Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

Published: March 28, 2018 doi: 10.3791/57295
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

Summary

Utilizzando un vettore binario pBIBAC-GW rende generando piante transgeniche con inserimenti di singola copia intatti, un processo facile. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche di Arabidopsis e prova le piante per integrità e copiare il numero degli inserti.

Abstract

Durante la generazione di piante transgeniche, generalmente l'obiettivo è di avere espressione stabile di un transgene. Questo richiede una singola, intatta l'integrazione del transgene, come multi-copia integrazioni sono spesso sottoposti al silenziamento genico. Il vettore binario compatibile con Gateway basato su cromosomi artificiali batterici (pBIBAC-GW), come altri derivati pBIBAC, permette l'inserimento di transgeni copia singola con alta efficienza. Come un miglioramento per il pBIBAC originale, una cassetta di Gateway è stata clonata in pBIBAC-GW, così che le sequenze di interesse possono ora essere facilmente incorporate nel transfer vettoriale DNA (T-DNA) mediante la clonazione di Gateway. Comunemente, la trasformazione con pBIBAC-GW si traduce in un'efficienza pari a 0,2 – 0,5%, per cui la metà della transgenetica trasportare un'integrazione di singola copia intatta del T-DNA. I vettori di pBIBAC-GW sono disponibili con resistenza al glufosinato-ammonio o DsRed fluorescenza in cappotti di seme per la selezione di piante e con resistenza alla kanamicina come una selezione nei batteri. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche utilizzando pBIBAC-GW: a partire da ricombinando le sequenze di interesse nel vettore pBIBAC-GW di scelta, di piantare trasformazione con Agrobacterium, selezione della transgenetica e prova le piante per integrità e copia il numero degli inserti utilizzando DNA macchiare. Attenzione viene data alla progettazione di una strategia di blotting di DNA riconoscere single - e multi - copia integrazioni ai loci singoli e multipli.

Introduction

Durante la generazione di piante transgeniche, solitamente l'obiettivo è di avere il transgene(s) integrato stabilmente espressa. Questo può essere ottenuto integrazioni intatto copia singola di un transgene. Più integrazioni possono portare all'espressione aumentata di un transgene, ma anche al silenziamento genico. Silenziamento dei transgeni è più probabile se sequenze inserite sono disposti in tandem o ripetizioni invertito1,2,3,4. Vettori binari vengono utilizzati come navette in Agrobacterium-mediata esperimenti di trasformazione per consegnare le sequenze di interesse in genomi delle piante. Il numero di integrazioni in un genoma della pianta è dipenda dal numero di copia del vettore binario in Agrobacterium tumefaciens5,6. Molti vettori binari comunemente utilizzati sono vettori di alta copia e pertanto generare un numero di copie del transgene medio alta: 3.3-4.9 copie in Arabidopsis5.

Il numero delle integrazioni T-DNA può essere abbassato utilizzando vettori binari che hanno un numero di basso-copia di a. tumefaciens, ad esempio BIBAC7, o con il lancio di un T-DNA a. tumefaciens del cromosoma5. Il numero medio di integrazioni del transgene in tali casi è inferiore a 25,8,9,10. A causa di essere copia singola in a. tumefaciens e anche in Escherichia coli, BIBAC-derivati possono mantenere e consegnare costrutti grande come 150 kb11.

GW-compatibile BIBAC vettori10,12 permetterne la facile introduzione di geni di interesse nel vettore utilizzando Gateway clonazione. L'uso della tecnologia Gateway semplifica notevolmente la procedura di clonazione, ma supera anche i problemi più comuni associati con grandi vettori low-copy-number13,14, come un basso rendimento del DNA e una selezione limitata di unica restrizione siti disponibili per la clonazione7,11. I derivati di pBIBAC-GW sono disponibili con una resistenza al glufosinato-ammonio (pBIBAC-BAR-GW) o DsRed fluorescenza in tegumenti (pBIBAC-RFP-GW) per la selezione di piante (Figura 1)10,12. Per entrambi i vettori, un gene di resistenza alla kanamicina viene utilizzato come indicatore di selezione nei batteri.

Combinano i vettori pBIBAC-GW: (1) facile progettazione e manipolazione genetica in e. colie (2) intatto copia singola integrazioni in planta ad alta efficienza. Il rendimento dei vettori pBIBAC-GW integrazioni media 1.7 in Arabidopsis con circa la metà delle piante transgeniche che trasportano un singolo integrato T-DNA10.

Stabile espressione dei transgeni è un requisito per la maggior parte transgenetica generato. L'espressione del transgene stabile può essere ottenuta integrazioni intatti, singola copia. Lavorare con piante transgeniche che trasportano integrazioni intatti, copia singola è, tuttavia, ancora più importante se, ad esempio, lo scopo è lo studio dell'efficienza dei processi basati su cromatina, come mutagenesi, ricombinazione, o la riparazione e la dipendenza di questi processi sulla posizione genomica e struttura della cromatina, al sito di inserimento. Per il nostro interesse, per studiare la dipendenza di mutagenesi oligonucleotide diretto (ODM) sul contesto locale di genomico, un insieme di linee di reporter con integrazioni intatti, singola copia di un gene del reporter di mutagenesi era generato (Figura 2)10. Utilizzando questo set di righe, è stato dimostrato che l'efficienza ODM varia tra i loci transgenici integrati in differenti luoghi genomic, nonostante i livelli di espressione del transgene essendo piuttosto simile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inserimento di sequenze di interesse in vettore binario

  1. Preparare i vettori binari e voce Gateway.
    1. Isolare il vettore di voce Gateway che contiene un frammento di DNA o il gene di interesse utilizzando un kit di mini-preparazione secondo i suggerimenti del fornitore.
      Nota: BIBAC-GW vettori richiedono l'uso di kanamicina (Km) per la selezione nei batteri, quindi, utilizza un vettore di ingresso con un altro indicatore di resistenza invece di kanamicina. Per esempio, il vettore pENTR-gm, portatrice di un gene di resistenza della gentamicina, è una buona scelta di12.
    2. Propagare e isolare il vettore BIBAC-GW di interesse. Utilizzare un ceppo di e. coli che è resistente alla tossicità del gene ccdB presente all'interno della cassetta di Gateway. BIBAC-vettori isolare utilizzando protocolli o kit specificamente progettato per grandi plasmidi secondo i suggerimenti del fornitore.
  2. Eseguire una reazione di Gateway.
    1. Preparare la reazione di ricombinazione LR secondo i suggerimenti del fornitore. Miscelare i componenti seguenti in una microcentrifuga da 1,5 mL a temperatura ambiente (TA): 100 – 300 ng clone di voce (supercoiled), 300 ng di BIBAC-GW vector, LR Clonase tampone di reazione (concentrazione finale: 1x). Regolare il volume della miscela a 16 µ l con TE (10 mM Tris, 1 mM di EDTA, pH 8.0). Infine, aggiungere 4 µ l di mix di enzima LR Clonase e mescolare nel Vortex. Incubare la miscela a 25 ° C per 1 h.
    2. Terminare la reazione di LR aggiungendo 2 µ l di soluzione di proteinasi K (2 µ g / µ l) per la miscela preparata al punto 1.2.1. Mescolare e incubare a 37 ° C per 10 min.
  3. Trasformare e. coli con la miscela di reazione di Gateway mediante elettroporazione.
    1. Dissalare la miscela di reazione LR prima di elettroporazione.
      Nota: Questo passaggio è fondamentale per il successo elettroporazione. Sotto una dialisi metodo è descritti, ma altri metodi come precipitazione con l'acetato del sodio e dell'etanolo può essere utilizzato anche.
      1. Preparare l'installazione per dialisi filtro della reazione LR. Versare 20 mL di acqua deionizzata ultrapura in una capsula di Petri sterile. Inserire un disco di filtro di membrana (dimensione dei pori = 0,025 µm) sulla superficie dell'acqua.
      2. Pipettare l'intera reazione LR attentamente sopra la membrana e lasciare che la miscela di Dializzare a temperatura ambiente per 1 h.
    2. Aggiungere 5 µ l di mix LR dissalate a cellule DH10B electro-competenti in una cuvetta di elettroporazione (0,1 cm). Electroporate le cellule (1.5 V/cm, resistenza 200 Ω, capacità 25 µF) e immediatamente aggiungere 1 mL di terreno di repressione (SOC) preriscaldata Super ottimale dei cataboliti alle celle, seguite da incubazione a 37 ° C per 45 min, 180 giri/min. (Mezzo di SOC, 1 l: 20 g di Bacto triptone, 5 g di lievito estratto, 0,5 g di NaCl, 2,5 mL di KCl 1M, 20 mL di 1 M filtro-sterilizzato del glucosio).
      Nota: Le cellule DH10B possono essere sostituite per altre cellule di Escherichia coli che mantengono stabile grandi plasmidi.
      Nota: Le condizioni ottimali di elettroporazione sono dipendente l'elettroporazione dispositivo utilizzato.
    3. A pellet batteri alla massima velocità per 30 s utilizzando una microcentrifuga, rimuovere l'eccesso SOC e risospendere il pellet in circa 50-100 µ l di terreno di Luria-Bertani (LB). Diffondere i batteri sui piatti di kanamicina-LB (Km-LB) (concentrazione Km, 40 µ g/mL) e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. (Mezzo LB, 1 l: 10 g di Bacto triptone, 5 g di lievito estratto, 10 g di NaCl. Per mezzo solido aggiungere agar, 15 g/L).
  4. Identificare i derivati BIBAC-GW ricombinati e isolare il DNA del plasmide.
    1. Per essere in grado di crescere su piastre Km-LB, le cellule di e. coli dovrebbero contenere il plasmide BIBAC-GW ricombinato in cui la sequenza di ccdB viene sostituita con l'inserto desiderato. Utilizzare Colonia Polymerase Chain Reaction (PCR)15 per verificare se le colonie di batteri sulla piastra contengono i plasmidi corretti, avendo la spina dorsale BIBAC-GW e l'inserto di interesse.
      1. Per identificare la spina dorsale pBIBAC-BAR-GW, eseguire una reazione di15 PCR con primer DM1969 5'-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 'e DM1970 5'-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3'. Questo set di primer amplifica un frammento di bp 563 del gene bar .
      2. Per verificare la presenza della dorsale BIBAC-RFP-GW, eseguire una reazione di15 PCR, utilizzando primer M737 5'-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 'e M892 5'-AACAGATGGTGGCGTCCC-3'. Questa combinazione di primer amplifica un frammento di bp 791 sovrapposizione la sequenza del promotore e rfp cruciferin.
      3. Eseguire reazioni di15 PCR utilizzando primers gene-specifico per verificare la presenza dell'inserto di interesse.
    2. Inoculare una singola Colonia positiva in 2 – 5 mL di terreno LB contenente kanamicina (40 µ g/mL) per isolamento di DNA16. Incubare a 37 ° C su agitatore orbitale a 180 giri/min, per una notte.
    3. Isolare il DNA del plasmide (Vedi punto 1.1.2).

2. preparazione di a. tumefaciens per immersione floreale di Arabidopsis

  1. Trasformare BIBAC-GW derivati di a. tumefaciens.
    1. Preparare cellule electro-competente di a. tumefaciens helper di ceppo C58C1 che trasportano il pCH32 plasmide7. Crescere i batteri in presenza di tetraciclina (5 µ g/mL) e rifampicina (100 µ g/mL) per selezionare per pCH32 e garantire la crescita delle cellule di Agrobacterium solo.
    2. Aggiungere 0,25-0,5 µ g di DNA di un derivato di pBIBAC-GW, pre-disciolto in 10-20 µ l sterile deionizzata acqua ultrapura, a 20 µ l competente Agrobacterium celle in cuvette di elettroporazione (0,1 cm). Mantenere le cellule sul ghiaccio.
    3. Electroporate le cellule (1.5 V/cm, resistenza 400 Ω, capacità 25 µF). Immediatamente dopo l'elettroporazione, aggiungere 1 mL di terreno di SOC pre-riscaldata (28 ° C) per i batteri e incubare le cellule a 28 ° C per 60-90 min.
    4. Diffusione di 100 µ l e il resto dei batteri su piastre LB separate contenenti rifampicina (100 µ g/mL), tetraciclina (5 µ g/mL) e kanamicina (40 µ g/mL) e incubare al buio a 28 ° C per 1-2 giorni.
  2. Preparare la sospensione di Agrobacterium .
    1. Verifica mediante PCR un paio delle colonie a. tumefaciens dalla piastra preparata al punto 2.1.4, per la presenza del vettore corretta (Vedi punto 1.4.1).
    2. Striscia una singola Colonia confermata per contenere il vettore binario con l'inserto appropriato su una piastra di LB contenenti antibiotici (Vedi punto 2.1.4). Crescere a 28 ° C durante la notte.
    3. Ripetere le meches con una singola Colonia ottenuta al punto 2.2.2.
    4. Inoculare una singola Colonia in 2,5 mL di medium di LC completate con gli antibiotici (Vedi punto 2.1.4) per coltura. Mantenere in incubazione a 28 ° C per almeno 8 h o durante la notte, a 180 giri/min. (Mezzo di LC, 1 l: 10 g di Bacto triptone, 5 g di lievito estratto, 0,5 g di NaCl, 2,5 g di MgSO4 · 7 H2O, 2 g di maltosio).
    5. Aggiungere la coltura dal punto 2.2.4. a 250 mL LC completati con antibiotici (Vedi punto 2.1.4) e crescere a 28 ° C, a 180 giri/min, durante la notte.
    6. Pellet la cultura di filatura a 5.500 x g per 12 min. Risospendere il pellet in 100 mL di soluzione contenente il 5% di saccarosio, 0.05% del Silwet L-77, 0,5 x ms Pour la sospensione in un contenitore sterile per immersione floreale delle piante.

3. Arabidopsis trasformazione

  1. Preparare le piante di Arabidopsis per trasformazione.
    1. Coltivare le piante di Arabidopsis in una camera di crescita controllata di serra o clima fino a quando essi stanno fiorendo (12 pentole con 9 piante ogni per immersione).
    2. Agganciare i primi spit per consentire più bulloni secondarie ad emergere. Piante sono pronte per immersione 4 – 6 giorni dopo il taglio, quando le piante hanno molti capolini immaturi e non molti fertilizzato silique.
  2. Floreale di immersione
    1. Immergere le infiorescenze per 5 – 10 s in Agrobacterium sospensione preparata al punto 2.2.6. Utilizzare movimentazione delicata.
    2. Avvolgere le parti fuori terra delle piante nella pellicola trasparente per mantenere alta l'umidità e coprire i vasi della pianta con una scatola per mantenere le piante al buio. Incubare le piante per 2 giorni in una camera di crescita/serra.
    3. Smontare il box e la pellicola trasparente e coltivare le piante alla maturità in una camera di serra/crescita.
      Nota: Per aumentare l'efficienza di trasformazione, le stesse piante possono essere ri-tuffati 7 giorni dopo la prima immersione.
    4. Raccogliere i semi. Piscina e analizzare i semi (T1) di piante, trasformati con lo stesso costrutto, come un unico insieme.
  3. Schermo per piante transgeniche.
    1. Per schermare per piante transgeniche, trasformati con un derivato di pBIBAC-RFP-GW, analizzare i semi utilizzando la microscopia a fluorescenza. Al fine di rilevare DsRed espressione nei tegumenti, immagine i semi a un'eccitazione di 560 nm e l'emissione di 600-650 nm. Separare i semi fluorescenti dalle controparti non fluorescente usando il forcipe.
    2. Per schermare per piante transgeniche, trasformati con un derivato di pBIBAC-BAR-GW, seminare i semi in vassoi riempiti con terreno (~ 2.500 semi/0,1 m2). Per garantire una diffusione anche di semi sopra vassoi, sospendere semi in 0,1% agar in 0,5 x Murashige Skoog medio (MS) e spargere i semi utilizzando una pipetta da 1 mL.
      Nota: Per stimolare i semi di germinare in modo sincrono, incubare i semi per almeno 2 giorni a 4 ° C. Questo può essere fatto prima o dopo la semina i semi.
      1. Spruzzare i semenzali con soluzione di glufosinato-ammonio 0,5% 2 settimane e 3 settimane dopo la semina in vassoi. Uso 500 mL di soluzione di glufosinato-ammonio per 1 m2.
      2. Trasferimento superstite piantine in singoli vasi. Una tipica immagine di un vassoio con piantine prima e dopo trattamento di glufosinato-ammonio (seconda) sono mostrati nella Figura 3.
      3. Analizzare le piante glufosinato-ammonio-resistente di PCR per la presenza del costrutto di interesse (vedere il punto 1.4.1. per primer).
        1. Isolare il DNA genomico vegetale per PCR usando il metodo descritto da Edwards et al. 17

4. caratterizzazione transgenetica per il numero e l'integrità delle integrazioni T-DNA

  1. Strategia di digestioni di restrizione
    Nota: Determinare il numero di integrazioni T-DNA e della loro integrità dal DNA macchiare usando gli enzimi di restrizione. Questo metodo permette di identificare singoli, ma anche ripetute integrazioni ai loci uguali o diversi nel genoma.
    1. Utilizzare una serie di digestioni di restrizione per identificare i modelli di integrazione di diversi possibili:
      1. Selezionare un enzima che taglia una volta in mezzo il T-DNA, per essere in grado di sondare in modo indipendente sequenze a Monte e a valle del sito di restrizione (Figura 4A e Figura 7A-C). Vedi Figura 4Ae la leggenda di figura per i risultati attesi e l'interpretazione.
      2. Selezionare un enzima o una combinazione di enzimi tagliando fuori l'intera sequenza di interesse in una sola volta (Figura 4B e figura 7A-D). Ogni deviazione dalla lunghezza della nota indica troncamento della cassetta integrata.
        Nota: fare attenzione a utilizzare solo gli enzimi di restrizione che non sono sensibili alla metilazione della citosina.
  2. Preparare i campioni di DNA genomici.
    1. Isolare il DNA genomico da piante che trasportano il costrutto di interesse. Un metodo di miniprep CTAB DNA può essere utilizzato per isolamento di DNA18. Per DNA analisi di Arabidopsis DNA della macchia, 2 – 2,5 µ g di DNA genomic è necessaria. Sciogliere il DNA in 50 µ l di TE.
    2. Verificare l'integrità del DNA da gel di elettroforesi16. DNA genomico intatto migra come una discreta banda nella parte superiore del gel. Degradazione del DNA può essere riconosciuta come la presenza di una sbavatura. Per evitare il danno del DNA a causa di ripetuti di congelamento-scongelamento, campioni di DNA genomico sono conservati a 4 ° C.
    3. Digerire il DNA genomico (2 – 2,5 µ g nel caso di DNA genomic Arabidopsis ) in un volume totale di 50 µ l, durante la notte, utilizzando condizioni di buffer suggerite dal fornitore degli enzimi.
      1. In una provetta, mescolare 2 – 2,5 µ g di DNA genomico di Arabidopsis , buffer di restrizione di 5 µ l x 10 e 5 U enzima di restrizione in un totale di acqua deionizzata ultrapura di 50 µ l.
    4. Aggiungere colorante di caricamento (1 x concentrazione finale) ai campioni prima di caricarle su un gel di restrizione. Per una buona visibilità, utilizzare uno dei seguenti: comigrating con piccoli frammenti (blu di bromofenolo, 350 – 400 bp), o comigrating con frammenti più grandi (Cylene cianolo, kbp 3 – 4).
  3. Esegua il gel del DNA.
    1. Preparare una lunga (20 cm) 0.5 x TBE gel dell'agarosi,19. La percentuale di agarosio nel gel varia a seconda le dimensioni del frammento prevede. 0,8 – 1% in modo ottimale separa frammenti > 1 kb in dimensione. Utilizzare 1 – 1,5% di agarosio per frammenti < 1 kb. Non aggiungere il bromuro di etidio al gel. (5x TBE, 1 l: 54 g di Trizma base, 27,5 g di acido borico, 3,75 g di EDTA).
      Nota: Per evitare la contaminazione del DNA, uso gel vassoi che non sono abituati a frazionare plasmide e PCR amplificato il DNA.
    2. Caricare i campioni su gel19.
    3. Aggiungere marcatori del DNA per il gel che sono nella gamma di dimensioni dei frammenti previsti. Caricare circa 1 µ g di marcatore (50-250 ng del frammento di dimensione diverse) sul gel per permettere la visualizzazione da luce UV.
    4. Dimensioni-frazionare il DNA a bassa tensione (40 – 50 V/500 mA) durante la notte.
  4. Preparare per il trasferimento del DNA dal gel dell'agarosi per la membrana di nylon.
    1. Trasferire il gel su un vassoio separato e macchiarlo per 20 – 25 min in 0,5 x TBE contenente etidio bromuro (5 µ g/mL) ruotando a 40 giri su agitatore orbitale.
    2. Visualizzare il gel su un transilluminatore UV. Verificare la separazione di dimensione del DNA genomic, inclusa la visibilità delle bande satellitare discreti (Figura 5A). Uno striscio verso dimensioni di peso molecolare inferiore indica la degradazione del DNA.
    3. Sul transilluminatore UV, ponga una trasparenza sopra il gel e segnare la posizione delle fessure e le bande dell'indicatore con un pennarello (figura 5B). Questo faciliterà nel caso in cui le sequenze di marcatore non ibridato specificamente con la sonda del DNA per determinare le dimensioni dei frammenti ibridizzati più tardi. Indicando i frammenti di marcatore a questo punto, è possibile monitorare la dimensione dei frammenti ibridazione.
    4. Inserire il gel nel vassoio, risciacquare con acqua deionizzata ultrapura e immergerlo in 0,25 M HCl per 15 min a frammentano il DNA all'interno del gel. Lavare con acqua deionizzata ultrapura. Utilizzare HCl e acqua sufficiente a coprire il gel nel vassoio e ruotare il vassoio con il gel sommerso a 40 giri su agitatore orbitale.
    5. Incubare il gel in tampone di denaturazione per 30 min. lavare con acqua deionizzata ultrapura. Utilizzare buffer e acqua sufficiente a coprire il gel nel vassoio e ruotare il vassoio con il gel sommerso a 40 giri su agitatore orbitale. (Tampone di denaturazione: 0,5 M NaOH, 1.5 M NaCl).
    6. Incubare il gel in tampone di neutralizzazione per 30 min. lavare con acqua deionizzata ultrapura. Utilizzare buffer e acqua sufficiente a coprire il gel nel vassoio, ruotare il vassoio con gel sommerso a 40 giri su agitatore orbitale. (Tampone di neutralizzazione: 0.5 M Tris, 1.5 M NaCl, 220 mM HCl, pH 7,6).
  5. Trasferire il DNA di una membrana di nylon.
    1. Preparare l'installazione per trasferimento capillare del DNA genomic. Posizionare un piatto di plastica (circa la dimensione del gel o più grande) sopra un vassoio riempito con soluzione fisiologica-sodio citrato (SSC): 20x. Piegare un pezzo di carta spessa di filtro sopra il vassoio, in modo che entrambe le estremità sono appesi in SSC. Tagliare un pezzo di membrana di nylon caricato positivamente Hybond N + gel di dimensioni medie e 2 pezzi di spessa carta da filtro. (20x SSC: 3 M NaCl, citrato di sodio 0,3 M).
    2. Preparare l'installazione macchiante (Figura 6) inserendo il gel, slot giù sulla parte superiore della carta da filtro sulla piastra di plastica. Adagiarvi una membrana Hybond n +, seguito da 2 strati di carta filtrante. Pre-bagnato ogni strato in 20 x SSC prima di aggiungerli all'Assemblea. Assicurarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria tra strati come questi ostacolano il trasferimento di DNA.
    3. Coprire l'assembly con uno spesso strato di carta velina. Posto una piastra di plastica con un peso, come una piccola bottiglia, sulla parte superiore. Assicurarsi che la pressione è equamente diviso sopra il gel. Questo assicurerà il corretto trasferimento del DNA.
      Nota: Il peso dovrebbe essere circa 200 – 300 g; i pesi pesanti ostacolano il trasferimento di DNA.
    4. Coprire l'area che circonda l'Assemblea, tra cui esposta carta da filtro, con la pellicola trasparente (Figura 6) per evitare l'evaporazione del 20 x SSC buffer e destinazione che capillare forze verso la membrana di nylon. Asciugare durante la notte.
    5. Segnare la posizione delle slot, il nome e/o la data in cima la membrana con la matita e rimuovere la membrana dall'assembly. Si noti che il lato di fondo che è stato a contatto con il gel, trasporta il DNA.
    6. Risolvere immediatamente il DNA alla membrana di irradiazione UV (2.400 µ j/m2) utilizzando un reticolante UV.
      Nota: Condizioni di reticolazione dipendono dal tipo di membrana utilizzata.
      Nota: A questo punto la membrana può essere conservata a-20 ° C e utilizzata per l'ibridazione con una sonda più tardi. Risciacquare la membrana reticolata in 2X SSC e guarnizione in esso pre-piegato la tubazione del polietilene saldabili prima di posizionarlo a-20 ° C.
  6. Preparare la sonda per l'ibridazione.
    1. Amplificare la sequenza da utilizzare come la sonda per DNA macchiarsi di PCR20. 50-100 ng di un frammento PCR 250 bp-2 kbp è usata come una sonda. Due sonde separate, una ibridazione della regione prossimale del bordo destro e l'altro nella regione prossimale del bordo sinistro del T-DNA, possono essere utilizzati per valutare la presenza del T-DNA intero (Figura 4A e Figura 7).
    2. Diluire 50-100 ng di prodotto di PCR a 24 µ l di acqua deionizzata ultrapura in una provetta.
    3. Denaturare il prodotto PCR diluito facendo bollire per 5 min in un bicchiere di acqua o termoblocco, poi raffreddare direttamente sul ghiaccio.
    4. Scongelare i premade GCT-mix sul ghiaccio. (GCT-mix: dGTP, dCTP, dTTP (tutti 0,5 mM), random esameri 43,2 ng / µ l, Acetylated BSA 1,33 mg/mL, 33 mM di β-mercaptoetanolo, 0,67 M Hepes, 0,17 mM Tris-HCl pH 6.8, 17 mM MgCl).
    5. Aggiungere 21 µ l del GCT-mix e 2 U di Klenow frammento il prodotto PCR.
    6. Aggiungere 2 µ l di [32P] ATP per il mix e incubare a 37 ° C per 1 h.
      Attenzione: Tutti i passaggi che coinvolgono [32P] ATP devono essere svolte in un ambiente designato per lavoro radioattivo durante l'utilizzo di una protezione adeguata.
      Nota: Assicurarsi che l'ATP [32P] è fresco (non più di 1 intervallo ha superato).
    7. Preparare un G-50 di Sephadex (grossolana o media) colonna21 per purificare il probe marcato da nucleotidi (radioattivi) prive di personalità giuridica. Prendere una siringa da 2 mL e coprire l'uscita con un piccolo cerchio di spessa carta da filtro. Aggiungere 2 mL di Sephadex G-50 disciolto in TE nella siringa e rimuovere tutto il liquido dalla colonna di filatura.
    8. Posizionare la colonna in un tubo di plastica da 15 mL, caricare il probe marcato sulla colonna e girare a temperatura ambiente (impostare la centrifuga a 750 x g, consentire il numero di giri aumentare fino a raggiungere 750 x g, quindi interrompere la centrifuga e permettere la rotazione a declinare a 0 x g) per eluire la sonda. Aggiungere 200 µ l di TE alla colonna e spin per eluire la sonda rimanente; Ripetere una volta. In queste condizioni, con etichettati frammenti di DNA sono esclusi dalla matrice Sephadex ed eluire, mentre nucleotidi liberi rimangono nella colonna.
    9. Utilizzare 300 µ l di sonda marcata per tubo di ibridazione. Tenere il restante probe marcato a-20 ° C per un successivo utilizzo. Tuttavia, tenere presente il tempo dell'ATP [32P].
  7. Ibridare la macchia di DNA.
    1. Calore 2 x SSC e tampone di ibridazione (15 mL per tubo di ibridazione, massimo di 2 macchie per tubo) a 65 ° C. (Tampone di ibridazione: solfato di destrano 10%, 1% SDS, NaCl di 1m, Tris 50 mM a pH 7.5, sciogliere a 65 ° C, mantenere le aliquote a-20 ° C).
    2. Pre-riscaldare il forno di ibridazione a 65 ° C.
    3. Posizionare la maglia di nylon in un vassoio con un po ' di riscaldata (65 ° C) 2 x SSC per coprire il vassoio. Mettere la macchia di DNA in cima la mesh, con il lato di DNA. Rotolare la macchia insieme la mesh e inserire il rotolo in un tubo di ibridazione. Versare il 2 in eccesso x SSC.
    4. In un tubo del microcentrifuge, bollire 150 µ l di DNA di sperma di salmone (concentrazione di 10 mg/mL) per tubo di ibridazione per 5 min (Vedi anche punto 4.6.3). Raffreddare immediatamente sul ghiaccio e aggiungere il tampone di ibridazione pre-riscaldata.
    5. Aggiungere la soluzione di ibridazione buffer-salmone sperma al tubo con la macchia. Pre-ibridare a 65 ° C per almeno 1 h in una ruota in movimento, a 12 giri/min.
    6. Quando il pre-incubazione nel passaggio 4.7.5. è quasi finito, bollire 300 µ l di sonda marcata per 5 min (Vedi anche punto 4.6.3) e aggiungere immediatamente la macchia dopo l'incubazione.
    7. Ibridare una notte nella ruota a 63 ° C, 12 giri/min. Non pipettare la sonda direttamente sulla macchia, ma nella soluzione di ibridazione buffer-salmone dello sperma.
  8. Lavare la macchia.
    1. Preriscaldare le soluzioni di lavaggio (1x SSPE, 0,1% SDS e 0.1 x SSPE, 0.1% SDS) a 65 ° C. (20 x SSPE: 3 M di NaCl, 230 mM NaH2PO4, 20 mM EDTA, pH 7.0).
    2. Eliminare la soluzione di ibridazione e aggiungere circa 100 – 150 mL di 1 x SSPE, soluzione di SDS 0,1% al tubo di ibridazione, tappare la provetta e ruotare a mano. Versare l'ibridazione e la soluzione nell'appropriato rifiuti radioattivi liquidi di lavaggio.
    3. Aggiungere circa 100 – 150 mL di 1 x SSPE, soluzione di SDS 0,1% al tubo, chiudere e incubare la provetta per 15 min a 63 ° C nella ruota, 12 giri/min. Scartare la soluzione di lavaggio in modo appropriato.
    4. Aggiungere circa 100 – 150 mL di 0.1 x SSPE, soluzione di SDS 0,1% al tubo di ibridazione, chiudere e ruotare il tubo per 5 min a 63 ° C, 12 giri/min. Scartare la soluzione di lavaggio in modo appropriato.
    5. Prendere la macchia fuori dal tubo e metterlo in un vassoio contenente 0,1 sufficiente preriscaldato x SSPE, 0,1% SDS e agitare per 3 minuti in un bagnomaria con agitazione a 65 ° C. Nel frattempo, risciacquare la mesh in un vassoio riempito con acqua.
    6. Togliere la macchia, posizionarlo tra pre-piegati in plastica (tubi in polietilene), accuratamente asciugare il liquido in eccesso e lasciare la macchia asciugare brevemente. Nota che il liquido si rovina phosphorimager schermo.
    7. Sigillare il blot in plastica sui tre lati. Rimuovere tutto il liquido in eccesso che circonda la macchia e chiudere il tubo di plastica sigillando il quarto lato. Tagliare l'eccedenza di plastica. Assicurarsi che la macchia sigillata non presenta perdite e che la plastica è asciutta all'esterno.
  9. Esporre lo schermo phosphorimager.
    1. Posto il blot sigillato in una cassetta phosphorimager, con lo schermo di phosphorimager rivolto verso il lato di DNA del blot. Chiudere la cassetta e lasciare per ± 2 – 4 giorni, a seconda della forza dell'etichettatura radioattivo e sensibilità del phosphorimager.
    2. Scansione sullo schermo di phosphorimager mediante un phosphorimager. Prendersi cura di esporre lo schermo il meno possibile alla luce prima della scansione. Salvare l'immagine. Annullare lo schermo dal segnale esponendolo alla luce.
  10. Analizzare la macchia.
    1. L'analisi dipende dalla strategia restrizione utilizzata nel passaggio 4.1. Quando si analizza il blot preparato secondo la strategia indicata nel passaggio 4.1.1.1 (Figura 4A), contare il numero dei frammenti rilevato. In questa strategia, il numero di frammenti ibridizzate si riferisce al numero di integrazioni T-DNA.
      1. Confrontare il numero dei frammenti rilevata con una sonda per la sinistra (figura 7B) e la parte destra (Figura 7) del T-DNA.
        Nota: Se un diverso numero di frammenti di ibridazione è rilevato, quindi entrambi i) più copie di T-DNA (sia in orientamento invertito o diretto) o ii) non completamente integrato T-DNAs sono presenti.
      2. Stimare le dimensioni dei frammenti ibridati sulla macchia basato sulle dimensioni delle bande dell'indicatore e confrontano le dimensioni dei frammenti ibridati con il frammento previsto le dimensioni calcolate sulla base della strategia di restrizione di inserimenti tandem (Figura 4A) per identificare la disposizione in tandem possibili di T-DNAs. Utilizzare la Figura 4A come una guida per calcolare le dimensioni dei frammenti previsti.
        Nota: Se la dimensione dei frammenti ibridate non sono d'accordo con quelli calcolati, quindi molto probabilmente uno delle integrazioni presenti non è completo.
    2. Quando si analizza il blot preparato secondo la strategia indicata nel passaggio 4.1.1.2 (Figura 4B), stimare la dimensione del frammento ibridazione sulla macchia in base alla dimensione delle bande dell'indicatore e confrontarlo con le dimensioni previste. Un inserimento intatto produce un singolo frammento con una lunghezza definita. Qualsiasi deviazione della durata prevista indica integrazione incompleta (Figura 7).
  11. Striscia la macchia per re-ibridazione (opzionale).
    Nota: La stessa macchia può essere ibridata consecutivamente con diverse sonde. Prima di continuare con una nuova sonda, striscia una sonda ibridizzata precedente dalla macchia.
    1. Per rimuovere la sonda dal blot, posizionare la macchia in un vassoio con il suo DNA-lato rivolto verso il basso. Versare un surplus di 0,5% SDS nel vassoio. Far bollire la membrana per 2 – 5 min. La durata del trattamento dipende dalla dimensione e contenuto di GC della sonda utilizzata. Più lunghe e più ricco GC sonde necessitano di un trattamento più lungo.
    2. Dopo la sverniciatura, ibridare il blot con un'altra sonda, o sigillare e conservare a-20 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utilizzando il sistema di BIBAC-GW, costruzioni del reporter per studiare ODM in piante erano generati10. Costrutti sono stati progettati nella voce Gateway vettoriale pENTR-gm12 e inseriti nel pBIBAC-BAR-GW (Figura 1) usando la reazione di ricombinazione LR Gateway.

Arabidopsis sono stati trasformati con pDM19, un plasmide BIBAC-BAR-GW con un reporter di mTurquoise-eYFP che trasportano un codone di arresto traslazionale nel telaio della lettura di eYFP alla posizione 120 (mTurquoise2-eYFP * 40) (Figura 2)10. In totale, 126 piante di Arabidopsis sono stati trasformati (9 piante per vaso, 14 pentole). Semi di queste piante sono stati riuniti, seminati su vassoi con terreno ed ha permesso di crescere per due settimane prima del trattamento con soluzione di glufosinato-ammonio. Solo le piantine che esprimono il gene bar (presente in BIBAC-BAR-GW) sopravvivono al trattamento glufosinato-ammonio (Figura 3). In totale, sono stati identificati 11 transgenetica trasformato con pDM19, corrispondenti ad un'efficienza di trasformazione dello 0,02% di semi analizzati.

Per le 11 transgenetica isolato, macchiare del DNA è stato usato per determinare il numero delle integrazioni T-DNA. A tale scopo, il DNA genomico è stato tagliato con BglII o Scaho (strategia come ideato su Figura 4A). Entrambi questi enzimi di restrizione tagliare solo una volta in sequenza del T-DNA (figura 7A). Ibridazione con sonde riconoscendo il bar e la eYFP regioni codificanti ha permesso la rilevazione del numero dei rispettivi frammenti di DNA.

Il numero di DNA singolo frammenti sulle macchie ammessi per stimare il numero di inserimenti di T-DNA nelle linee reporter (tabella 1). Singoli frammenti di ibridazione con la sonda sia il Bar e la eYFP hanno indicato la presenza di una sola integrazione di T-DNA. Dalla 11 transgenetica analizzati, sei trasportato singoli integrazioni. Il numero medio di integrazioni era 1.2.

Per 6 linee che trasportano una sola integrazione di T-DNA, l'integrità del costrutto inserito reporter è stato testato utilizzando DNA macchiare (strategia come ideato su Figura 4B). Il DNA genomico è stato tagliato con BglII e Pciho per rilasciare un frammento di 5,5 kb contenente il gene di fusione sia al Bar e mTurquoise-eYFP (figura 7A). Una sonda contro eYFP è stata usata per rilevare il frammento previsto. Tutte le piante testate ha trasportato un frammento intatto. Si noti che il frammento esaminato escludono la sinistra e il bordo di destra T-DNA e pertanto non esamina l'integrità del T-DNA intero, ma solo la parte contenente i transgeni di interesse.

L'espressione del gene reporter fluorescente è stata determinata in singola copia indipendente linee transgeniche differisce solo per la posizione del T-DNA genomica. Livelli della relativa trascrizione del CaMV 35S promoter-driven mTurquoise-eYFP reporter sono stati misurati da RT-qPCR in quattro linee di reporter DM19 portando integrazioni intatti, singola copia di cui la posizione genomica è stata determinata10. La variazione nei livelli di espressione di gene reporter tra le righe era minore: la massima differenza nei livelli del RNA mTurquoise-eYFP è stato 2 volte (Figura 8A).

Successivamente, l'ODM è stato effettuato in queste righe di reporter. Tre su quattro linee di reporter indipendente ha mostrato efficienze ODM piuttosto simile (Figura 8B). Tuttavia, una linea, DM19 [4] 1, ha prodotto un rendimento molto basso di ODM rispetto alle altre linee. Questi risultati indicano che l'ODM è influenzata dal contesto genomico locale. In che modo il contesto genomico locale dell'integrazione T-DNA in DM19 [4] 1 è diverso da quello nelle altre linee resta da essere identificati. Analisi di set di dati disponibili sui contrassegni di cromatina attivi e inattivi presso i siti di integrazione T-DNA genomici in piante non transgenici non hanno fornito una risposta10.

Figure 1
Figura 1: mappe funzionali dei vettori pBIBAC-GW. pBIBAC-GW derivati sono disponibili con una resistenza al glufosinato (bar) o DsRed fluorescenza in tegumenti (DsRed) come un marcatore di selezione nelle piante. Per entrambi i vettori, un gene di resistenza alla kanamicina è il marcatore di selezione nei batteri. Il Gateway ccdB cassetta è indicato tra le punte di freccia verde che rappresenta ricombinazione siti attR1 e attR2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: costruzione del reporter di mutagenesi. I geni reporter mTurquoise-eYFP sono guidati dal promotore CaMV 35S. La mTurquoise regione di codificazione è fusa ad un eYFP codifica regione che trasportano una mutazione di C-alla posizione del nucleotide 120, con conseguente un codone di stop prematuro traslazionale TAA e terminazione prematura della traduzione della proteina di fusione. La 3 ′ Nopaline Synthase (3' nos) segnale di poliadenilazione è usato per terminare la trascrizione del costrutto22. Segnale di localizzazione nucleare (NLS) viene utilizzato per indirizzare le proteine tradotte al nucleo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: vassoio pieno di piante di Arabidopsis prima e dopo trattamento di glufosinato-ammonio. Piantine non esprimono il gene di bar che è presente in T pBIBAC-BAR-GW-die DNA dopo essere stato spruzzato con soluzione di glufosinato-ammonio. Le foto mostrano il vassoio stesso delle piantine (A) prima di spruzzare con glufosinato-ammonio, 14 giorni dopo la semina e (B) 10 giorni più tardi, dopo essere stato spruzzato due volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: strategia di restrizione del DNA generale per identificare il numero e l'integrità dei inserito T-DNAs. (A), un sito di restrizione (R) nel mezzo del T-DNA consente di sondaggio indipendente di sinistra (rosso L) e parte destra del T-DNA (verde R). Le vignette sulla destra mostrano che a seconda del singolo - o multi - copia T-DNA integrazioni, diversi disegni a strisce sono ottenuti con DNA macchiare. Bande contrassegnati con un * hanno una lunghezza definita, mentre la lunghezza di altre band dipende il sito più vicino di restrizione del DNA genomico fiancheggianti. Singolo inserto: La L e la R sonda sia dare un frammento indipendente. La dimensione del frammento medio previsto può essere calcolata in base la frequenza del sito restrizione nel genoma. La dimensione minima è la distanza dal sito di restrizione per il bordo di sinistra (LB) o diritto di confine (RB), a seconda di quale fine dell'integrazione è essere sondato, e se il T-DNA è intatto. Ripetizione in tandem: Le sonde per L e R dare entrambi due frammenti; per ogni sonda uno dei frammenti include che fiancheggiano il DNA genomico, il secondo frammento ha una dimensione prevista e viene identificato da entrambe le sonde. Inverted repeat: A seconda della direzionalità della cassetta integrata, può essere identificato uno L e due frammenti di R, o due L e una R. Singoli inserimenti singoli: Il risultato è un numero di frammenti indipendenti, e il numero di frammenti corrisponde al numero di integrazioni. (B) limitazione siti alle estremità del T-DNA consentono di stabilire l'integrità del frammento tra i siti di restrizione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: un gel di agarosio con pattern di restrizione e la corrispondente trasparenza. (A) su gel di agarosio, DNA genomic digerito con EcoRvi viene mostrato. La corretta digestione del DNA è illustrata dalla presenza di bande di discreti satellitare. Marcatura (B) la posizione delle slot e bande dell'indicatore su una trasparenza rende possibile per poterli poi facilmente calcolare la dimensione di ibridando frammenti. Qui, vengono utilizzati marcatori MRC Holland (blu e rosso), indicato da M. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: installazione per macchiare capillare. In maniera capillare macchiare installazione, carta da filtro è collocato su una piastra di plastica con le estremità della carta appeso in 20 x SSC tampone. La carta è bagnata con 20 x SSC e un gel di agarosio posizionati sulla parte superiore, seguita da una membrana di nylon, carta da filtro e una pila di tessuti. Un peso leggero è posizionato sulla parte superiore. Cura per rimuovere le bolle d'aria tra il gel, la carta e la membrana. Pellicola trasparente viene utilizzato per evitare l'essiccamento fuori il programma di installazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: esempio di DNA macchiare la strategia ed il risultato sperimentale. (A) DNA macchiare la strategia per determinare il numero e l'integrità delle integrazioni T-DNA. Posizioni di taglio degli enzimi di restrizione selezionati all'interno del T-DNA sono indicate con barre verticali. Le sonde eYFP e bar utilizzate per l'ibridazione con il DNA di genomic digerito sono indicate utilizzando una linea con il punto terminale sotto il T-DNA. (B–D) DNA esempio macchie. Il DNA genomico è stato tagliato con Scaio e la macchia è stato sondato con un bar e la eYFP sonda (B e C). DNA genomico è stato tagliato con BglII e Pciio e sondato con una sonda di bar . Frammenti intatti sono 5,5 kbp in dimensione (D). Nota che il set di campioni in D è diverso da quelli indicati in B e C. * indica la dimensione del frammento previsto; M, marker. In B, C e D viene utilizzato lo stesso indicatore di dimensione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: i livelli di espressione di mTurquoise-eYFP e le efficienze ODM in linee di reporter indipendente mTurquoise-eYFP. Livelli della trascrizione relativa mTurquoise-eYFP (A) misurati mediante RT-qPCR in linee di DM19 reporter. Per la normalizzazione dei livelli della trascrizione di actina sono stati usati. (B) ODM efficienza misurata nelle linee DM19 reporter. Per A e B, barre indicano la media di almeno cinque replicati biologici. Barre di errore indicano SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tipo di locus T-DNA Nr di integrazioni T-DNA Linea di reporter Numero di frammenti rilevato Integrità
SCA Ho BGL II BGL II/PciI
bar eYFP bar eYFP eYFP
Integrazioni di singolo locus 1 19 [2] -2 1 1 1 1 +
1 19 [2] -5 1 1 1 1 +
1 19 [2] -9 1 1 1 1 +
1 19 [2] -11 1 1 1 1 +
1 19 [4] -1 1 1 1 1 +
1 19 [4] -2 1 1 1 1 +
Ripetere 2, invertito 19 [2] -10 2 1 1 1 +
2, integrazione incompleta 19 [2] -3 1 2 1 1 ND
Più integrazioni di locus 2 19 [2] -6 2 2 2 ND
2 19 [2] -7 2 2 2 2 ND
3/4 19 [2] -1 4 3 3 3 ND
ND – non determinato.

Tabella 1: Riepilogo del DNA macchiare dati per transgenetica isolato dopo la trasformazione con pDM19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Critica alla generazione transgenica con integrazioni singoli, intatti di un transgene è la scelta del vettore binario utilizzato. Vettori di famiglia BIBAC sono stati utilizzati per fornire sequenze di interesse a molti pianta specie23,24,25,26,27,28. Vettori di BIBAC, tra cui BIBAC-GW, resa singola copia integrazioni con alta efficienza: il numero medio di inserimenti per ogni riga è 1,5-2, rispetto a 3 o superiore per binario più comunemente usato file vettoriale5,9, 29. come un miglioramento importante rispetto ad altri vettori BIBAC, con i vettori di BIBAC-GW, le sequenze di interesse possono essere facilmente inserite utilizzando Gateway ricombinazione siti12. I vettori modificati superare i problemi generali di vettori BIBAC quando utilizzato nelle strategie di clonazione convenzionale: i) un numero molto limitato di siti di restrizione unici e ii) un DNA di basso rendimento. I siti di ricombinazione di Gateway rendono BIBAC-GW vettori un'alternativa attraente agli altri vettori binari per la generazione di piante transgeniche.

Qui una serie di protocolli, dalla generazione di BIBAC-GW derivati contenenti sequenze di interesse, per impianto di trasformazione e DNA blot analisi per numero e l'integrità delle sequenze transgeniche è descritta. Molti dei protocolli riferiti in questa carta, Gateway clonazione, elettroporazione dei batteri e trasformazione della pianta, sono una pratica comune in molti laboratori e può anche essere eseguito con lievi modifiche. È importante sapere che BIBAC-GW è un vettore di singola copia in e. coli e a. tumefaciens. Pertanto, quando l'isolamento del DNA, il rendimento è basso; si consiglia di scalare la procedura di isolamento.

In transgenetica portando più integrazioni di T-DNA, introdotti transgeni sono spesso sottoposti a1,2,4,30di silenziamento genico e dovrebbero quindi per la maggior parte delle applicazioni essere evitate. Per identificare piante transgeniche con integrazioni singoli, intatti, è consigliabile utilizzare l'analisi della macchia di DNA. Mentre i metodi diversi da DNA macchiare può essere utilizzato per determinare il numero di copia del T-DNA e integrità del T-DNA in linee transgeniche (analisi di segregazione, TAIL-PCR, PCR (qPCR) quantitativa e digital gocciolina PCR), anche se lavoro intensivo, DNA macchiare è spesso il metodo di scelta. Analisi di segregazione non è in grado di distinguere tra multiple e singole integrazioni T-DNA presso singoli loci. TAIL-PCR spesso sotto-stime la copia numero, soprattutto se più di una integrazione di T-DNA è presente31e qPCR necessita di ottimizzazione elaborati per risultati affidabili31,32. Droplet digitale PCR è un metodo piuttosto preciso per il rilevamento di numero di copia se l'attrezzatura necessaria è disponibile31. Il beneficio aggiunto di DNA blotting è facile rilevamento di troncato T-DNAs, che è mancata facilmente in tutte le tecniche basate sulla PCR.

Con analisi della macchia di DNA, i frammenti di ibridazione sulla macchia devono essere ben identificabili nel segnale e dimensione. Parecchi fattori sono conosciuti per influenzare l'esito del DNA macchiare. Oltre a una selezione appropriata di enzimi di restrizione (strategia indicato nella Figura 4) e gli indicatori di dimensione, DNA sufficiente di buona qualità è necessario. Meno di 2 µ g di genoma Arabidopsis DNA non produrrà frammenti ben identificabili. Quando si tratta di genomi più grandi, più DNA è richiesto. Per ottenere una quantità sufficiente di Arabidopsis DNA, possono essere utilizzati 1 - settimana-vecchi piantine o tessuti floreali. Un lotto di piantine coltivate su una piastra di Petri produce 2 – 8 µ g di DNA. Al fine di evitare la degradazione del DNA durante l'isolamento, si dovrebbe prestare attenzione per elaborare il materiale vegetale veloce. Inoltre, il DNA di genomic dovrebbe essere risospesi in Tris-EDTA per ridurre la degradazione dall'azione delle nucleasi e conservato a 4 ° C invece di-20 ° C per evitare di intaccare DNA causa di ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Se non siete sicuri che tutti i campioni di DNA vengono digeriti completamente, si consiglia di rehybridize della macchia di DNA con una sonda riconoscendo una regione genomica endogena, unica. Quando si seleziona sonda sequenze per identificare sequenze transgenici o endogeni, è fondamentale per selezionare solo sequenze uniche. Per essere in grado di determinare con precisione le dimensioni dei frammenti ibridati, le posizioni del DNA gel slot e fasce di marcatore del DNA devono essere contrassegnate su una trasparenza (figura 5B) quando visualizzare un gel di bromuro di etidio-macchiato (Figura 5A) su un UV Transilluminatore. Nel caso in cui le sequenze di marcatore non ibridato con la sonda di DNA, o l'ibridazione è parziale, è l'unico modo per rintracciare la dimensione dei frammenti di ibridazione.

Una volta che la cura è presa per ottenere il segnale di ibridazione buona e stima della dimensione del frammento, l'interpretazione dei risultati macchianti è semplice. Quando usando un solo enzima di restrizione e ibridando con diverse sonde di rilevazione sia la parte sinistra o destra del T-DNA, il numero di frammenti rilevati riflette il numero di inserimenti di T-DNA. Per esempio, figura 7B, C Mostra la stessa macchia di DNA, ibridato con diverse sonde, bar (figura 7B) e la proteina fluorescente gialla avanzata (eYFP) (Figura 7), utilizzando la strategia illustrata in figura 7A. Tutte le corsie, tranne 4, Visualizza un numero uguale di frammenti entrambi macchie: due frammenti per la linea 6 e un singolo frammento per tutte le altre linee. Questo numero di frammenti rilevati è il numero di inserimenti di T-DNA.

Quando il numero di frammenti rilevati con sonde vincolante sia sinistra o destra parte del T-DNA differisce (per quanto riguarda a figura 7BC, linea 4), o inserimenti incompleti sono presenti, o la T-DNAs sono inseriti nella disposizione in tandem. Gli inserimenti di tandem visualizzare la lunghezza del frammento non casuale per uno dei frammenti di T-DNA (Figura 4A, pannello di destra) e possono essere identificati confrontando la dimensione del frammento ibridati con ciò che è previsto sulla base della strategia di restrizione. Una strategia macchiante supplementare è necessario per confermare la disposizione in tandem delle inserzioni T-DNA. Nell'esempio illustrato sulla linea 4 (figura 7B, C), due inserimenti sono disposti in un orientamento invertito di ripetere.

Quando si valuta l'integrità di un T-DNA, o parte di esso, la lunghezza del frammento ibridazione può essere calcolata sulla base la strategia di restrizione. Qualsiasi deviazione dalla dimensione prevista indica la presenza di un inserimento incompleto. Per esempio, in Figura 7, corsia 4, un frammento di ibridazione migra alle 8 kbp, (anziché il previsto kbp 5,5) che indica una dimensione del frammento maggiore a causa della mancanza di uno dei siti di restrizione.

BIBAC-GW vettori sono ottimi strumenti per la generazione di singola copia intatte integrazioni in un certo numero di specie di piante. Il protocollo segnalato qui fornisce una procedura affidabile per identificare piante con integrazioni singoli, intatti di un transgene di interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questa ricerca è sostenuta dall'olandese Technology Foundation STW (12385), che fa parte dell'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), e che è in parte finanziato dal Ministero degli affari economici (OTP Grant 12385 a MS).  Ringraziamo Carol M. Hamilton (Cornell University, Stati Uniti) per la fornitura di pCH20, la spina dorsale dei vettori BIBAC-GW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulphate monohydrate Duchefa K0126
Gentamycin sulphate Duchefa G0124
Rifampicin Duchefa R0146
Tetracycline hydrochloride Sigma T-3383
DB3.1 competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 11782-018 One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead  
DH10B competent cells Thermo Scientific - Invitrogen 18290-015
Gateway LR clonase enzyme mix  Thermo Scientific - Invitrogen 11791-019
tri-Sodium citrate dihydrate Merck 106432
Trizma base Sigma-Aldrich T1503
EDTA disodium dihydrate Duchefa E0511
Proteinase K Thermo Scientific  EO0491
Bacto tryptone BD 211705
Yeast extract BD 212750
Sodium chloride Honeywell Fluka 13423
Potassium chloride Merck 104936
D(+)-Glucose monohydrate Merck 108346
Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap Biorad 1652089
Electroporator Gene Pulser BioRad
Magnesium sulfate heptahydrate Calbiochem 442613
D(+)-Maltose monohydrate 90% Acros Organics 32991
Sucrose Sigma-Aldrich 84100
Silwet L-77 Fisher Scientific NC0138454
Murashige Skoog medium Duchefa M0221
Agar BD 214010
Glufosinate-ammonium (Basta) Bayer 79391781
Restriction enzymes NEB
Ethidium Bromide Bio-Rad 1610433
Electrophoresis system Bio-Rad
Sodium hydroxide Merck 106498
Hydrochloric acid Merck 100316
Blotting nylon membrane Hybond N+ Sigma Aldrich 15358 or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)
Whatman 3MM Chr blotting paper GE Healthcare Life Sciences 3030-931
dNTP Thermo Fisher R0181
Acetylated BSA Sigma-Aldrich B2518
HEPES Sigma-Aldrich H4034
2-Mercaptoethanol Merck 805740
Sephadex G-50 Coarse GE Healthcare Life Sciences 17004401 or Sephadex G-50 Medium (17004301)
Dextran sulfate sodium salt Sigma-Aldrich D8906
Sodium Dodecyl Sulfate  US Biological S5010
Salmon Sperm DNA Sigma-Aldrich D7656
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Storage Phosphor screen and casette GE Healthcare Life Sciences 28-9564-74
Phosphor imager GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000
UV Crosslinker Stratagene Stratalinker 1800
cling film (Saran wrap) Omnilabo 1090681
Agarose Thermo Scientific - Invitrogen 16500
Boric acid Merck 100165
DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. MRC Holland MCT8070
DNA marker ‘Rood’; DNA ladder MRC Holland MCT8080
Hexanucleotide Mix Roche 11277081001
Large-Construct Kit Qiagen 12462
Heat-sealable polyethylene tubing, clear various providers the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane
Heat sealer
Membrane filter disk Merck VSWP02500
Magnesium chloride Merck 105833
Hybridization mesh GE Healthcare Life Sciences RPN2519

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
  2. Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
  3. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  4. Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
  5. Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
  6. Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
  7. Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
  8. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
  9. Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
  10. Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
  11. Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
  12. Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
  13. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  14. Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
  15. Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
  16. Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
  17. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
  18. Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
  19. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
  21. Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
  22. Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
  23. Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
  24. Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
  25. Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
  26. Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
  27. Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
  28. Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
  29. Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
  30. Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
  31. Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
  32. Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).

Tags

Genetica problema 133 vettore binario BIBAC Gateway compatibile vettore binario impianto di trasformazione integrazione unico silenziamento genico DNA macchiare macchiare del sud
Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain,… More

Tark-Dame, M., Weber, B., de Sain, M., Anggoro, D. T., Bader, R., Walmsley, A., Oka, R., Stam, M. Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector. J. Vis. Exp. (133), e57295, doi:10.3791/57295 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter