Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generera transgena växter med singel-kopia infogningar använder BIBAC-GW binära vektor

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Använda en pBIBAC-GW binära vektor gör genererar transgena växter med intakt singel-kopia infogningar, en enkel process. Här presenteras en serie av protokoll som guidar läsaren genom processen att generera transgena Arabidopsis växter, och testa växterna för orördhet och antal kopior av skären.

Abstract

När du genererar transgena växter, generellt är målet att ha stabilt uttryck av en transgen. Detta kräver en enda, intakt integration av transgenens, som flera exemplar integrationer utsätts ofta för nedtystning. Gateway-kompatibel binära vektorn baserat på bakteriella artificiella kromosomer (pBIBAC-GW), liksom andra pBIBAC derivat, tillåter införandet av single-kopia transgener med hög verkningsgrad. Som en förbättring av den ursprungliga pBIBAC, har en Gateway-kassett blivit Klonade in pBIBAC-GW, så att sekvenserna av intresse kan nu enkelt införlivas i vektor överföringen DNA (T-DNA) av Gateway kloning. Vanligen, omformningen med pBIBAC-GW resulterar i en verkningsgrad på 0,2 – 0,5%, där hälften av transgena bära en intakt singel-kopia integration av T-DNA. PBIBAC-GW vektorer finns med resistens mot glufosinatammonium eller DsRed fluorescens i frö rockar för urval i växter och motstånd mot kanamycin som en markering i bakterier. Här presenteras en serie av protokoll som guidar läsaren genom processen att skapa transgena växter med pBIBAC-GW: Start från kombinera sekvenserna av intresse i den pBIBAC-GW vektorn val, att plantera förvandling med Agrobacterium, urval av transgena och testa växterna för orördhet och kopiera antal skär med hjälp av DNA analys. Uppmärksamhet ges till att designa en DNA blotting strategi att erkänna singel - och multi - kopieringsskyddad integrationer på enstaka och flera loci.

Introduction

När du genererar transgena växter, är oftast målet att ha den integrerade transgene(s) stabilt uttryckt. Detta kan uppnås genom intakt exemplar integrationer av en transgen. Flera integrationer kan leda till ökat uttryck av en transgen, men också till nedtystning. Ljuddämpning av transgener är mer sannolikt om infogade sekvenserna är ordnade i tandem eller inverterad repetitioner1,2,3,4. Binärt vektorer används som Transfer i Agrobacterium-medierad omvandling experiment för att leverera sekvenserna av intresse i växten genomen. Antalet integrationer till en växt genomet är beroende av kopia antalet binära vektorn i Agrobacterium tumefaciens5,6. Många vanliga binära vektorer är hög kopia vektorer, och därför ger en hög genomsnittlig transgenens kopienumret: 3.3 till 4,9 kopior i Arabidopsis5.

Antalet T-DNA integrationer kan sänkas med hjälp av binära vektorer som har en låg-kopia nummer i A. tumefaciens, såsom BIBAC7, eller genom att lansera en T-DNA från A. tumefaciens kromosom5. Det genomsnittliga antalet transgenens integrationer i sådant fall understiger 25,8,9,10. På grund av att singel-kopia i A. tumefaciens, och även i Escherichia coli, BIBAC-derivat kan upprätthålla och leverera konstruktioner så stor som 150 kb11.

GW-kompatibel BIBAC vektorer10,12 Tillåt lätt införandet av gener av intresse i den vektor som använder Gateway kloning. Användning av Gateway teknik förenklar förfarandet för kloning, men också övervinner vanliga problem associerade med stora låg-kopia-nummer vektorer13,14, till exempel en låg DNA-avkastning och ett begränsat urval av unika begränsning platser tillgängliga för kloning7,11. PBIBAC-GW derivat finns med antingen motstånd mot glufosinatammonium (pBIBAC-BAR-GW) eller DsRed fluorescens i frö rockar (pBIBAC-RFP-GW) för urval i växter (figur 1)10,12. För båda vektorer används en kanamycin motstånd gen som urval markören i bakterier.

PBIBAC-GW vektorerna kombinera: (1) lätt design och genmanipulation i E. coli, och (2) intakt singel-kopia integrationer i planta med hög effektivitet. PBIBAC-GW vektorer avkastningen på genomsnitt 1,7 integrationer i Arabidopsis med ungefär hälften av de transgena växter som bär en enda integrerad T-DNA10.

Stabilt uttryck av transgener är ett krav för de flesta transgenics genereras. Stabil transgenens uttryck kan uppnås genom intakt, singel-kopia integrationer. Arbeta med transgena växter transporterar intakt, singel-kopia integrationer är dock ännu viktigare om exempelvis syftet är att studera effektiviteten av kromatin-baserade processer, såsom mutagenes, rekombination, eller reparation och beroendet av dessa processer på genomisk platsen och kromatinstruktur vid insticksstället. För vårt intresse, för att studera beroendet av oligonukleotiden riktad mutagenes (ODM) på lokala genomisk sammanhang, var en uppsättning reporter rader med intakt, singel-kopia integrationer av en mutagenes reporter gen genererade (figur 2)10. Med denna uppsättning linjer, visades att ODM effektivitet varierar mellan transgena loci integreras på olika genetiska platser, trots transgenens uttrycksnivåerna är ganska likartade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sätta in sekvenser av intresse i binärt vektor

  1. Förbereda Gateway inresa och binära vektorer.
    1. Isolera den Gateway posten vektor som innehåller en DNA-fragment eller gen av intresse med en mini prep kit enligt förslagen av leverantören.
      Obs: BIBAC-GW vektorer kräver användning av kanamycin (Km) för urval i bakterier, därför, använda en post-vektor med en annan motstånd markör i stället för kanamycin. Exempelvis är pENTR-gm vektorn, bär en Gentamicin motstånd genen, ett bra val12.
    2. Sprida och isolera BIBAC-GW vektorn av intresse. Använd en E. coli -stam som är resistent mot toxiciteten av genen ccdB inom Gateway kassett. Isolera BIBAC-vektorer med hjälp av protokoll eller kit särskilt utformade för stora plasmider enligt förslagen av leverantören.
  2. Genomföra en Gateway reaktion.
    1. Förbereda LR rekombination reaktionen enligt förslagen av leverantören. Blanda följande komponenter i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör vid rumstemperatur (RT): 100 – 300 ng post klon (supercoiled), 300 ng av BIBAC-GW vektor, LR Clonase reaktion buffert (slutlig koncentration: 1 x). Justera volymen för blandningen till 16 µL med TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Slutligen tillsätt 4 µL av LR Clonase enzym blandning och blandning av vortexa. Inkubera blandningen vid 25 ° C i 1 h.
    2. Säga upp LR reaktionen genom att lägga till 2 µL proteinas K lösning (2 µg/µL) till blandningen bereddes i steg 1.2.1. Blanda och inkubera vid 37 ° C i 10 min.
  3. Omvandla E. coli med Gateway reaktionsblandningen av elektroporation.
    1. Avsalta LR reaktionsblandningen före elektroporation.
      Obs: Detta steg är avgörande för framgångsrik elektroporation. Nedan en dialys metoden är beskrivna, men andra metoder såsom nederbörd med natriumacetat och etanol kan också användas.
      1. Förbereda installationen för filter dialys av LR reaktionen. Häll 20 mL av ultrarent avjoniserat vatten i en steril petriskål. Placera en membran filter disk (porstorlek = 0,025 µm) på vattenytan.
      2. Pipettera hela LR reaktionen försiktigt ovanpå membranet och låt blandningen dialyze på RT för 1 h.
    2. Tillsätt 5 µL desalted LR mix electro-behöriga DH10B celler i en elektroporation kyvetten (0,1 cm). Electroporate cellerna (1,5 V/cm, motstånd 200 Ω, kapacitans 25 µF), och omedelbart lägga till 1 mL före värmde Super Optimal Catabolite förtryck (SOC) medium på cellerna, följt av inkubation vid 37 ° C i 45 min, 180 rpm. (SOC medium, 1 L: 20 g Bacto trypton, 5 g jäst extrakt, 0,5 g NaCl, 2,5 mL 1 m KCl, 20 mL 1 m filter-steriliseras glukos).
      Obs: DH10B celler kan ersätta andra E. coli -celler som stabilt upprätthåller stora plasmider.
      Obs: Optimal elektroporation villkoren är beroende av elektroporation enheten används.
    3. Pellet bakterier med maximal hastighet för 30 s med en mikrocentrifug, ta bort överflödig SOC och återsuspendera pelleten i ca 50-100 µL av Luria-Bertani (LB) medium. Sprida bakterier på kanamycin-LB (Km-LB) plattor (Km koncentration, 40 µg/mL) och inkubera plattorna vid 37 ° C över natten. (LB medium, 1 L: 10 g Bacto trypton, 5 g jäst extrakt, 10 g NaCl. För fast medium tillsätt agar, 15 g/L).
  4. Identifiera de rekombinerat BIBAC-GW-derivat och isolera plasmid DNA.
    1. För att kunna växa på Km-LB tallrikar, bör E. coli celler innehålla rekombinerat BIBAC-GW plasmiden där sekvensen ccdB ersätts med önskad skäret. Använd kolonin Polymerase Chain Reaction (PCR)15 för att kontrollera om de bakterier kolonierna på plattan innehåller de rätta plasmider, har BIBAC-GW ryggraden och insatsen av intresse.
      1. För att identifiera pBIBAC-BAR-GW ryggraden, utföra en PCR-15 reaktion med primers DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'och DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Denna primer som förstärker en 563 bp-fragmentet av bar -genen.
      2. För att kontrollera förekomsten av BIBAC-RFP-GW ryggraden, utföra en PCR-15 reaktion, använda primers M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'och M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Denna primer kombination förstärker en 791 bp-fragmentet överlappande cruciferin promotor och rfp sekvensen.
      3. Utför PCR-15 reaktioner med gen-specifika primers för att kontrollera förekomsten av insatsen av intresse.
    2. Inokulera en enda positiv koloni i 2 – 5 mL LB medium innehållande kanamycin (40 µg/mL) för DNA isolering16. Inkubera vid 37 ° C i orbitalskak vid 180 rpm, över natten.
    3. Isolera plasmiden DNA (se steg 1.1.2).

2. beredning av A. tumefaciens för blommig doppning av Arabidopsis

  1. Omvandla BIBAC-GW derivat till A. tumefaciens.
    1. Förbereda electro-kompetenta celler A. tumefaciens stam C58C1 bär pCH32 Helper plasmid7. Odla bakterier i närvaro av tetracyklin (5 µg/mL) och rifampicin (100 µg/mL) att välja för pCH32 och säkerställa tillväxten av endast Agrobacterium celler.
    2. Lägg till 0,25 – 0,5 µg DNA i ett pBIBAC-GW derivat, pre upplöst i 10 – 20 µL Sterilt ultrarent avjoniserat vatten, till 20 µL behöriga Agrobacterium celler i elektroporation kyvetter (0,1 cm). Hålla celler på is.
    3. Electroporate cellerna (1,5 V/cm, motstånd 400 Ω, kapacitans 25 µF). Omedelbart efter elektroporation, tillsätt 1 mL före värmde (28 ° C) SOC medium till bakterierna och inkubera cellerna vid 28 ° C under 60 – 90 minuter.
    4. Fördela 100 µL och resten av bakterier på separata LB plattor som innehåller rifampicin (100 µg/mL), tetracyklin (5 µg/mL) och kanamycin (40 µg/mL) och inkubera i mörker vid 28 ° C i 1-2 dagar.
  2. Förbereda Agrobacterium suspensionen.
    1. Kontrollera med PCR ett par A. tumefaciens kolonierna från plattan bereddes i steg 2.1.4, förekomsten av rätt vektorn (se steg 1.4.1).
    2. Streak en enda koloni bekräftade för att innehålla binära vektorn med lämpliga insatsen på en LB skylt som innehåller antibiotika (se steg 2.1.4). Växer vid 28 ° C över natten.
    3. Upprepa de strimmor med en enda koloni som erhölls i steg 2.2.2.
    4. Inokulera en enda koloni i 2,5 mL LC medium kompletteras med antibiotika (se steg 2.1.4) för preculture. Inkubera vid 28 ° C i minst 8 tim eller över natten, vid 180 rpm. (LC medium, 1 L: 10 g Bacto trypton, 5 g jäst extrakt, 0,5 g NaCl, 2,5 g MgSO4 · 7 H2O, 2 g maltos).
    5. Lägg till preculture från steg 2.2.4. till 250 mL LC kompletteras med antibiotika (se steg 2.1.4) och växa vid 28 ° C, vid 180 rpm, över natten.
    6. Pellet kulturen av snurrande vid 5500 x g i 12 min. resuspendera pelleten i 100 mL lösning som innehåller 5% sackaros, 0,05% Silwet L-77, 0,5 x MS. Häll suspensionen i en steril behållare för blommig doppning av växterna.

3. Arabidopsis omvandling

  1. Förbereda Arabidopsis växterna för omvandling.
    1. Odla Arabidopsis växter i ett växthus eller klimat kontrollerad tillväxt kammare tills de blommar (12 krukor med 9 växter varje per doppning).
    2. Klipp första bultarna för att tillåta mer sekundära bultar att dyka upp. Växter är redo för doppning 4 – 6 dagar efter klippning, när växterna har många omogna blomma huvuden och inte många befruktade siliques.
  2. Blommig doppning
    1. Doppa blomställningar för 5 – 10 s i Agrobacterium suspension bereddes i steg 2.2.6. Använd mild agitation.
    2. Wrap de ovanjordiska delarna av växterna i plastfilm att hålla luftfuktigheten hög, och täcka växten krukor med en ruta för att hålla växterna i mörkret. Inkubera växterna för 2 dagar i ett växthus/tillväxt-kammare.
    3. Ta bort rutan och plastfilm och växa växter till mognad i ett växthus/tillväxt-kammare.
      Obs: För att öka effektiviteten i omvandling, samma växterna kan vara åter doppade 7 dagar efter den första doppning.
    4. Skörda fröna. Pool och analysera frön (T1) av växter, omvandlas med samma konstruktion, som ett enda set.
  3. Skärmen för transgena växter.
    1. Skärm för transgena växter omvandlas med ett pBIBAC-RFP-GW derivat, analysera frön med fluorescensmikroskopi. För att upptäcka DsRed uttryck i frö rockar, image fröna på en magnetisering av 560 nm och utsläpp av 600 – 650 nm. Separata fluorescerande frön från icke-fluorescerande motsvarigheter med pincett.
    2. Skärm för transgena växter omvandlas med ett pBIBAC-BAR-GW derivat, så frön i fack fylld med jord (~ 2500 frön/0.1 m2). För att säkerställa en jämn spridning av frön över brickor, avbryta frön i 0,1% agar i 0,5 x Murashige Skoog medium (MS), och sprida frön med 1 mL pipett.
      Obs: För att stimulera fröna att gro i en synkront sätt, inkubera frön i minst 2 dagar vid 4 ° C. Detta kan göras före eller efter de frön.
      1. Spraya plantorna med 0,5% glufosinatammonium lösning 2 veckor och 3 veckor efter sådd i fack. Använd 500 mL glufosinatammonium lösning per 1 m2.
      2. Överföra överlevande plantor till individuella krukor. En typisk bild av en bricka med plantor före och efter (andra) glufosinatammonium behandling visas i figur 3.
      3. Analysera de glufosinatammonium-ammonium-resistenta växterna med PCR för förekomst av konstruktionen av intresse (se steg 1.4.1. för grundfärger).
        1. Isolera genomisk växt DNA för PCR metoden beskrivs av Edwards et al. 17

4. karaktärisera transgena för antal och integritet av T-DNA integrationer

  1. Strategi för begränsning tumörheterogenitet
    Obs: Bestämma antalet T-DNA integrationer och deras integritet genom att läska DNA med restriktionsenzym. Denna metod gör det möjligt för att identifiera enstaka, men också upprepade integrationer på de samma eller olika loci i genomet.
    1. Använda en rad begränsning tumörheterogenitet för att identifiera de olika integration mönsterna möjligt:
      1. Välj ett enzym som skär en gång i mitten av T-DNA, för att kunna självständigt sond sekvenser uppströms och nedströms av webbplatsen begränsning (figur 4A och Figur 7A-C). Se figur 4Aoch figur förklaringen för förväntade resultat och tolkning.
      2. Välj ett enzym eller en kombination av enzymer skära ut hela sekvensen av intresse på en gång (figur 4B och figur 7A-D). Varje avvikelse från den kända längden anger trunkering av integrerade kassett.
        Obs: var noga med att endast använda restriktionsenzym som inte är känsliga mot cytosine metylering.
  2. Förbereda de genomiskt DNA-proverna.
    1. Isolera den genomiskt DNA från växter som bär konstruktionen av intresse. En CTAB DNA miniprep metod kan användas för DNA isolering18. För DNA blot analys av Arabidopsis DNA, 2 – 2,5 µg genomiskt DNA behövs. Lös upp DNA i 50 µL av TE.
    2. Kontrollera DNA integriteten av gelelektrofores16. Intakt genomiskt DNA migrerar som en diskret band överst i gelen. DNA nedbrytning kan erkännas som förekomsten av ett utstryk. För att undvika DNA-skador på grund av upprepad frysning-upptining, förvaras genomisk DNA-prov vid 4 ° C.
    3. Smälta den genomiskt DNA (2 – 2,5 µg vid Arabidopsis genomiskt DNA) i en total volym på 50 µL, över natten, med buffert villkor föreslås av enzymet leverantören.
      1. Blanda 2 – 2,5 µg Arabidopsis genomiskt DNA, 5 µL 10 x begränsning buffert och 5 U restriktionsenzym i sammanlagt 50 µL ultrarent avjoniserat vatten i ett provrör.
    4. Lägga till lastning färgämne (1 x slutlig koncentration) begränsning proverna före lastning på en gel. För bra visuell spårning, Använd en av följande: comigrating med små fragment (Bromophenol blå, 350 – 400 bp), eller comigrating med större fragment (Cylene cyanol, 3 – 4 kbp).
  3. Kör gelen DNA.
    1. Förbereda en lång (20 cm) 0,5 x TBE agaros gel19. Procent av agaros i gel beror på fragmentet storlekarna förväntat. 0,8 – 1% optimalt separerar fragment > 1 kb i storlek. Använda 1-1,5% agaros för fragment < 1 kb. Lägg inte till etidiumbromid i gelen. (5 x TBE, 1 L: 54 g Trizma bas, 27,5 g borsyra, 3.75 g EDTA).
      Obs: För att förhindra DNA-kontaminering, använda gel brickor som inte används för att fractionate plasmid och PCR amplifieras DNA.
    2. Ladda proverna på gel19.
    3. Lägga till DNA-markörer gelen som är i storleksintervallet förväntade fragment. Ladda ca 1 µg av markör (50-250 ng av olika storlek fragment) på gelen att tillåta visualisering av UV-ljus.
    4. Storlek-fractionate DNA vid en låg spänning (40 – 50 V/500 mA) över natten.
  4. Förbereda för överföring av DNA från agarosgel till nylon membran.
    1. Överföra gelen till ett separat fack och färga det för 20 – 25 min i 0,5 x TBE innehållande etidiumbromid (5 µg/mL) genom att vrida på 40 rpm i orbitalskak.
    2. Visualisera gelen på ett UV-transilluminator. Kontrollera storlek separation av genomisk DNA, inklusive synlighet av diskreta satellit band (figur 5A). Ett utstryk mot lägre molekylvikt storlekar indikerar DNA nedbrytning.
    3. Lägg en insyn över gelen på det UV-transilluminator, och markera positionen för slots och banden markör med en tuschpenna (figur 5B). Detta kommer att underlätta fastställande av storleken på hybridiserade fragment senare om sekvenserna som markör inte hybridiserar specifikt med sonden DNA. Genom att ange markör fragment i detta steg, är det möjligt att spåra storleken på hybridizing fragment.
    4. Placera gelen tillbaka i facket, skölj med ultrarent avjoniserat vatten och dränka det i 0,25 M HCl för 15 min till fragmentize DNA i gelen. Tvätta med ultrarent avjoniserat vatten. Använd tillräckligt HCl och vatten för att täcka gelen i facket, och rotera facket med nedsänkt gelen på 40 rpm i orbitalskak.
    5. Inkubera gelen i denaturering buffert för 30 min. Tvätta med ultrarent avjoniserat vatten. Använd tillräckligt buffert och vatten för att täcka gelen i facket, och rotera magasinet med nedsänkt gelen på 40 rpm i orbitalskak. (Denaturering buffert: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl).
    6. Inkubera gelen i neutralisering buffert för 30 min. Tvätta med ultrarent avjoniserat vatten. Använd tillräckligt buffert och vatten för att täcka gelen i facket, rotera magasinet med nedsänkt gel på 40 rpm i orbitalskak. (Neutralization buffert: 0,5 M Tris, 1,5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Överföra DNA till en nylon membran.
    1. Förbereda setup för kapillär överföring av genomisk DNA. Placera en plastplatta (ungefär storleken av gelen eller större) över en bricka fylld med 20 x saltlösning-natriumcitrat (SSC). Vik en bit tjockt filter papper över facket, så att båda dess ändar hänger i SSC. Skär en gel och medelstora bit av positivt laddade nylon membran Hybond N +, och 2 stycken tjocka filtrerpapper. (20 x SSC: 3 M NaCl, 0,3 M natriumcitrat).
    2. Förbereda den blotting setup (figur 6) genom att placera gelen, slots ner på toppen av pappersfiltret på plast plattan. Placera ett Hybond n + membran på toppen, följt av 2 lager filtrerpapper. Pre våt varje skikt i 20 x SSC innan du lägger dem i församlingen. Se till att avlägsna eventuella luftbubblor mellan lager som dessa hindra DNA överföringen.
    3. Täcka församlingen med ett tjockt lager av mjukpapper. Placera en plastplatta med en vikt, till exempel en liten flaska, på toppen. Kontrollera trycket fördelas lika över gelen. Detta kommer att säkerställa korrekt överföring av DNA.
      Obs: Vikten bör vara ca 200 – 300 g; tunga vikter hämma DNA överföringen.
    4. Täck området kring den församlingen, inklusive exponerade filtrerpapper, med plastfilm (figur 6) för att undvika avdunstning av 20 x SSC buffert och mål kapillären krafter mot nylon membran. Torka över natten.
    5. Markera de platser, namn eller datum ovanpå membranet med penna, och ta bort membranet från församlingen. Observera att undersidan som har varit i kontakt med gelen, bär DNA.
    6. Omedelbart åtgärda DNA till membranet av UV-bestrålning (2.400 µJ/m2) med hjälp av en UV Crosslinker.
      Obs: Crosslinking villkoren beror på vilken typ av membran som används.
      Obs: vid denna punkt membranet kan lagras vid-20 ° C och används för hybridisering med en sond senare. Skölj tvärbundna membranet i 2 x SSC och försegla det i förväg viks värmeförseglingsbara polyeten slangen innan du placerar den vid-20 ° C.
  6. Förbered proben för hybridisering.
    1. Förstärka sekvensen som ska användas som proben för DNA analys med PCR-20. 50-100 ng av en 250 bp-2 kbp PCR-fragmentet används som en sond. Två separata sonder, en korsa till regionen högra kantlinje proximala och den andra till vänster proximala gränsregionen av T-DNA, kan användas för att bedöma förekomst av hela T-DNA (figur 4A och figur 7).
    2. Späd 50-100 ng av PCR-produkten i 24 µL ultrarent avjoniserat vatten i ett provrör.
    3. Denaturera utspädda PCR-produkten genom att koka det för 5 min i en bägare vatten eller värme block, sedan svalna direkt på is.
    4. Tina premade GCT-mix på is. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (alla 0,5 mM), slumpmässiga hexamers 43,2 ng/µL, Acetylerad BSA 1,33 mg/mL, 33 mM av β-merkaptoetanol, 0,67 M Hepes 0.17 mM Tris pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. Lägga till 21 µL av GCT-blandning och 2 U av Klenow fragmentet till PCR-produkten.
    6. Tillsätt 2 µL av [32P] ATP till mixen och inkubera vid 37 ° C i 1 h.
      Varning: Alla åtgärder som rör [32P] ATP behöver utföras i en miljö som utsetts för radioaktiva arbete medan du använder lämpligt skydd.
      Obs: Kontrollera [32P] ATP är färsk (inte mer än 1 halvtid har passerat).
    7. Förbereda en Sephadex G-50 (grova eller medellång) kolumn21 för renande märkt sonden från personbolag (radioaktivt) nukleotider. Ta en 2 mL spruta och täcka utloppet med en liten krets av tjock filterpapper. Tillsätt 2 mL av Sephadex G-50 upplöst i TE i sprutan och ta bort all vätska från kolumnen genom spinning.
    8. Placera kolumnen i en 15 mL plaströr, Ladda sonden märkt på kolumnen och snurra vid rumstemperatur (centrifugen vid 750 x g, tillåta rpm att öka tills 750 x g nås, sedan stoppa centrifugen som tillåter rotation sjunka till 0 x g) till eluera sonden. Tillsätt 200 µL av TE till kolumn och snurra för att eluera återstående sonden; Upprepa en gång. I dessa villkor, märkt DNA-fragmenten är undantagna från matrisen Sephadex och eluera, medan fria nukleotider kvar i kolumnen.
    9. Använd 300 µL märkt sondens per hybridisering rör. Håll återstående märkt sonden vid-20 ° C för senare användning. Dock Tänk på halvtid av [32P] ATP.
  7. Hybridisera DNA blot.
    1. Heat 2 x SSC och hybridisering buffert (15 mL per hybridisering rör, max 2 blotting per rör) till 65 ° C. (Hybridisering buffert: 10% dextran sulfat, 1% SDS, 1 M NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, upplösa vid 65 ° C, hålla alikvoter vid-20 ° C).
    2. Pre-Värm hybridisering ugnen till 65 ° C.
    3. Placera nylon mesh i en bricka med lite uppvärmd (65 ° c) 2 x SSC att täcka facket. Placera DNA blot ovanpå maskan, med DNA sida upp. Rulla blot tillsammans med mesh och infoga rullen i en hybridisering tube. Häll av överflödigt 2 x SSC.
    4. I en mikrocentrifug rör, koka 150 µL av lax spermier DNA (koncentrationen 10 mg/mL) per hybridisering rör för 5 min (se även steg 4.6.3). Kyl omedelbart på is och Lägg i förvärmd hybridisering bufferten.
    5. Lägga till hybridisering buffert-lax spermier lösningen i röret med blot. Pre hybridisera på 65 ° C i minst 1 h i en roterande hjul, vid 12 rpm.
    6. När den före inkuberingen i steg 4.7.5. är nästan färdig, koka 300 µL av märkt sonden för 5 min (se även steg 4.6.3) och tillsätt omedelbart till blot efter inkubering.
    7. Hybridisera över natten i det roterande hjulet vid 63 ° C, 12 rpm. Pipettera inte sonden direkt på blot, men i hybridisering buffert-lax spermier lösning.
  8. Tvätta blot.
    1. Värm de tvätt-lösningarna (1 x Specialföretaget, 0,1% SDS och 0,1 x SSPE, 0,1% SDS) till 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7,0).
    2. Kassera den hybridisering lösningen och tillsätt ungefär 100 – 150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS lösning till hybridisering röret, Stäng tuben och vrid för hand. Häll hybridisering och tvättlösningen i lämpliga flytande radioaktivt avfall.
    3. Tillsätt cirka 100 – 150 mL 1 x SSPE, 0,1% SDS lösning till röret, Stäng och Inkubera röret i 15 min på 63 ° C i det roterande hjulet, 12 rpm. Kassera tvättlösningen på lämpligt sätt.
    4. Tillsätt cirka 100 – 150 mL 0,1 x SSPE, 0,1% SDS lösning till hybridisering röret, Stäng och rotera röret för 5 min vid 63 ° C, 12 rpm. Kassera tvättlösningen på lämpligt sätt.
    5. Ta blot ur röret och placera den i ett tråg innehållande tillräckligt förvärmd 0,1 x Specialföretaget, 0,1% SDS och skaka i 3 min i en skakande vattenbad vid 65 ° C. Under tiden skölj maskstorleken i ett magasin fyllt med vatten.
    6. Teckna en blot, placera den mellan pre vikta plast (polyeten slangen), noggrant torka av överflödig vätska och låt blot torr kort. Observera att vätskan kommer att förstöra phosphorimager skärmen.
    7. Försegla blot i plast på tre sidor. Ta bort all överflödig vätska som omger blot och Stäng plast röret genom att täta den fjärde sidan. Klipp av överskottet av plast. Kontrollera att förseglade blot inte läcker och att plasten är torr på utsidan.
  9. Exponera phosphorimager skärmen.
    1. Placera den förseglade blot i en kassett som phosphorimager, med phosphorimager skärmen vänd DNA sidan av blot. Stäng kassetten och lämna för ± 2 – 4 dagar, beroende på styrkan av radioaktiva märkningen och känsligheten hos phosphorimager.
    2. Skanna phosphorimager skärmen med hjälp av en phosphorimager. Var noga med för att utsätta skärmen så lite som möjligt för ljus före skanning. Spara bilden. Radera skärmen från signal genom att utsätta den för ljus.
  10. Analysera blot.
    1. Analysen beror på den begränsning strategi som används i steg 4.1. När man analyserar blot upprättad enligt den strategi som visas i steg 4.1.1.1 (figur 4A), räkna antalet fragmenten upptäcks. I denna strategi avser antalet hybridiserade fragment antalet T-DNA integrationer.
      1. Jämför antalet fragmenten upptäcks med en sond för vänster (figur 7B) och den högra (figur 7 c) delen av T-DNA.
        Obs: Om olika antal korsa fragment är upptäckt, sedan antingen i) flera T-DNA-kopior (antingen i inverterad eller direkt orientering) eller ii) ofullständigt integrerat T-DNAs är närvarande.
      2. Uppskatta storleken på hybridiserade fragment på blot baserat på storleken på banden markör och jämför storleken på hybridiserade fragment med förväntade fragmentet storlekar beräknas utifrån strategin begränsning av tandem infogningar (figur 4A) till identifiera möjliga tandem arrangemang av de T-DNAs. Använda figur 4A som en guide för att beräkna storleken på förväntade fragment.
        Obs: Om storleken på hybridiserade fragment inte håller med beräknade ettor, mest sannolikt en av de närvarande integrationerna är inte komplett.
    2. När analysera blot upprättad enligt strategi som visas i steg 4.1.1.2 (figur 4B), uppskatta storleken på den hybridizing fragmenten på blot baserat på storleken på markör band och jämföra den med den förväntade storleken. En intakt införande ger ett enda fragment med en definierad längd. Varje avvikelse av förväntade längd anger ofullständiga integration (figur 7 d).
  11. Strip blot för förnyad hybridisering (valfritt).
    Obs: Samma blot kan vara hybridiseras i följd med olika sonder. Innan du fortsätter med en ny sond, band en tidigare hybridiserade sond från blot.
    1. Ta bort sonden från blot, placera blot i ett fack med dess DNA-sidan nedåt. Häll ett överskott på 0,5% SDS i facket. Koka membranet i 2 – 5 min. Varaktigheten av behandlingen beror på storlek och GC-innehåll av sonden används. Längre och GC-rikare sonder behöver en längre behandling.
    2. Efter strippar, hybridisera blot med en annan sond, eller täta och förvaras vid-20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av BIBAC-GW systemet, var reporter konstruktioner för att studera ODM i växter genererade10. Konstruktioner var utformad i Gateway posten vektor pENTR-gm12 och infogas i pBIBAC-BAR-GW (figur 1) med Gateway LR rekombination reaktionen.

Arabidopsis omformades med pDM19, en BIBAC-BAR-GW plasmid med en mTurquoise-eYFP reporter bär en translationell stop kodon i ramen eYFP läsning på plats 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (figur 2)10. Totalt var 126 Arabidopsis växter transformerad (9 växter per pott, 14 krukor). Frön av dessa växter poolade, såddes på brickor med jord, och tillåts växa under två veckor före behandling med glufosinatammonium lösning. Endast plantor uttrycker bar genen (närvarande i BIBAC-BAR-GW) överleva glufosinatammonium behandling (figur 3). Totalt identifierades 11 transgenics omvandlas med pDM19, motsvarar en förvandling effektivitet av 0,02% av fröna analyseras.

För de 11 transgenics isolerade, användes DNA analys för att bestämma antalet T-DNA integrationer. För detta ändamål skars genomiskt DNA med antingen BglII eller Scajag (strategi som utarbetats på figur 4A). Båda dessa restriktionsenzym skär bara en gång i T-DNA-sekvensen (figur 7A). Hybridisering med sonder erkänner baren och eYFP kodande regioner tillät detektering av antalet respektive DNA-fragment.

Antalet individuella DNA fragment på blopparna tillåtet för att uppskatta antalet T-DNA infogningar i raderna reporter (tabell 1). Enda korsa fragment med både Bar och eYFP sond anges förekomsten av en enda T-DNA-integration. Från de 11 transgenics analyseras, burit sex enda integrationer. Genomsnittligt antal integrationer var 1,2.

För 6 linjer bära en enkel T-DNA-integration, testades integriteten hos den Infoga reporter bygga med DNA blotting (strategi som utarbetats på figur 4B). Genomiskt DNA skars med BglII och Pcijag att släppa en 5,5 kb fragmentet som innehåller både Bar och mTurquoise-eYFP fusion genen (figur 7A). En sond mot eYFP användes för att upptäcka den förvänta fragmenten. Alla växter testade bar ett intakt fragment. Observera att fragmentet undersökte utesluter vänster och höger T-DNA gränsen, och undersöker därför inte integriteten i hela T-DNA, men endast den del som innehåller transgener sevärdheter.

Uttrycket av genen fluorescerande reporter var beslutsam i oberoende singel-kopia transgena linjerna skiljer sig endast genom genomisk platsen för T-DNA. Relativa avskrift nivåer av CaMV-35S arrangören-driven mTurquoise-eYFP reporter mättes av RT-qPCR i fyra DM19 reporter rader bär intakt, singel-kopia integrationer som genomisk ställning var beslutsamma10. Variationen i reporter gen uttryck nivåer mellan raderna var mindre: den maximala skillnaden i mTurquoise-eYFP RNA-nivåer var 2-faldig (figur 8A).

Nästa, ODM genomfördes i dessa reporter rader. Tre av de fyra oberoende reporter linjerna visade ganska liknande ODM effektivitetsvinster (figur 8B). Dock en linje, DM19 [4] 1, gav en mycket låg ODM effektivitet jämfört med andra linjer. Dessa resultat indikerar att ODM påverkas av lokala genetiska samband. På vilket sätt den lokala genomisk ramen T-DNA i DM19 [4] 1 skiljer sig från de andra linjerna kvarlevor identifieras. Analys av tillgängliga datauppsättningar på aktiva och inaktiva kromatin märken på genomisk T-DNA integration platser i icke-transgena växter innehöll inte ett svar10.

Figure 1
Figur 1: funktionella kartor av pBIBAC-GW vektorer. pBIBAC-GW derivat finns med antingen resistens mot glufosinatammonium (bar) eller DsRed fluorescens i frö rockar (DsRed) som urval markör i växter. För båda vektorer är en kanamycin motstånd gen urval markören i bakterier. Gatewayen ccdB kassett visas mellan gröna pilspetsar som representerar rekombination webbplatser attR1 och attR2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: mutagenes reporter construct. MTurquoise-eYFP reporter generna drivs av den 35S-CaMV promotor. Den mTurquoise kodande regionen smälts samman till en eYFP kodande regionen bär en C-A-mutationen vid nukleotid position 120, vilket resulterar i en för tidig translationell stop kodon TAA och förtida upphörande av översättningen av proteinet fusion. 3′ Nopaline Synthase (3' nos) polyadenylation signalen används för att avsluta transkriptionen av den konstruera22. Cellkärnelokalisering signal (NLS) används för att rikta de översatta proteinerna till kärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: fack fyllda med Arabidopsis plantor före och efter glufosinatammonium behandling. Plantor som inte uttrycker den bar -genen som finns i pBIBAC-BAR-GW T-DNA dör efter att besprutas med glufosinatammonium lösning. Bilderna visar samma fack av plantor (A) innan sprutning med glufosinatammonium, 14 dagar efter sådd, och (B) 10 dagar senare, efter att besprutas två gånger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: allmänna DNA strategi att identifiera antalet och orördhet av insatt T-DNAs. (A) en begränsning webbplats (R) i mitten av T-DNA kan oberoende sondering av vänster (röd L) och högra delen av T-DNA (grön R). Karikatyrerna till höger visar att beroende på enkel - eller multi - kopieringsskyddad T-DNA integrationer, olika banding mönster erhålls med DNA blotting. Banden markeras med en * har en definierad längd, medan längden på andra band beror på webbplatsen närmaste begränsningen i den kompletterande genomiskt DNA. Enda infoga: L och R sond både ge en oberoende fragment. Den beräknade genomsnittliga fragment storleken kan beräknas baserat på frekvensen av webbplatsen begränsning i genomet. Minimal storlek är avståndet från webbplatsen begränsning till vänster kantlinje (LB) eller höger kantlinje (RB), beroende på vilken ände av integration är att bli utforskad och om T-DNA är intakt. Tandem repeat: Sonderna för L och R ge båda två fragment; för varje sond en fragment innehåller flankerande genomiskt DNA, andra fragmentet har en förväntad storlek och identifieras av båda sonder. Inverterad upprepa: Beroende på riktningen av integrerade kassetten, kan antingen ett L och två R fragment, eller två L och en R identifieras. Enskilda enda infogningar: Resultatet är ett antal oberoende fragment, och antalet fragment motsvarar antalet integrationer. (B) begränsning webbplatser på extremiteter av T-DNA kan bestämma integriteten av fragmentet mellan begränsning platser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: en agarosgel med begränsning mönster och matchande insynen. (A) på agarosgel, genomisk DNA smältas med EcoRjag visas. Ordentlig nedbrytning av DNA illustreras av närvaron av diskreta satellit band. (B) märkning ställning av slots och markör band på en öppenhet gör det möjligt att senare enkelt beräkna storleken på korsa fragment. Här, MRC Holland markörer (blå och röd) används, anges av M. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: inställning för kapillär blotting. I en kapillär blotting setup, placeras filterpapper på en plastplatta med ändarna av papperet hängande i 20 x SSC buffert. Papperet är fuktade med 20 x SSC och en agarosgel placeras på toppen, följt av ett nylon membran, filterpapper och en stack av vävnader. Låg vikt är placerad på toppen. Omsorg vidtas för att avlägsna luftbubblor mellan gel, papper och membran. Plastfilm för att undvika uttorkning av installationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: exempel på DNA blotting strategi och experimentella resultat. (A) DNA blotting strategi för att fastställa antalet orördhet av T-DNA integrationer. Styckning platser för de valda restriktionsenzym inom T-DNA indikeras med vertikala staplar. EYFP och bar sonderna används för hybridisering med smält genomiskt DNA indikeras med en linje med terminal dot nedan T-DNA. (B–D) Exempel DNA blotting. Genomiskt DNA skars med Scajag och blot var utforskad med både bar och eYFP sond (B och C). Genomiskt DNA var skära med BglII och Pcijag och utforskad med en bar sond. Intakt fragmenten är 5,5 kbp i storlek (D). Observera att på exemplen i D skiljer sig från dem i B och C. * anger beräknade fragment storlek; M, markör. I B, C och D används samma storlek markören. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: mTurquoise-eYFP uttryck nivåer och ODM effektivitetsvinster i oberoende mTurquoise-eYFP reporter linjer. (A) relativ mTurquoise-eYFP avskrift uppmätta nivåerna av RT-qPCR i DM19 reporter linjer. För normalisering användes avskrift nivåer av aktin. (B), ODM effektivitet mäts i raderna DM19 reporter. För A och B, barer visar genomsnittet av minst fem biologiska replikat. Felstaplar visar SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Typ av T-DNA locus Antal T-DNA integrationer Reporter lina Antal fragment som upptäckts Integritet
SCA Jag BGL II BGL II/PciI
bar eYFP bar eYFP eYFP
Enda locus integrationer 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
2, inverterad upprepa 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, ofullständiga integration 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Flera locus integrationer 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND – ej bestämd.

Tabell 1: Sammanfattning av DNA blotting data för transgenics isolerad efter omvandlingen med pDM19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska till att generera transgenics med enda, intakt integrationer av en transgen är valet av den binära vektor som används. BIBAC familj vektorer har använts för att leverera sekvenser av intressen till många växt arter23,24,25,26,27,28. BIBAC vektorer, inklusive BIBAC-GW, avkastning singel-kopia integrationer med hög effektivitet: det genomsnittliga antalet infogningar per rad är 1,5 till 2, jämfört med 3 eller högre för de vanligaste binära vektorer5,9, 29. som en stor förbättring jämfört med andra BIBAC vektorer, med BIBAC-GW vektorer, sekvenserna av intresse kan enkelt infogas använder Gateway rekombination platser12. De modifierade vektorerna övervinna de allmänna problemen med BIBAC vektorer när den används i konventionella kloning strategier: i) ett mycket begränsat antal unika begränsning platser och ii) en låg DNA avkastning. Gateway rekombination webbplatser göra BIBAC-GW vektorer ett attraktivt alternativ till andra binära vektorer för generering av transgena växter.

Här beskrivs en rad protokoll, genererar BIBAC-GW derivat som innehåller sekvenser av intresse, för att plantera omvandling och DNA blot analys för nummer och orördhet av transgena sekvenser. Flera av protokollen rapporterade i detta papper, Gateway kloning, elektroporation av bakterier och växt förvandling, är vanligt i många laboratorier och kan även utföras med smärre ändringar. Det är viktigt att veta att BIBAC-GW är en singel-kopia vektor i E. coli och A. tumefaciens. Därför, när isolera DNA, avkastningen är låg; Det rekommenderas att skala upp förfarandet för isolering.

I transgenics bära flera T-DNA integrationer, introducerade transgener utsätts ofta för nedtystning1,2,4,30, och bör därför för de flesta tillämpningar undvikas. För att identifiera transgena växter med enda, intakt integrationer, är det rekommenderat att använda DNA blot-analys. Medan andra metoder än DNA blotting kan användas för att avgöra T-DNA kopienummer och integriteten hos de T-DNAs i transgena linjerna (segregation analys, svans-PCR, kvantitativ PCR (qPCR) och digital droplet PCR), fastän labor intensiv, DNA blotting är ofta metoden för val. Segregation analys är inte kunna skilja mellan flera och enda T-DNA integrationer på enstaka lokus. SVANS-PCR ofta under uppskattningar kopian nummer, särskilt om mer än en T-DNA integration är närvarande31, och qPCR behöver utarbeta optimering för tillförlitliga resultat31,32. Digitala droplet PCR är en ganska exakt metod för kopia nummer upptäckt om den utrustning som behövs är tillgängliga31. Fördelen av DNA blotting är lättköpt upptäckt av trunkerade T-utsedda nationella myndigheter, som är lätt missas i alla PCR-baserade tekniker.

Med DNA blot-analys behöver hybridizing fragment på blot vara väl identifierbara i signal och storlek. Flera faktorer är kända för att påverka resultatet av DNA blotting. Förutom ett lämpligt urval av restriktionsenzym (strategi som anges i figur 4) och storlek markörer, tillräcklig DNA av god kvalitet krävs. Mindre än 2 µg av genomisk Arabidopsis DNA kommer inte att ge väl identifierbara fragmenten. När man arbetar med större genomen, krävs mer DNA. För att få tillräckliga mängder av Arabidopsis DNA, kan blommig vävnader eller 1 - vecka gamla plantor användas. Ett parti av plantor som odlas på en petriskål ger 2 – 8 µg av DNA. För att undvika DNA nedbrytning under isolering, bör vara försiktig att bearbeta växtmaterial snabb. Dessutom genomiskt DNA bör resuspended i Tris-EDTA minska dess nedbrytning av nukleaser och lagras vid 4 ° C snarare än-20 ° C att förhindra DNA Hack på grund av upprepad frysning-upptining cykler. Om du är osäker att alla DNA-prover är helt smält, föreslås det för att rehybridize DNA blot med en sond som erkänner en endogen, unika genomisk region. När du väljer sonden sekvenser för att identifiera transgena eller endogena sekvenser, är det viktigt att välja endast unika sekvenser. För att kunna exakt avgöra hybridiseras fragment storlek, placerar av DNA gel slots och DNA markör band bör markeras på en öppenhet (figur 5B) när visualisera en etidiumbromid-färgade gel (figur 5A) på en UV transilluminator. Om markör sekvenser inte hybridiserar med sond DNA, eller hybridisering är partiell, är det det enda sättet att spåra storleken på korsa fragment.

När omsorg vidtas för att uppnå bra hybridisering signal och uppskattning av fragment storlek, är tolkningen av blotting resultaten okomplicerad. När du använder bara ett restriktionsenzym och korsa med olika sonder att upptäcka antingen den vänstra eller högra delen av T-DNA, återspeglar antalet upptäckta fragment antalet T-DNA infogningar. Exempelvis figur 7B, C visar samma DNA blot, hybridiseras med olika sonder, bar (figur 7B) och förbättrad gul fluorescerande Protein (eYFP) (figur 7 c), använder den strategi som visas i figur 7A. Alla körfält, utom 4, Visa ett lika stort antal fragment på båda blotting: två fragment för linje 6 och ett enda fragment för alla andra rader. Detta antal upptäckta fragment är antalet T-DNA infogningar.

När antalet fragment upptäcks med sonder bindande antingen vänster eller höger del av T-DNA skiljer sig (när det gäller figur 7BC, linje 4), antingen ofullständig infogningar är närvarande, eller de T-DNAs har infogat i tandem arrangemang. Tandem infogningar Visa icke-slumpmässiga fragment längd för en T-DNA fragment (figur 4A, högra panelen) och kan identifieras genom att jämföra storleken hybridiserade fragment med vad som förväntas utifrån strategin. En ytterligare blotting strategi kan behövas för att bekräfta tandem arrangemang av T-DNA infogningar. I provet på linje 4 (figur 7B, C), är två infogningar ordnade i en inverterad upprepa orientering.

Vid uppskattningen av orördhet en T-DNA, eller en del av det, kan längden på hybridizing fragmentet beräknas baserat på strategin. Varje avvikelse från den förväntade storleken anger förekomsten av en ofullständig införande. Till exempel i figur 7 dmigrerar i lane 4, ett hybridizing fragment på 8 kbp, (i stället för den förväntade 5.5 kbp) indikerar en ökad fragment storlek på grund av en begränsning webbplatser.

BIBAC-GW vektorer är utmärkta verktyg för att generera singel-kopia intakt integrationer i ett antal växtarter. Det protokoll som redovisas här ger en tillförlitlig för att identifiera växter med enda, intakt integrationer av en transgen av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av den holländska Technology Foundation STW (12385), som är en del av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), och som delvis finansieras av departement av ekonomiska angelägenheter (OTP Grant 12385 till MS).  Vi tackar Carol M. Hamilton (Cornell University, USA) för att tillhandahålla pCH20, ryggraden i BIBAC-GW vektorer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Genetik fråga 133 binärt vektor BIBAC Gateway kompatibel binära vektor plantera omvandling enkel integration nedtystning DNA blotting södra blotting
Generera transgena växter med singel-kopia infogningar använder BIBAC-GW binära vektor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter