross for transgene uttrykk nivåene blir ganske likt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sette sekvenser av interesse i binær vektor

  1. Forberede Gateway oppføring og binære vektorer.
    1. Isolere Gateway oppføring vektoren som inneholder et DNA fragment eller genet av interesse ved hjelp av en mini prep kit i samsvar med forslag til leverandøren.
      Merk: BIBAC-GW vektorer krever bruk av kanamycin (Km) velges i bakterier, derfor, bruker en oppføring vektor med en annen motstand markør i stedet for kanamycin. For eksempel er pENTR-gm vektoren, bærer en Gentamicin motstand genet, et godt valg12.
    2. Overføre og isolere BIBAC-GW vektoren rundt. Bruk en E. coli belastning som er motstandsdyktig mot toksisitet av ccdB genet stede i Gateway kassetten. Isolere BIBAC-vektorer ved hjelp av protokoller eller kits er utformet spesielt for store plasmider i samsvar med forslag til leverandøren.
  2. Utføre en Gateway reaksjon.
    1. Forberede LR rekombinasjon reaksjonen i samsvar med forslag til leverandøren. Bland følgende komponenter i en 1,5 mL microcentrifuge rør ved romtemperatur (RT): 100-300 ng posten klone (supercoiled), 300 ng av BIBAC-GW vektor, LR Clonase reaksjon buffer (siste konsentrasjon: 1 x). Justere volumet på blandingen til 16 µL med TE (10 mM Tris, 1 mM av EDTA, pH 8.0). Til slutt Legg 4 µL av LR Clonase enzym mix og blanding av vortexing. Inkuber blandingen ved 25 ° C i 1 time.
    2. Avslutte LR reaksjonen ved å legge til 2 µL proteinasen K løsning (2 µg/µL) til blandingen i trinn 1.2.1. Bland og ruge ved 37 ° C i 10 min.
  3. Forvandle E. coli med reaksjonsblandingen Gateway ved electroporation.
    1. Desalt LR reaksjonsblandingen før electroporation.
      Merk: Dette trinnet er avgjørende for vellykket electroporation. Under en dialyse metoden er beskrevet, men andre metoder som nedbør med natrium acetate og etanol kan også brukes.
      1. Forberede oppsettet filter dialyse av LR reaksjonen. Hell 20 mL ultrapure deionisert vann i et sterilt Petriskål. Plasser en membran filter disk (pore størrelse = 0.025 µm) på vannflaten.
      2. Pipetter hele LR reaksjonen nøye over membranen og la blandingen til dialyze på RT 1t.
    2. Legge til 5 µL av avsalte LR miksen electro-kompetent DH10B celler i en electroporation cuvette (0,1 cm). Electroporate cellene (1,5 V/cm, motstand 200 Ω, kapasitans 25 µF) og umiddelbart legge 1 mL forvarmes Super Optimal Catabolite undertrykkelse (SOC) medium til cellene, etterfulgt av inkubasjon ved 37 ° C i 45 minutter, 180 rpm. (SOC medium, 1 L: 20 g Bacto tryptone, 5 g av gjær ekstrakt, 0,5 g NaCl, 2,5 mL 1M KCl, 20 mL 1 M filter-steriliseres glukose).
      Merk: DH10B celler kan erstattes for andre E. coli celler som stabilt opprettholde store plasmider.
      Merk: Forholdene optimale electroporation er avhengig av electroporation enheten brukes.
    3. Pellets bakterier med maksimal hastighet for 30 s med en microcentrifuge, fjerne overflødig SOC og resuspend pellet på ca 50-100 µL av Luria-Bertani (LB) medium. Spre bakterier på kanamycin-LB (Km-LB) plater (Km konsentrasjon, 40 µg/mL) og ruge platene på 37 ° C over natten. (LB medium, 1 L: 10 g Bacto tryptone, 5 g av gjær ekstrakt, 10 g av NaCl. Solid medium legge agar, 15 g/L).
  4. Identifisere recombined BIBAC-GW derivater og isolere plasmider DNA.
    1. For å kunne vokse på Km-LB plater, skal E. coli cellene inneholde den recombined BIBAC-GW plasmider der ccdB sekvensen erstattes med den ønskede inn. Bruk kolonien Polymerase kjedereaksjon (PCR)15 å sjekke hvis bakterier koloniene på platen inneholder riktig plasmider, BIBAC-GW ryggraden og sette av interesse.
      1. For å identifisere pBIBAC-BAR-GW ryggraden, utføre en PCR15 reaksjon primere DM1969 5-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 "og DM1970 5-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3". Denne primer sett forsterker et 563 bp fragment av bar genet.
      2. For å sjekk for tilstedeværelse av BIBAC-RFP-GW ryggraden, utføre en PCR15 reaksjon, bruke grunning M737 5-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 "og M892 5-AACAGATGGTGGCGTCCC-3". Denne primer kombinasjonen forsterker et 791 bp fragment overlappende cruciferin promotor og rfp sekvensen.
      3. Utføre PCR15 reaksjoner med gene-spesifikke primere etter tilstedeværelsen av sette av interesse.
    2. Vaksinere en enkelt positiv koloni i 2-5 mL av LB medium som inneholder kanamycin (40 µg/mL) for DNA isolasjon16. Ruge på 37 ° C på en orbital shaker på 180 rpm, over natten.
    3. Isolere plasmider DNA (se trinn 1.1.2).

2. utarbeidelse av A. tumefaciens for Floral dyppe av Arabidopsis

  1. Transformere BIBAC-GW derivater til A. tumefaciens.
    1. Forberede electro-kompetent celler av A. tumefaciens belastning C58C1 bærer pCH32 helper plasmider7. Vokse bakterier i nærvær av tetracycline (5 µg/mL) og og (100 µg/mL) Velg for pCH32 og sikre vekst av bare Agrobacterium celler.
    2. Legge til 0,25-0,5 µg DNA av en pBIBAC-GW derivat, pre oppløst i 10-20 µL sterilt ultrapure deionisert vann, 20 µL kompetent Agrobacterium celler i electroporation cuvettes (0,1 cm). Holde celler på is.
    3. Electroporate cellene (1,5 V/cm, motstand 400 Ω, kapasitans 25 µF). Umiddelbart etter electroporation, legge til 1 mL forvarmes (28 ° C) SOC medium bakterier og ruge cellene på 28 ° C i 60-90 min.
    4. Spre 100 µL og resten av bakterier på separate LB plater inneholder og (100 µg/mL), tetracycline (5 µg/mL) og kanamycin (40 µg/mL) og ruge i mørket på 28 ° C i 1-2 dager.
  2. Forberede Agrobacterium suspensjon.
    1. Sjekk av PCR et par A. tumefaciens koloniene fra platen i trinn 2.1.4, etter riktig vektoren (se trinn 1.4.1).
    2. Strek en enkelt koloni bekreftet for å inneholde binære vektoren med den passer inn på en LB plate inneholder antibiotika (se trinn 2.1.4). Vokse i 28 ° C over natten.
    3. Gjenta striper med en enkelt colony fikk i trinn 2.2.2.
    4. Vaksinere en enkelt koloni i 2,5 mL av LC medium med antibiotika (se trinn 2.1.4) for preculture. Ruge på 28 ° C i minst 8 timer eller over natten, 180 rpm. (LC medium, 1 L: 10 g Bacto tryptone, 5 g av gjær ekstrakt, 0,5 g NaCl, 2.5 g av MgSO4 · 7T2O, 2 g av Maltose).
    5. Legg til preculture fra trinn 2.2.4. til 250 mL LC supplert med antibiotika (se trinn 2.1.4) og vokse på 28 ° C, 180 RPM, over natten.
    6. Pellet kulturen av snurrende 5500 x g i 12 min. re avbryte pellet 100 mL løsning som inneholder 5% sukrose, 0,05% Silwet L-77, 0.5 x MS. hell suspensjon i et sterilt beholder for floral dyppe av plantene.

3. Arabidopsis transformasjon

  1. Forberede Arabidopsis planter for transformasjon.
    1. Vokse Arabidopsis planter i et drivhus eller klima kontrollerte vekst kammer før de er blomstrende (12 potter med 9 planter hver per dipping).
    2. Klippet første bolter for å tillate flere sekundære bolter å dukke. Planter er klar for dipping 4-6 dager etter klipping, når plantene har mange umodne blomst-hoder og ikke mange befruktet siliques.
  2. Floral dipping
    1. Dypp inflorescences for 5-10 s i Agrobacterium suspensjon i trinn 2.2.6. Bruk milde agitasjon.
    2. Pakk de over bakke delene av planter i plastfolie å holde fuktighet høy, og dekke blomsterpotter med en boks å holde plantene i mørket. Inkuber planter for 2 dager i et drivhus/vekst kammer.
    3. Fjerne boksen og i plastfolie og vokse planter til forfall i et drivhus/vekst kammer.
      Merk: For å øke effektiviteten av transformasjon, samme planter kan være nytt dyppet 7 dager etter den første.
    4. Høste frøene. Samle og analysere frø (T1) av planter, forvandlet med samme konstruere, som et sett.
  3. Skjermen for transgene planter.
    1. Til skjermen for transgene planter forvandlet en pBIBAC-RFP-GW derivat, analysere frøene med fluorescens mikroskopi. For å oppdage DsRed uttrykk i frø frakker, bilde frøene excitation av 560 nm og utslipp av 600-650 nm. Skille fluorescerende frø fra ikke-fluorescerende kolleger ved hjelp av pinsett.
    2. Til skjermen for transgene planter forvandlet en pBIBAC-BAR-GW derivat, sår frø i skuffer fylt med jord (~ 2500 frø/0.1 m2). For å sikre en selv spredning av frø over skuffer, suspendere frø i 0,1% agar i 0,5 x Murashige Skoog medium (MS), og spre frøene med en 1 mL pipette.
      Merk: For å stimulere frøene til å spire i en synkron måte, ruge frøene i minst 2 dager på 4 ° C. Dette kan gjøres før eller etter sådde frøene.
      1. Spray seedlings med 0,5% Glufosinate-ammonium løsning 2 uker og 3 uker etter sår i skuffene. Bruke 500 mL av Glufosinate-ammonium løsning per 1 m2.
      2. Overføre overlevende spirene til individuelle potter. Et typisk bilde av en brett av før og etter (andre) Glufosinate-ammonium behandling er vist i Figur 3.
      3. Analysere Glufosinate-ammonium-resistente planter av PCR for tilstedeværelsen av Konstruer av interesse (se trinn 1.4.1. for primere).
        1. Isolere genomisk anlegget DNA for PCR med metoden beskrevet av Edwards et al. 17

4. karakteriserer Transgenics for antall og integriteten til T-DNA integrasjoner

  1. Strategi for begrensning digestions
    Merk: Bestemme antall T-DNA integrasjoner og deres integritet av DNA blotting bruker begrensningen enzymer. Denne metoden tillater for å identifisere enkelt, men også gjentatt integreringer på de samme eller forskjellige loci i genomet.
    1. Bruk en rekke begrensning digestions for å identifisere ulike integrering mønstre mulig:
      1. Velg et enzym som kutter en gang i T-DNA, kunne uavhengig sonde sekvenser oppstrøms og nedstrøms webområdet begrensning (figur 4A og Figur 7A-C). Se figur 4Aog figur forklaringen for forventede resultater og tolkning.
      2. Velg et enzym eller kombinasjon av enzymer kutte ut hele sekvensen av interesse samtidig (figur 4B og figur 7A-D). Eventuelle avvik fra kjente lengden angir trunkering av integrert kassetten.
        Merk: Pass på å bare bruke begrensning enzymer som ikke er følsom for cytosine metylering.
  2. Forberede genomisk DNA-prøvene.
    1. Isolere genomisk DNA fra planter bærer Konstruer av interesse. CTAB DNA miniprep metode kan brukes for DNA isolasjon18. For DNA blot analyse av Arabidopsis DNA, 2-2,5 µg genomisk DNA er nødvendig. Oppløse DNA i 50 µL av TE.
    2. Kontrollere DNA integritet av gel geleelektroforese16. Intakt genomisk DNA overfører som en diskret band på toppen av gel. DNA fornedrelse kan gjenkjennes som tilstedeværelse av en smøre. For å unngå DNA skade gjentatt frysing-tining, holdes genomisk DNA-prøver på 4 ° C.
    3. Fordøye genomisk DNA (2-2,5 µg ved Arabidopsis genomisk DNA) i et totalt volum på 50 µL, over natten, buffer betingelser foreslått av enzymet leverandøren.
      1. I et reagensrør, bland 2-2,5 µg Arabidopsis genomisk DNA, 5 µL 10 x begrensning buffer og 5 U begrensning enzym i totalt 50 µL ultrapure deionisert vann.
    4. Legge til lasting fargestoff (1 x siste konsentrasjon) begrensning prøvene før lasting på en gel. For god visuell sporing, bruk en av følgende: comigrating med små fragmenter (Bromophenol blå, 350-400 bp), eller comigrating med større fragmenter (Cylene cyanol, 3-4 kbp).
  3. Kjør DNA gel.
    1. Forberede en lang (20 cm) 0.5 x TBE agarose gel19. Prosent av agarose i gel avhenger fragment størrelsene forventet. 0,8-1% optimalt skiller fragmenter > 1 kb inne størrelse. Bruk 1-1,5% agarose for fragmenter < 1 kb. Ikke Legg til Ethidium Bromide gel. (5 x TBE, 1 L: 54 g Trizma base, 27.5 g borsyre, 3.75 g av EDTA).
      Merk: For å hindre DNA forurensning, bruk gel skuffer som ikke brukes til å smuldre vekk plasmider og PCR forsterket DNA.
    2. Last prøvene gel19.
    3. Legge til DNA-markører gel som er innenfor størrelsen av forventet fragmenter. Legg ca 1 µg på markør (50-250 ng av forskjellig størrelse fragment) på gel å tillate visualisering av UV-lyset.
    4. Størrelse-smuldre vekk DNA på en lav spenning (40-50 V/500 mA) over natten.
  4. Forberede overføringen av DNA fra agarose gel til nylon membranen.
    1. Overføre gel til en separat skuff og flekk det for 20-25 minutter i 0,5 x TBE som inneholder Ethidium Bromide (5 µg/mL) ved å rotere på 40 rpm på en orbital shaker.
    2. Visualisere gel på en UV-transilluminator. Kontroller størrelsen separasjon av genomisk DNA, inkludert synligheten av diskrete satellitt band (figur 5A). En smear mot lavere molekylvekt størrelser angir DNA degradering.
    3. UV-transilluminator lå en transparent over gel og markere posisjonen til sporene og markør band med en markør penn (figur 5B). Dette vil lette bestemmer størrelsen på hybridisert fragmenter senere i tilfelle markør sekvenser ikke hybridize med sonden DNA. Ved å angi markør fragmenter på dette trinnet, er det mulig å spore størrelsen på hybridizing fragmenter.
    4. Plasser gel tilbake i skuffen, skyll med ultrapure deionisert vann, og senk det i 0,25 M HCl i 15 min å fragmentize DNA i gel. Vask med ultrapure deionisert vann. Bruk nok HCl og vann til å dekke gel i skuffen, og roter brettet med neddykket gel på 40 rpm på en orbital shaker.
    5. Inkuber gel i rødsprit bufferen for 30 min. vask med ultrapure deionisert vann. Bruk nok buffer og vann til å dekke gel i skuffen, og roter brettet med neddykket gel på 40 rpm på en orbital shaker. (Rødsprit buffer: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl).
    6. Inkuber gel i nøytralisering bufferen for 30 min. vask med ultrapure deionisert vann. Bruke nok buffer og vann til å dekke gel i skuffen, Roter brettet med neddykket gel på 40 rpm på en orbital shaker. (Nøytralisering buffer: 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7.6).
  5. Overføre DNA til en nylon membran.
    1. Forberede oppsettet for kapillær overføring av genomisk DNA. Plass en plast-plate (ca størrelsen av gel eller større) over en skuff fylt med 20 x saltholdig-natriumsitrat (SSC). Brett tykk filter papir over skuffen, slik at begge endene henger i SSC. Skjær en gel størrelse positivt ladede nylon membran Hybond N +, og 2 stk tykk filter papir. (20 x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M natriumsitrat).
    2. Forberede blotting oppsettet (figur 6) ved å plassere gel, spor ned på filter papir på plast plate. Plasser en Hybond N+ membran på toppen, etterfulgt av 2 lag med filter papir. Pre våt hvert lag i 20 x SSC før du legger dem til forsamlingen. Husk å fjerne eventuelle luftbobler i mellom lagene dette hindre DNA overføringen.
    3. Dekk forsamlingen med et tykt lag av papir. Plass en plast-plate med en vekt, som en liten flaske på toppen. Kontroller at trykket er likt fordelt over gel. Dette vil sikre korrekt overføring av DNA.
      Merk: Vekten bør være ca 200-300 g; tunge vekter hemme DNA overføringen.
    4. Dekk området rundt forsamlingen, inkludert eksponert filter papir, med plastfolie (figur 6) for å unngå fordampning av 20 x SSC buffer og mål av kapillær styrker mot nylon membranen. Blot over natten.
    5. Merke posisjonen av det spor, navn eller datoen på membranen med blyant, og fjerne membranen fra samlingen. Merk at undersiden som har vært i kontakt med gel, bærer DNA.
    6. Umiddelbart fikse DNA til membranen av UV bestråling (2400 µJ/m2) med en UV-Crosslinker.
      Merk: Crosslinking forhold, avhenger av hvilken type membran brukes.
      Merk: på dette punktet membranen kan lagres på 20 ° C og brukes for hybridisering med en sonde senere. Skyll krysskoblet membranen i 2 x SSC og forsegle det i pre-brettet heat-sealable polyetylen rør før du plasserer det på 20 ° C.
  6. Forbered sonden for hybridisering.
    1. Forsterke sekvensen som sonden for DNA blotting av PCR20. 50-100 ng av en 250 bp-2 kbp PCR fragment brukes som en sonde. To separate sonder, en hybridizing til høyre kant proksimale regionen og den andre til venstre kantlinje proksimale regionen T-DNA, kan brukes til å vurdere tilstedeværelsen av hele T-DNA (figur 4A og figur 7).
    2. Fortynne 50-100 ng PCR produkt i 24 µL ultrapure deionisert vann i et reagensrør.
    3. Denature utvannet PCR produktet ved å koke den i 5 min i et beger vann eller varme blokk, og Avkjøl på is.
    4. Tine forhåndslagde GCT-miks på is. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (alle 0,5 mM), tilfeldige hexamers 43.2 ng/µL, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM av β-mercaptoethanol, 0.67 M Hepes, 0,17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. Legge til 21 µL av GCT-mix og 2 U Klenow fragment PCR produktet.
    6. Legg 2 µL [32P] ATP til blandingen og ruge ved 37 ° C i 1 time.
      Advarsel: Alle foranstaltningene innvolvere [32P] ATP må utføres i et miljø som er angitt for radioaktivt arbeid mens du bruker riktig beskyttelse.
      Merk: Kontroller at [32P] ATP er fersk (ikke mer enn 1 halv tid har bestått).
    7. Klargjør en Sephadex G-50 (grov eller medium) kolonnen21 for rensing merket sonden fra kommunefritt (radioaktive) nukleotider. Ta en 2 mL sprøyte, og dekker stikkontakt med en liten krets av tykk filter papir. Legg 2 mL Sephadex G-50 oppløst i TE i sprøyten, og fjerne all væsken fra kolonnen ved spinning.
    8. Plasser kolonnen i et 15 mL plastrør laste merket sonden på kolonnen og spinn ved romtemperatur (angi sentrifuge 750 x g, tillate rpm øke inntil 750 x g nås, deretter stoppe sentrifuge og tillater rotasjon avslå 0 x g) til elute sonden. Legge til 200 µL av TE i kolonnen og spin til elute gjenværende sonden; gjentas én gang. I disse forholdene, merket DNA fragmenter er utelukket fra Sephadex matrix og elute, mens gratis nukleotider forblir i kolonnen.
    9. Bruk 300 µL av merket sonden per hybridisering rør. Hold gjenværende merket sonden på 20 ° C for senere bruk. Men hold Halvtid [32P] ATP i tankene.
  7. Hybridize DNA blot.
    1. Heat 2 x SSC og hybridisering buffer (15 mL per hybridisering tube, maksimum 2 blots per tube) til 65 ° C. (Hybridisering buffer: 10% dekstran sulfat, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, løses ved 65 ° C, holde dele på 20 ° C).
    2. Forvarm ovnen hybridisering til 65 ° C.
    3. Plasser nylon maske i en skuff med litt oppvarmet (65 ° c) 2 x SSC å dekke skuffen. Plass DNA blot på nettet, med DNA side opp. Rull blot med mesh og kastet inn i en hybridisering rør. Hell av overflødig 2 x SSC.
    4. I et microcentrifuge rør, koke 150 µL av laks Sperm DNA (konsentrasjon 10 mg/mL) per hybridisering rør i 5 min (se trinn 4.6.3). Cool umiddelbart på is og legge til forvarmet hybridisering bufferen.
    5. Legg hybridisering buffer-laks Sperm løsningen til røret med blot. Pre hybridize ved 65 ° C i minst 1 time i et roterende hjul, 12 RPM.
    6. Når pre-inkubering i trinn 4.7.5. er nesten ferdig, koke 300 µL av merket sonde i 5 min (se trinn 4.6.3) og legge til umiddelbart å blot etter inkubasjon.
    7. Hybridize overnatting i roterende hjulet på 63 ° C, 12 rpm. Ikke Pipetter sonden direkte på blot, men hybridisering buffer-laks Sperm løsning.
  8. Vask blot.
    1. Forvarm vask løsninger (1 x SSPE, 0,1% SDS og 0,1 x SSPE, 0,1% SDS) til 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO420 mM EDTA, pH 7.0).
    2. Kast hybridisering løsningen og legge til ca 100-150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS løsning hybridisering røret, nær tunnelbanen, og Roter for hånd. Hell hybridization og vaske løsning i det aktuelle flytende radioaktivt avfallet.
    3. Legge til ca 100-150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS løsning på røret, lukke og ruge røret i 15 min på 63 ° C i det roterende hjulet, 12 rpm. Kast vask løsningen riktig.
    4. Legge til ca 100-150 mL 0,1 x SSPE, 0,1% SDS løsning hybridisering røret, lukke, og roter røret i 5 min på 63 ° C, 12 rpm. Kast vask løsningen riktig.
    5. Ta blot ut av røret og plassere den i en skuff som inneholder tilstrekkelig forvarmet 0,1 x SSPE, 0,1% SDS og riste for 3 min i et risting vannbad på 65 ° C. I mellomtiden, skyll mesh i en skuff fylt med vann.
    6. Ta blot ut, plasser den mellom pre foldet plast (polyetylen rør), forsiktig stryke overflødig væske og la blot tørke kort. Merk at væske vil ødelegge phosphorimager skjermen.
    7. Forsegle blot i plast på tre sider. Fjerne alle overflødig væske rundt blot og Lukk plastrør forsegle den fjerde siden. Klipp av overskuddet av plast. Kontroller at forseglet blot ikke lekker og at plast er tørt på utsiden.
  9. Utsettes phosphorimager.
    1. Plass forseglet blot i et phosphorimager bånd phosphorimager skjermen mot DNA siden av blot. Lukk kassetten og la for ± 2-4 dager, avhengig av styrken i radioaktive merkingen og følsomhet for phosphorimager.
    2. Skanne phosphorimager skjermen med en phosphorimager. Ta vare for å utsettes for så lite som mulig lys før skanning. Lagre bildet. Slette skjermen fra signalet ved å utsette det til lys.
  10. Analysere blot.
    1. Analysen er avhengig av begrensning strategien som brukes i trinnet 4.1. Når du analyserer blot utarbeidet etter strategien vises i trinn 4.1.1.1 (figur 4A), telle antall fragmenter oppdaget. I denne strategien refererer antall hybridisert fragmenter til antall T-DNA integrasjoner.
      1. Sammenligne antall fragmenter oppdaget med en sonde for venstre (figur 7B) og høyre (figur 7C) del av T-DNA.
        Merk: Hvis et annet antall hybridizing fragmenter er oppdaget, deretter enten i) flere T-DNA kopier (enten i invertert eller direkte) eller ii) fullstendig integrert T-DNAs er tilstede.
      2. Beregne størrelsen på hybridisert fragmenter på blot basert på størrelsen på markøren bandene, og sammenligne størrelsen på hybridisert fragmenter med forventet fragmentet størrelser beregnet basert på begrensning strategi tandem innsettinger (figur 4A) identifisere mulige tandem arrangement av T-DNAs. Bruk figur 4A som en guide til å beregne størrelsen på forventet fragmenter.
        Merk: Hvis størrelsen på hybridisert fragmenter ikke enig med beregnede seg, så mest sannsynlig en av integrasjoner stede er ikke fullført.
    2. Når du analyserer blot utarbeidet etter strategi vises i trinn 4.1.1.2 (figur 4B), beregne størrelsen til hybridizing fragmentet på blot basert på størrelsen på markøren band, og sammenligne den med den forventede størrelsen. En intakt innsetting gir et enkelt fragment med en definert lengde. Alle avvik forventet lengde angir ufullstendig integrering (figur 7 d).
  11. Stripe blot for re hybridisering (valgfritt).
    Merk: Samme blot kan være hybridiserte fortløpende med forskjellige sonder. Før du fortsetter med en ny sonde, fjerner du en tidligere hybridisert sonde fra blot.
    1. For å fjerne sonden fra blot, plassere blot i en skuff med DNA-siden vender ned. Hell et overskudd av 0,5% SDS i skuffen. Kok membranen i 2-5 min. Varigheten av behandling avhenger av størrelsen og GC-innhold av sonden brukes. Lengre og GC-rikere sonder trenger en lengre behandling.
    2. Etter stripping, hybridize blot med en annen sonde, eller forsegle og lagre på 20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruker BIBAC-GW systemet, ble reporter konstruksjoner for å studere ODM i planter generert10. Konstruksjoner ble designet i Gateway oppføring vektor pENTR-gm12 og settes inn i pBIBAC-BAR-GW (figur 1) bruker Gateway LR rekombinasjon reaksjonen.

Arabidopsis ble forvandlet med pDM19, en BIBAC-BAR-GW plasmider med en mTurquoise-eYFP reporter bærer en translational stopp codon i eYFP lesing rammen på posisjon 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (figur 2)10. Totalt ble 126 Arabidopsis planter transformert (9 planter per pott, 14 Potter). Frø av disse plantene var samlet, sådd på brett med jord og lov til å vokse i to uker før behandling med Glufosinate-ammonium løsning. Bare seedlings uttrykke bar genet (finnes i BIBAC-BAR-GW) overleve Glufosinate-ammonium behandling (Figur 3). Totalt ble 11 transgenics forvandlet pDM19 identifisert, tilsvarer en transformasjon effektivitet på 0,02% av frø analysert.

11 transgenics isolert, var DNA blotting pleide å bestemme antall T-DNA integrasjoner. For dette formålet, ble genomisk DNA kuttet BglII eller Scajeg (strategi som utarbeidet på figur 4A). Begge disse begrensning enzymer kuttet bare én gang i T-DNA sekvensen (figur 7A). Hybridisering med sonder gjenkjenne baren og eYFP koding regioner tillatt påvisning av antall respektive DNA fragmenter.

Antall personlige DNA fragmenter på blots tillatt for å estimere antall T-DNA innsettinger i reporter linjene (tabell 1). Enkelt hybridizing fragmenter med både Bar og eYFP angitt tilstedeværelsen av en enkelt T-DNA-integrering. Fra de 11 transgenics analysert, gjennomført seks enkelt integrasjoner. Gjennomsnittlig antall integrasjoner var 1.2.

For 6 linjer med en enkelt T-DNA-integrasjon, ble integriteten til den innsatte reporter konstruere testet med DNA blotting (strategi som utarbeidet på figur 4B). Genomic DNA ble kuttet med BglII og Pcijeg å løslate en 5.5 kb fragment som inneholder både baren og mTurquoise-eYFP fusion genet (figur 7A). En sonde mot eYFP ble brukt til å gjenkjenne et forventet fragment. Alle planter testet gjennomført et intakt fragment. Merk at fragmentet undersøkt utelukker venstre og høyre T-DNA grensen, og derfor undersøke ikke integriteten til hele T-DNA, men bare delen som inneholder effekter av transgener rundt.

Uttrykk for fluorescerende reporter genet ble bestemt i uavhengige enkelt-kopi transgene linjene avviker bare ved genomisk plasseringen av T-DNA. Relativ transkripsjon nivåer av CaMV-35S promoter-drevet mTurquoise-eYFP reporter ble målt ved RT-qPCR i fire DM19 reporter linjer bærer intakt, enkelt-kopi integrasjoner som genomisk posisjon var bestemt10. Variasjonen i reporter gene expression nivåer mellom linjene var mindre: den maksimale forskjellen i mTurquoise-eYFP RNA nivåer var 2-fold (figur 8A).

Deretter ble ODM gjennomført i disse reporter linjer. Tre av de fire uavhengige reporteren linjene viste liknet ODM effektivitet (figur 8B). Men en linje, DM19 [4] 1, gitt en svært lav ODM effektivitet sammenlignet med de andre linjene. Disse resultatene indikerer at ODM påvirkes av lokal genomisk sammenheng. På hvilken måte lokale genomisk sammenheng med T-DNA integrering i DM19 [4] 1 er forskjellig fra de andre linjene gjenstår å bli identifisert. Analyse av tilgjengelige datasett på aktive og inaktive chromatin markerer genomisk T-DNA integrering områdene i ikke-transgene planter gir ikke et svar10.

Figure 1
Figur 1: funksjonell kart over pBIBAC-GW vektorer. pBIBAC-GW derivater er tilgjengelig med enten motstand mot Glufosinate (bar) eller DsRed fluorescens i frø strøk (DsRed) som en markøren i planter. For både vektorer er et kanamycin motstand gen markøren i bakterier. Gatewayen ccdB kassett vises mellom grønne pilspisser som representerer rekombinasjon nettsteder attR1 og attR2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: mutagenese reporter konstruere. MTurquoise-eYFP reporter genene er drevet av den 35S-CaMV-utbyggeren. MTurquoise koding regionen er sammensmeltet med en eYFP koding regionen bærer en C-en mutasjon i nukleotid posisjon 120, resulterer i en tidlig translasjonsforskning stopp codon TAA og tidlig avslutning av oversettelsen av fusion protein. 3 Nopaline Synthase (3 nos) polyadenylation signal brukes til å avslutte transkripsjon av konstruksjon-22. Kjernefysisk lokalisering signal (NLS) brukes til å målrette oversatt proteiner til kjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skuff fylt av Arabidopsis før og etter Glufosinate-ammonium behandling. Seedlings ikke uttrykke bar genet som finnes i pBIBAC-BAR-GW T-DNA dør etter tilværelse sprøytelakkerer med Glufosinate-ammonium løsning. Bildene viser samme skuffen av frøplanter (A) før Glufosinate-ammonium, 14 dager etter såing, og (B) 10 dager senere, etter tilværelse sprøytelakkerer to ganger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: generelle DNA begrensning strategi å identifisere antall og intactness av inn T-DNAs. (A) en begrensning nettsted (R) i midten T-DNA lar uavhengige undersøkelser av venstre (rød L) og høyre del av T-DNA (grønn R). Tegningene til høyre viser at avhengig av enkelt - eller multi - kopi T-DNA integrasjoner, ulike striper mønstre oppnås med DNA blotting. Felt merket med en * har en definert lengde, mens andre band avhenger det nærmeste begrensning området i flankemanøveren genomisk DNA. Enkelt sett inn: L og R sonde både gir en uavhengig fragment. Den forventede gjennomsnittlige fragment størrelsen kan beregnes basert på frekvensen av webområdet begrensning i genomet. Minimal er avstanden fra webområdet begrensning til venstre kantlinje (LB) eller høyre kantlinje (RB), avhengig av hvilken ende av integrering er blir analysert, og hvis T-DNA er intakt. Tandem gjenta: Sonder for L og R gir begge to fragmenter; for hver probe inkluderer en av fragmentene flankert genomisk DNA, andre fragmentet har en forventet størrelse og er identifisert av både sonder. Inverted gjenta: Avhengig av retningen av integrert kassetten, kan enten en L og to R fragmenter, eller to L og en R identifiseres. Personlige enkelt innsettinger: Resultatet er en rekke uavhengige fragmenter, og antall fragmenter tilsvarer antall integrasjoner. (B) begrensning nettsteder på ekstremiteter av T-DNA tillater fastsetting integriteten til fragmentet mellom begrensning områder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: en agarose gel med begrensning og matchende gjennomsiktigheten. (A) på agarose-gel genomisk DNA fordøyd med EcoRjeg vises. Riktig fordøyelse av DNA er illustrert av tilstedeværelsen av diskrete satellitt band. (B) merking plasseringen av spor eller markør band på gjennomsiktighet gjør det mulig å senere lett beregne størrelsen på hybridizing fragmenter. Her MRC Holland markører (blå og rød) brukes, angis av M. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: oppsett for kapillær blotting. I en kapillær blotting oppsett, er filter papir plassert på en plast-plate med endene av papiret hengende i 20 x SSC buffer. Papiret er vætet med 20 x SSC og en agarose gel plassert på toppen, etterfulgt av en nylon membran, filter papir og en stabel av vev. En lett plasseres på toppen. Care er tatt å fjerne luftbobler mellom gel, papir og membran. Plastfolie brukes til å unngå uttørking av oppsettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: eksempel på DNA blotting strategi og eksperimentelle utfallet. (A) DNA blotting strategi for å bestemme antall og intactness av T-DNA integrasjoner. Kutte steder av de valgte begrensningen enzymene i T-DNA angis med loddrette streker. EYFP og bar sonder brukes for hybridisering med fordøyd genomisk DNA angis med en linje med terminal dot under T-DNA. (B-D) Eksempel DNA blotter. Genomic DNA ble kuttet med Scajeg og blot undersøkt med både bar og eYFP sonde (B og C). Genomic DNA var kuttet med BglII og Pcijeg og analysert med en bar sonde. Intakt fragmenter er 5,5 kbp størrelse (D). Merk at settet med prøver i D er forskjellig fra de som vises i B og C. * angir forventet fragment størrelsen; M, markør. B, C og D brukes samme størrelse markøren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: mTurquoise-eYFP uttrykk nivåer og ODM effektivitet i uavhengige mTurquoise-eYFP reporter linjer. (A) Relative mTurquoise-eYFP transkripsjon nivåer målt ved RT-qPCR i DM19 reporter linjer. For normalisering ble transkripsjon nivåer av utgangen brukt. (B) ODM effektivitet måles i DM19 reporter linjene. For A og B, barer angi gjennomsnittet av minst fem biologiske gjentak. Feilfelt viser SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Typen T-DNA locus Nr for T-DNA integrasjoner Reporter linje Antall fragmenter oppdaget Integritet
SCA Jeg BGL II BGL II/PciI
Bar eYFP Bar eYFP eYFP
Enkelt locus integrasjoner 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2]-5 1 1 1 1 +
1 19 [2]-9 1 1 1 1 +
1 19 [2]-11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
2, invertert gjenta 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, ufullstendig integrering 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Flere locus integrasjoner 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND-ikke bestemt.

Tabell 1: Sammendrag av DNA blotting dataene for transgenics isolert etter transformasjon med pDM19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritisk til å generere transgenics med enkelt, intakt integrasjoner av en transgene er valg av binære vektoren brukes. BIBAC familien vektorer har blitt brukt til å levere sekvenser av interessene til mange plante arter23,24,25,26,27,28. BIBAC vektorer, inkludert BIBAC-GW, gi enkelt-kopi integrasjoner med høy effektivitet: gjennomsnittlig antall innsettinger per linje er 1,5 til 2, forhold til 3 eller høyere for mest brukte binær vektorer5,9, 29. som en stor forbedring i forhold til andre BIBAC vektorer, med BIBAC-GW vektorer, sekvenser av interesse kan enkelt inn bruker Gateway rekombinasjon nettsteder12. Modifisert vektorer overvinne de generelle problemene av BIBAC vektorer i konvensjonelle kloning strategier: i) en svært begrenset antall unike begrensning områder og ii) en lav DNA gi. Gateway rekombinasjon nettstedene gjør BIBAC-GW vektorer et attraktivt alternativ til andre binære vektorer for generering av transgene planter.

Her er en rekke protokoller, genererer BIBAC-GW derivater som inneholder sekvenser av interesse, for å plante transformasjon og DNA blot analyse for tall og intactness av transgene sekvensene beskrevet. Flere av protokollene rapportert i dette papiret, Gateway kloning, electroporation, og anlegget transformasjon, er vanlig praksis i mange laboratorier og kan også utføres med små modifikasjoner. Det er viktig å vite at BIBAC-GW er en enkelt-kopi vektor i E. coli og A. tumefaciens. Derfor når isolere DNA, er avkastningen lav; Det anbefales å skalere opp isolasjon prosedyren.

I transgenics bærer flere T-DNA integrasjoner, introduserte effekter av transgener er ofte utsatt for genet stanse1,2,4,30, og bør derfor for de fleste programmer unngås. For å identifisere transgene planter med enkelt, intakt integrasjoner, anbefales det å bruke DNA blot analyse. Mens metoder enn DNA blotting kan brukes for å fastsette T-DNA kopi nummer og integriteten til T-DNAs transgene linjer (segregering analyse, hale PCR, kvantitativ PCR (qPCR) og digital slippverktøy PCR), men Ap intensiv, DNA blotting er ofte metoden for valg. Segregering analyse er ikke i stand til å skille mellom flere og single T-DNA integreringer på enkelt loci. HALE PCR ofte under estimater kopien nummer, spesielt hvis flere T-DNA integrering er tilstede31, og qPCR må omfattende optimalisering pålitelige resultater31,32. Digital dråpe PCR er en ganske presis metode for kopi nummer gjenkjenning hvis utrustningen er tilgjengelig31. Den ekstra fordelen av DNA blotting er lettvinte påvisning av avkortet T-DNAs, som er lett overses i alle PCR-baserte teknikker.

DNA blot analyse må hybridizing fragmenter på blot være godt identifiserbare i signal og størrelse. Flere faktorer er kjent for å påvirke utfallet av DNA blotting. I tillegg til et riktig valg av begrensning enzymer (strategi i Figur 4) og størrelse markører, tilstrekkelig DNA av god kvalitet er nødvendig. Mindre enn 2 µg av genomic Arabidopsis DNA vil ikke gi godt identifiserende fragmenter. Når du arbeider med større genomer, kreves mer DNA. For å få tilstrekkelig mengder Arabidopsis DNA, kan floral vev eller 1 - uke gamle planter brukes. En gruppe av frøplanter dyrket på en Petriskål gir 2-8 µg DNA. For å unngå DNA fornedrelse under isolasjon, bør forsiktighet utvises behandle plantemateriale rask. Videre genomisk DNA skal være resuspended i Tris-EDTA redusere sin nedbrytning av nucleases, og lagret på 4 ° C snarere enn 20 ° C å hindre DNA skår skyldes gjentatt frysing-tining sykluser. Hvis du er usikker at alle DNA-prøver er digested helt, er det foreslått for å rehybridize DNA blot med en sonde gjenkjenne en endogen, unike genomisk region. Når du velger sonde sekvenser for å identifisere transgene eller endogene sekvenser, er det avgjørende å bare velge unike sekvenser. Hvis du vil angi nøyaktig hybridisert fragmenter, plasseringen av DNA gel spor og DNA markør band skal merkes på gjennomsiktighet (figur 5B) når visualisere en Ethidium Bromide-farget gel (figur 5A) på en UV transilluminator. Dersom markøren sekvenser ikke hybridize med sonden DNA, eller hybridisering er delvis, er det den eneste måten å spore opp størrelsen på hybridizing fragmenter.

Når omsorg er tatt for å oppnå god hybridisering signal og estimat av fragment, er tolkningen av blotting resultatene grei. Når bruker bare én begrensning enzym, og hybridizing med ulike sonder oppdage enten til venstre eller høyre del av T-DNA, gjenspeiler antall oppdaget fragmenter antall T-DNA innsettinger. For eksempel figur 7B, C viser samme DNA blot, hybridiserte med forskjellige sonder, bar (figur 7B) og forbedret gule fluorescerende Protein (eYFP) (figur 7C), ved hjelp av strategien som vist i figur 7A. Alle baner, unntatt 4, Vis likt antall fragmenter på begge blots: to fragmenter for linje 6 og et enkelt fragment alle andre linjer. Dette nummeret av oppdaget er antall T-DNA innsettinger.

Når antall fragmenter oppdaget med sonder bindende enten venstre eller høyre del av T-DNA er forskjellig (som figur 7BC, linje 4), enten ufullstendig innsettinger finnes eller T-DNAs har satt i tandem ordningen. Tandem innsettinger viser ikke tilfeldig fragment lengde for en av T-DNA fragmenter (figur 4A, høyre panel), og kan identifiseres ved å sammenligne hybridisert fragment størrelsen med forventet basert på begrensning strategi. En ekstra blotting strategi kan være nødvendig å bekrefte tandem ordningen av T-DNA innsettinger. I eksemplet vises på linje 4 (figur 7B, C), er to innsettinger ordnet i en omvendt retning gjenta.

Ved beregning intactness av T-DNA eller deler av den, kan hvor hybridizing fragmentet beregnes basert på begrensning strategi. Eventuelle avvik fra den forventede størrelsen indikerer tilstedeværelse av en ufullstendig innsetting. For eksempel i figur 7 doverfører i lane 4, et hybridizing fragment på 8 kbp, (i stedet for den forventede 5,5 kbp) som indikerer en økt fragment størrelse skyldes mangel på ett av webområdene begrensning.

BIBAC-GW vektorer er utmerket verktøy for å generere enkelt-kopi intakt integrasjoner i flere plantearter. Protokollen rapporterte her gir en pålitelig prosedyre for å identifisere planter med enkelt, intakt integrasjoner av transgene rundt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskningen er støttet av den nederlandske teknologi Foundation STW (12385), som er en del av Nederland organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO), og som er delvis finansiert av Ministry of Economic Affairs (OTP Grant 12385 til MS).  Vi takker Carol M. Hamilton (Cornell University, USA) for å gi pCH20, ryggraden i BIBAC-GW vektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Genetikk problemet 133 binære vektor BIBAC Gateway kompatibel binære vektor plante transformasjon enkel integrasjon gene stanse DNA blotting Southern blotting
Generere transgene planter med enkelt-kopi innsettinger bruker BIBAC-GW binære vektor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter