Summary
使用 pBIBAC 的二进制向量, 可以生成具有完整单拷贝插入的转基因植物, 这是一个简单的过程。在这里, 提出了一系列的协议, 指导读者通过生成转基因拟南芥植物的过程, 并测试植物的完整性和复制数量的插入。
Abstract
在生成转基因植物时, 一般的目的是要有稳定的转基因表达。这需要一个单一的, 完整的整合的转基因, 因为多拷贝集成往往受到基因沉默。与其他 pBIBAC 衍生物一样, 基于细菌人工染色体 (pBIBAC) 的网关兼容二进制向量允许单拷贝转基因的高效插入。作为对原 pBIBAC 的改进, 一个网关盒已被克隆成 pBIBAC, 因此, 现在的兴趣序列可以很容易地纳入矢量转移 dna (T DNA) 的网关克隆。通常情况下, 与 pBIBAC 的转换结果是0.2–0.5% 的效率, 即转基因的一半携带完整的单拷贝集成的 T DNA。pBIBAC 的载体是可利用的抗膦铵或 DsRed 荧光的种子大衣, 以选择在植物, 和抗卡那霉素作为选择的细菌。在这里, 提出了一系列的协议, 引导读者通过使用 pBIBAC 生成转基因植物的过程: 从将兴趣序列重新结合到 pBIBAC 的选择向量, 到植物转化与农杆菌, 选择转基因, 并测试植物的完整性和复制数量的插入使用 DNA 印迹。注意设计一种 DNA 印迹策略, 以识别单个和多个位点的单拷贝和多复制集成。
Introduction
在生成转基因植物时, 通常的目的是使综合转基因 (s) 稳定表达。这可以通过转基因的完整的单拷贝集成来实现。多重整合可以导致基因表达的增加, 同时也会使转基因沉默。如果插入的序列排列在串联或反转重复的1、2、3、4中,则更有可能转基因沉默。在农杆菌介导的转化实验中, 二进制向量被用作航天飞机, 将感兴趣的序列传递到植物基因组中。集成到植物基因组的数量依赖于农杆菌5、6中二进制向量的拷贝号.许多常用的二进制向量都是高拷贝向量, 因此产生高平均的转基因拷贝数:拟南芥5中的3.3 到4.9 个拷贝。
通过使用.BIBAC 中具有低拷贝数的二进制向量 (如7) 或从a. 农杆菌染色体5启动 t dna, 可以降低 t dna 积分的数量。在这种情况下, 转基因集成的平均数量低于 25,8,9,10。由于在A. 农杆菌和大肠杆菌中都是单拷贝, BIBAC 衍生物可以维护和交付 150 kb11大的构造。
与 GW 兼容的 BIBAC 矢量10,12允许使用网关克隆轻松地将感兴趣的基因引入到向量中。网关技术的使用大大简化了克隆过程, 也克服了与大型低拷贝数向量13、14相关的常见问题, 如低 DNA 产量和有限的独特限制选择。可用于克隆7、11的站点。在植物 (图 1)10,12中, pBIBAC 的衍生物可在种子大衣 (pBIBAC-RFP) 中对膦铵 (pBIBAC 棒) 或 DsRed 荧光进行抗性。对于这两种载体, 卡那霉素抗性基因被用作细菌的选择标记。
pBIBAC 的向量结合: (1) 易于设计和遗传操作在大肠杆菌和 (2) 完整的单拷贝集成在 planta高效率。在拟南芥中, pBIBAC 的向量平均1.7 积分, 其中大约一半的转基因植株携带着单个集成的 T 型 DNA10。
转基因的稳定表达是大多数转基因产生的必要条件。稳定的转基因表达可以通过完整的单拷贝集成实现。然而, 与转基因植物进行完整的, 单拷贝集成是更重要的, 如果例如, 目的是研究的效率, 染色质的过程, 如诱变, 重组, 或修复, 并依赖这些在插入部位的基因组位置和染色质结构的过程。为了我们的兴趣, 研究寡核苷酸定向诱变 (ODM) 对局部基因组上下文的依赖性, 生成了一组完整的、单拷贝的突变报告基因集成的报告 (图 2)10。使用这组线, 结果表明, 在不同基因组位置集成的转基因基因座的 ODM 效率不同, 尽管转基因表达水平相当相似。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 将感兴趣的序列插入二进制向量中
-
准备网关条目和二进制向量。
- 根据供应商的建议, 将包含 DNA 片段或感兴趣基因的网关入口向量隔离。
注: BIBAC-GW 载体需要使用卡那霉素 (公里) 来选择细菌, 因此, 使用一个输入向量与另一种抵抗标记而不是卡那霉素。例如, 携带庆大霉素抗性基因的 pENTR 转基因载体是一个很好的选择12。 - 传播和隔离 BIBAC 的兴趣向量。使用对在网关盒中存在的ccdB基因的毒性具有抗药性的大肠杆菌菌株。根据供应商的建议, 使用专门为大型质粒设计的协议或套件隔离 BIBAC 矢量。
- 根据供应商的建议, 将包含 DNA 片段或感兴趣基因的网关入口向量隔离。
-
进行网关反应。
- 根据供应商的建议, 准备 LR 重组反应。在室温下 (RT) 将以下组件混合在1.5 毫升离心管中: 100–300的进入克隆 (超螺旋), 300 的 BIBAC-GW 向量, LR Clonase 反应缓冲器 (最终浓度: 1x)。将混合物的体积调整到16µL (10 毫米三, EDTA 1 毫米, pH 8.0)。最后, 添加4µL 的 LR Clonase 酶混合, 并混合涡流。将混合物在25摄氏度孵育1小时。
- 在步骤1.2.1 中加入2µL 蛋白酶 K 溶液 (2 µg/µL), 终止 LR 反应。混合和孵化在37°c 10 分钟。
-
用电穿孔法将大肠杆菌转化为网关反应混合物。
- 在电穿孔前淡化 LR 反应混合物。
注意: 这一步对成功的电穿孔至关重要。在透析方法下面描述, 但其他方法例如沉淀与乙酸钠和乙醇也可以使用。- 为 LR 反应的滤过透析准备设置。将20毫升超纯去离子水倒入无菌培养皿中。将膜过滤盘 (孔径 = 0.025 µm) 放在水面上。
- 把整个 LR 反应小心地放在膜的顶端, 让混合物在 RT 中透析1小时。
- 在电穿孔试管 (0.1 厘米) 中添加5µL 的淡化 LR 混合到电子主管 DH10B 细胞。Electroporate 细胞 (1.5 伏/厘米, 电阻200Ω, 电容25µF), 并立即添加1毫升预预热的超级最佳阻遏压制 (SOC) 培养基到细胞, 其次是孵化在37°c 45 分钟, 180 rpm。(SOC 培养基, 1 升:20 克 Bacto 胰蛋白胨, 5 克酵母提取物, 0.5 克氯化钠, 2.5 毫升1M 氯化钾, 20 毫升的1米过滤-灭菌葡萄糖)。
注: DH10B 细胞可替代其他稳定维持大粒质的大肠杆菌细胞。
注: 最佳电穿孔条件取决于所使用的电穿孔装置。 - 颗粒细菌以最大速度在三十年代使用离心, 去除过剩的 SOC, 并且并用重悬颗粒在大约50-100 µL Luria Bertani (磅) 媒介。将细菌传播到卡那霉素磅 (公里磅) 板上 (公里浓度, 40 µg/毫升), 并在37摄氏度一夜之间孵化盘子。(LB 中, 1 升:10 克 Bacto 胰蛋白胨, 5 克酵母萃取物, 10 克氯化钠。固体培养基添加琼脂, 15 克/升)。
- 在电穿孔前淡化 LR 反应混合物。
-
鉴定重组 BIBAC-GW 衍生物, 分离质粒 DNA。
- 为了能够在千米磅的板块上生长,大肠杆菌细胞应包含重组 BIBAC-GW 质粒, 其中ccdB序列被所需的插入物取代。使用菌落聚合酶链反应 (PCR)15检查板上的细菌菌落是否含有正确的质粒, 具有 BIBAC 的主干和插入的兴趣。
- 要识别 pBIBAC-GW 骨干, 请执行 PCR15反应与引物 DM1969 5 '-GCGACGAGCCAGGGATAG-3 ' 和 DM1970 5 '-ATCAGTGCGCAAGACGTGAC-3 '。本底漆集放大了bar基因的 563 bp 片段。
- 要检查 BIBAC 的存在, 请执行 PCR15反应, 使用底漆 M737 5 '-CGTGTAAAAAGCTTAGACTG-3 ' 和 M892 5 '-AACAGATGGTGGCGTCCC-3 '。该底漆组合放大了一个 791 bp 片段重叠的 cruciferin 助剂和rfp序列。
- 使用特定于基因的引物进行 PCR15反应, 检查是否存在插入的兴趣。
- 在含有卡那霉素 (40 µg/毫升) 的 LB 培养基中接种一个阳性菌落, 用于 DNA 隔离16. 2–5毫升。在180转一夜的轨道振动筛上孵育37摄氏度。
- 分离质粒 DNA (见步骤 1.1.2)。
- 为了能够在千米磅的板块上生长,大肠杆菌细胞应包含重组 BIBAC-GW 质粒, 其中ccdB序列被所需的插入物取代。使用菌落聚合酶链反应 (PCR)15检查板上的细菌菌落是否含有正确的质粒, 具有 BIBAC 的主干和插入的兴趣。
2. 制备A. 农杆菌用于对拟南芥进行花浸
-
将 BIBAC-GW 衍生物转换为. 农杆菌。
- 制备A. 农杆菌应变 C58C1 的电子主管细胞, 携带 pCH32 辅助质粒7。在四环素 (5 µg/毫升) 和利福平 (100 µg/毫升) 的存在下生长细菌, 以选择 pCH32, 并确保只生长农杆菌细胞。
- 添加0.25–0.5 µg DNA 的 pBIBAC-GW 衍生物, 预溶解在10–20µL 不育超纯去离子水, 20 µL 合格的农杆菌细胞电穿孔小试管 (0.1 厘米)。把细胞放在冰上。
- Electroporate 细胞 (1.5 伏/厘米, 电阻400Ω, 电容25µF)。电穿孔后立即加入1毫升预热 (28 °c) SOC 培养基到细菌和孵化细胞在28°c 为60–90分钟。
- 在含有利福平 (100 µg/毫升)、四环素 (5 µg/毫升) 和卡那霉素 (40 µg/毫升) 的单独 LB 板上传播100µL 和其余的细菌, 并在黑暗中孵育28天。
-
准备农杆菌挂起。
- 在步骤2.1.4 中准备的板块中, 通过 PCR 方法检查一对a. 农杆菌菌落, 以了解正确的向量 (参见步骤 1.4.1)。
- 条纹一个单一的殖民地确认包含的二进制向量与适当的插入一个 LB 板含有抗生素 (见步骤 2.1.4)。在28摄氏度的一夜之间生长。
- 重复在步骤2.2.2 中获得的单一菌落的裸奔。
- 在2.5 毫升的 LC 培养基中接种单一菌落, 辅以抗生素 (见步骤 2.1.4) preculture。孵育在28°c 至少8小时或隔夜, 在180转每分钟。(LC 培养基, 1 升:10 克 Bacto 胰蛋白胨, 5 克酵母提取物, 0.5 克氯化钠, 2.5 克 MgSO 4 · 7H 2 O, 2 克麦芽糖).
- 从步骤2.2.4 添加 preculture。对250毫升 LC 补充抗生素 (见步骤 2.1.4) 和增长28摄氏度, 在 180 rpm, 一夜之间。
- 在 5500 x g 处旋转12分钟, 将该颗粒重新悬浮在100毫升溶液中, 其中含有5% 蔗糖、0.05% Silwet L-77、0.5x MS. 将悬浮液倒入无菌容器中, 用于植物的花浸。
3. 拟南芥转化
-
准备用于转换的拟南芥植物。
- 在温室或气候控制的生长室中种植拟南芥植物, 直到它们开花 (每浸12盆9株)。
- 夹住第一个螺栓, 以允许更多的二次螺栓出现。植物准备浸泡第4-6 天后修剪, 当植物有许多未成熟的花头, 而不是许多受精角果。
-
花浸
- 在步骤2.2.6 中制备的农杆菌悬浮液中5–10的浸出花序。使用温和的鼓动。
- 将植物的上述部位包裹在保鲜膜中, 以保持湿度高, 并用盒子盖住花盆, 使植物在黑暗中保持。在温室/生长室中孵化植物2天。
- 取出盒和保鲜膜, 在温室/生长室中种植植株成熟。
注: 为了提高转化效率, 同一株植物可以在第一次浸渍后7天重新浸渍。 - 收割种子。池和分析植物的种子 (T1), 转化为相同的结构, 作为一个单一的集合。
-
用于转基因植物的筛网。
- 用荧光显微镜对 pBIBAC 的转基因植物进行筛选, 分析其种子。为了检测 DsRed 在种子大衣中的表达, 图像的种子在 560 nm 的激发和600–650纳米的排放。用镊子将荧光种子与非荧光的对应物分开。
- 要筛选与 pBIBAC 的转基因植物, 在填充土壤的托盘中播种种子 (~ 2500 种子/0.1 米2)。为了确保均匀地在托盘上传播种子, 在 0.5x Murashige Skoog 培养基 (MS) 中悬浮种子, 用1毫升吸管将种子传播。
注: 为了刺激种子以同步方式发芽, 种子孵化至少2天, 在4摄氏度。这可以在播种种子之前或之后完成。- 在托盘中播种后, 用0.5% 膦铵溶液喷洒2周3周的幼苗。每1米2使用500毫升的膦铵溶液。
- 将幸存的幼苗转移到各个花盆。在图 3中显示了在 (第二) 膦-铵处理前后有幼苗的托盘的典型图像。
- 用 PCR 方法分析膦铵耐氨植物的结构 (见步骤 1.4.1. 用于底漆)。
- 使用爱德华兹et . 描述的方法分离基因组植物 DNA 进行 PCR。17
4. 转基因对 T 型 DNA 积分的数量和完整性的表征
- 限制消解策略
注: 使用限制酶测定 dna 印迹, 确定 T dna 积分的数量及其完整性。这种方法允许在基因组的相同或不同的基因座上识别单个的, 也可以重复的集成。- 使用一系列限制消解来确定可能的不同集成模式:
- 选择在 T DNA 中间切割一次的酶, 以便能够独立地探测限制站点上游和下游的序列 (图 4A和图 7 a-c)。请参见图 4A和预期结果和解释的图形图例。
- 选择一种酶或酶组合, 一次切割出整个兴趣序列 (图 4B和图 7A-d)。从已知长度的任何偏差表示集成磁带的截断。
注意: 要注意只使用对胞嘧啶甲基化不敏感的限制酶。
- 使用一系列限制消解来确定可能的不同集成模式:
- 准备基因组 DNA 样本。
- 将基因组 DNA 从携带有兴趣结构的植物中分离出来。CTAB dna miniprep 方法可用于 dna 隔离18。对于拟南芥dna 的 dna 印迹分析, 需要2–2.5 µg 基因组 dna。在50µL 中溶解 DNA。
- 通过凝胶电泳检查 DNA 完整性16。完整的基因组 DNA 作为一个离散带在凝胶的顶端迁移。DNA 降解可以被识别为存在涂片。为了避免重复冻融造成的 dna 损伤, 基因组 DNA 样本保持在4摄氏度。
- 利用酶供应商建议的缓冲条件, 在一夜之间以50µL 的总容积 (2–2.5 µg) 消化基因组 dna (如拟南芥基因组 dna)。
- 在试管中, 混合2–2.5 µg 的拟南芥基因组 DNA, 5 µL 10x 限制缓冲器, 5 U 限制酶在总共50µL 超纯去离子水。
- 将负载染料 (1x 最终浓度) 添加到限制样品上, 然后再在凝胶上加载。要进行良好的视觉跟踪, 请使用下列方法之一: comigrating 与小片段 (溴酚蓝色、350–400 bp) 或 comigrating 与更大的片断 (Cylene 蓝, 3–4 kbp)。
- 运行 DNA 凝胶。
- 准备长 (20 厘米) 0.5x 琼脂糖凝胶19。凝胶中琼脂糖的百分比取决于所需的碎片大小。0.8–1% 最佳地将碎片 > 1 kb 的大小分开。使用1–1.5% 琼脂糖的片段 < 1 kb。不要在凝胶中加入溴溴化物。(5x, 1 升: Trizma 基54克, 硼酸27.5 克, EDTA 3.75 克)。
注: 为了防止 dna 污染, 使用不用于分级质粒和 PCR 扩增 dna 的凝胶托盘。 - 在凝胶19上加载示例。
- 将 DNA 标记添加到所需碎片大小范围内的凝胶中。在凝胶上加载大约1µg (50-250 ng 不同大小的碎片), 以允许紫外线照射。
- 大小-分级的 DNA 在一个低电压 (40–50 V/500 mA) 过夜。
- 准备长 (20 厘米) 0.5x 琼脂糖凝胶19。凝胶中琼脂糖的百分比取决于所需的碎片大小。0.8–1% 最佳地将碎片 > 1 kb 的大小分开。使用1–1.5% 琼脂糖的片段 < 1 kb。不要在凝胶中加入溴溴化物。(5x, 1 升: Trizma 基54克, 硼酸27.5 克, EDTA 3.75 克)。
- 准备从琼脂糖凝胶到尼龙膜的 DNA 转移。
- 将凝胶转移到一个单独的托盘, 并在0.5x 的溴溴 (5 µg/毫升), 通过旋转在一个轨道振动筛 40 rpm 的20–25分钟染色。
- 在 UV transilluminator 上可视化凝胶。验证基因组 DNA 的大小分离, 包括离散卫星波段的可见性 (图 5A)。对低分子量大小的涂片表明 DNA 降解。
- 在 UV transilluminator 上, 在凝胶上放置透明, 并用标记笔 (图 5B) 标记插槽和标记带的位置。这将有助于确定杂交片段的大小以后, 如果标记序列不杂交专门与探针 DNA。通过在此步骤中指示标记片段, 可以跟踪杂交片段的大小。
- 将凝胶放回托盘中, 用超纯去离子水冲洗, 并将其浸入0.25 米 HCl 中以15分钟 fragmentize 在凝胶内的 DNA。用超纯去离子水冲洗。使用足够的 HCl 和水覆盖在托盘中的凝胶, 并旋转托盘与浸没凝胶在 40 rpm 的轨道振动筛。
- 在变性缓冲器中孵育凝胶30分钟, 用超纯去离子水冲洗。使用足够的缓冲和水来覆盖在托盘中的凝胶, 并旋转托盘与浸没凝胶在 40 rpm 的轨道振动筛。(变性缓冲器: 0.5 米氢氧化钠, 1.5 米氯化钠)。
- 将凝胶在中和缓冲器中孵育30分钟, 用超纯去离子水冲洗。使用足够的缓冲和水来覆盖在托盘中的凝胶, 旋转托盘与浸没凝胶在 40 rpm 的轨道振动筛。(中和缓冲: 0.5 米三, 1.5 米氯化钠, 220 毫米 HCl, pH 值 7.6)。
- 将 DNA 转移到尼龙膜上。
- 准备基因组 DNA 毛细转移的设置。将塑料板 (大约是凝胶的大小或更大的) 放在装有20x 盐水钠 (SSC) 的托盘上。在托盘上折叠一张厚的滤纸, 使其两端都挂在 SSC 中。切下一个凝胶尺寸为正电荷的尼龙膜 Hybond N +, 2 块厚的滤纸。(20x SSC: 3 米氯化钠, 0.3 米柠檬酸钠)。
- 通过将胶凝剂、插槽放在塑料板上的滤纸顶部, 准备印迹设置 (图 6)。将 Hybond N + 膜放在上面, 接着是2层滤纸。在将其添加到组件之前, 在 20x SSC 中预湿每一层。确保删除层间的任何气泡, 因为这会阻碍 DNA 的转移。
- 用一层厚的纸巾盖住组件。在上面放一个有重量的塑料盘子, 比如一个小瓶子。确保压力在凝胶上同样有分歧。这将确保 DNA 的正确转移。
注: 重量应约 200–300xg g;重的重量会阻碍 DNA 的转移。 - 用保鲜膜 (图 6) 覆盖组件周围的区域, 包括暴露的过滤纸, 以避免 20x SSC 缓冲器的蒸发, 并将毛细管力对准尼龙膜。污点过夜。
- 用铅笔将插槽、名称和/或日期的位置标记在膜上, 然后从组件中取出膜。请注意, 在与凝胶接触的底部, 携带 DNA。
- 使用 uv 交联剂立即将 DNA 固定到膜上, 紫外线照射 (2400 µJ/米2)。
注: 交联条件取决于所用膜的类型。
注: 在这一点上, 膜可以储存在-20 摄氏度, 并用于杂交与探针后。在 2x SSC 中冲洗交联膜, 并将其密封在预折叠的热密封聚乙烯管材上, 然后放入-20 摄氏度。
- 准备杂交探针。
- 放大序列, 用作探针的 DNA 印迹 PCR20。50-100 ng 250 bp-2 kbp PCR 片段用作探针。两个单独的探针, 一个杂交到右边界近端区域, 另一个与 t dna 的左边界近区, 可用于评估整个 t dna 的存在 (图 4A和图 7)。
- 在试管中, 在24µL 超纯去离子水中稀释50-100 的 PCR 产物。
- 变性稀释后的 PCR 产物, 在水或热块的烧杯中煮沸5分钟, 然后直接在冰上冷却。
- 解冻预制 GCT-混合在冰上。(GCT 混合: dGTP, dCTP, dTTP (全部0.5 毫米), 随机 hexamers 43.2 ng/µL, 乙酰 BSA 1.33 毫克/毫升, 33 毫米β巯基乙醇, 0.67 米 Hepes, 0.17 毫米三 pH 6.8, 17 毫米氯化镁)。
- 添加21µL 的 GCT 混合和 2 U 克莱诺片段的 PCR 产品。
- 将 [32P] ATP 的2µL 添加到混合中, 并在37°c 处孵育1小时。
警告: 涉及 [32P] ATP 的所有步骤都需要在使用适当保护的情况下指定的放射性工作环境中进行。
注意: 确保 [32P] ATP 是新鲜的 (超过1的半时间已过)。 - 准备一个葡 G-50 (粗或中) 列21 , 用于从未注册的 (放射性) 核苷酸中纯化标记探针。取2毫升注射器, 用一小圈厚的滤纸盖住出口。加入2毫升的葡 G-50 溶解在 TE 进入注射器, 并清除所有的液体从该柱旋转。
- 把柱子放进15毫升的塑料管里, 在柱上装上标记探针, 在室温下旋转 (将离心机设置为 750 x g, 允许 rpm 增加到 750 x g 达到, 然后停止离心机并允许旋转下降到 0 x g) 洗脱探头。在柱上加200µL, 旋转洗脱剩余探头;重复一次。在这些条件下, 标记的 DNA 片段被排除在葡矩阵和洗脱, 而游离核苷酸留在柱中。
- 使用300µL 的标记探针每杂交管。将剩余标记的探头保持在-20 摄氏度, 以供以后使用。但是, 请记住 [32P] ATP 的半时间。
- 杂交 DNA 印迹。
- 热 2x SSC 和杂交缓冲 (每杂交管15毫升, 最大2个污点每管) 到65°c。(杂交缓冲: 10% 葡聚糖硫酸盐, 1% SDS, 1 米氯化钠, 50 毫米三 pH 7.5, 溶解在65°c, 保持整除数在-20 °c)。
- 预热的杂交烤箱到65摄氏度。
- 将尼龙网放在托盘上, 用少许加热 (65 °c) 2x SSC 覆盖托盘。将 dna 印迹放在网格的顶端, dna 端起来。将印迹与网格一起滚动, 并将该卷插入到杂交管中。倒入多余的 2x SSC。
- 在离心管中, 每杂交管煮沸150µL 的鲑鱼精子 DNA (浓度10毫克/毫升) 5 分钟 (请参见步骤 4.6.3)。冰上立即冷却, 加入预加热的杂交缓冲。
- 加入杂交缓冲-鲑鱼精子溶液的管与印迹。前杂交在65°c 至少1小时在一个转动的轮子, 在12转每分钟。
- 当预孵化阶段4.7.5。几乎完成, 煮沸300µL 的标记探针5分钟 (参见步 4.6.3) 并且立刻增加对污点在孵化以后。
- 杂交隔夜在转动的轮子在63°c, 12 转每分钟。不要直接用吸管把探针上的印迹, 而是进入杂交缓冲-鲑鱼精子溶液。
- 洗净污点。
- 预热洗涤液 (1x SSPE, 0.1% sds 和 0.1x SSPE, 0.1% SDS) 到65°c。(20x SSPE: 3 米氯化钠, 230 毫米 NaH2PO4, 20 毫米 EDTA, pH 7.0)。
- 处理杂交溶液, 并添加约100–150毫升的 1x SSPE, 0.1% SDS 溶液的杂交管, 关闭管, 并轮流旋转。在适当的液体放射性废料中倒入杂交和洗涤液。
- 添加约100–150毫升 1x SSPE, 0.1% SDS 溶液的管, 关闭, 并孵化管15分钟63°c 在旋转轮, 12 rpm。适当丢弃洗涤液。
- 添加约100–150毫升 0.1x SSPE, 0.1% SDS 溶液的杂交管, 关闭, 并旋转管5分钟63摄氏度, 12 rpm。适当丢弃洗涤液。
- 把污点从管中取出, 放在装有足够预热的 0.1x SSPE、0.1% SDS 的托盘中, 在65摄氏度的震动水浴中晃动3分钟。同时, 在装满水的托盘中冲洗网格。
- 把污点取出, 放在预折叠的塑料 (聚乙烯油管) 之间, 仔细擦拭多余的液体, 并让污点干燥。注意, 液体会破坏 phosphorimager 屏幕。
- 在三边上用塑料封住污点。清除所有多余的液体周围的污点, 并关闭塑料管密封第四方。切断塑料的过剩。确保密封的污点没有泄漏, 塑料在外面是干的。
- 公开 phosphorimager 屏幕。
- 将密封的印迹放在 phosphorimager 盒中, phosphorimager 屏幕面对印迹的 DNA 侧。关闭盒式磁带并离开2–4天, 这取决于放射性标签的强度和 phosphorimager 的灵敏度。
- 使用 phosphorimager 扫描 phosphorimager 屏幕。注意在扫描前尽可能少地暴露屏幕的光线。保存图像。将屏幕从信号中抹去, 将其暴露在明亮的光线下。
- 分析污点。
- 分析取决于步骤4.1 中使用的限制策略。在分析根据步骤4.1.1.1 中显示的策略准备的污点 (图 4A) 时, 计算检测到的片段数。在这个策略中, 杂交片段的数量是指 T DNA 积分的数量。
- 将检测到的片段数与左侧的探测器 (图 7B) 和 T DNA 的右侧 (图 7C) 部分进行比较。
注: 如果检测到不同数量的杂交片段, 那么无论是 i) 多个 t DNA 拷贝 (无论是在倒置或直接方向) 或 ii) 不完全集成的 t 型脱氧核糖核酸存在。 - 根据标记带的大小估计杂交碎片在印迹上的大小, 并根据串联插入 (图 4A) 的限制策略, 比较混合片段的大小和预期的碎片大小, 以确定可能的串联排列的 T 型 dna。使用图 4A作为计算预期片段大小的指南。
注: 如果混合碎片的大小与计算结果不一致, 则最有可能存在的集成不完整。
- 将检测到的片段数与左侧的探测器 (图 7B) 和 T DNA 的右侧 (图 7C) 部分进行比较。
- 在分析根据步骤 4.1.1.2 (图 4B) 中显示的策略准备的污点时, 根据标记带的大小估计印迹上杂交片段的大小, 并将其与预期大小进行比较。完整的插入生成一个具有定义长度的单个片段。预期长度的任何偏差都表示不完整的集成 (图 7D)。
- 分析取决于步骤4.1 中使用的限制策略。在分析根据步骤4.1.1.1 中显示的策略准备的污点 (图 4A) 时, 计算检测到的片段数。在这个策略中, 杂交片段的数量是指 T DNA 积分的数量。
- 剥去再杂交的印迹 (可选)。
注意: 相同的印迹可以与不同的探针连续杂交。在继续新探针之前, 从印迹中剥离先前的杂交探针。- 要从印迹中取出探针, 将印迹放在托盘上, 其 DNA 侧朝下。将多余的 0.5% SDS 倒入托盘中。将膜煮沸2–5分钟。治疗的持续时间取决于所用探针的大小和 GC 含量。更长和 GC 更丰富的探针需要更长的治疗。
- 剥离后, 杂交与另一探头, 或密封和存储在摄氏-20 摄氏度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
利用 BIBAC 系统, 生成了用于研究植物 ODM 的记者构造10。构造是在网关条目向量 pENTR-gm12中设计的, 并使用网关 LR 复合反应插入 pBIBAC BAR (图 1)。
拟南芥是与 pDM19, 一个 BIBAC-GW 质粒与 mTurquoise eYFP 的记者, 携带一个平移停止密码子在 eYFP 阅读框架的位置 120 (mTurquoise2-eYFP*40) (图 2)10。总共有126个拟南芥植物被改造 (每壶9株, 14 盆)。这些植物的种子被汇集, 播种在托盘与土壤, 并允许生长两个星期之前, 膦铵溶液处理。只有表示bar基因的幼苗 (目前在 BIBAC-GW) 生存膦-铵处理 (图 3)。共11转基因转化为 pDM19, 相应的转化效率为0.02% 的种子分析。
对于11转基因的分离, dna 印迹被用来确定 T dna 积分的数量。为此目的, 用BglII 或ScaI (在图 4A上设计的策略) 切割基因组 DNA。这两种限制酶只切割一次到 T DNA 序列 (图 7A)。与探针杂交, 识别棒和 eYFP 编码区域允许检测各自 DNA 片段的数量。
在该污点上, 单个 dna 片段的数量可以用来估计记者行中的 T dna 插入数 (表 1)。单杂交片段与酒吧和 eYFP 探针表明存在一个单一的 T DNA 集成。从11转基因分析, 六进行单积分。平均积分数为1.2。
对于携带单个 T DNA 集成的6行, 插入的报告器构造的完整性是使用 DNA 印迹 (在图 4B中设计的策略) 进行测试的。基因组 DNA 是用BglII 和PciI 切开的, 释放一个 5.5 kb 的片段, 其中包含了 Bar 和 mTurquoise-eYFP 融合基因 (图 7A)。对 eYFP 的探针用于检测预期的碎片。所有被测试的植物运载了一个原封片断。请注意, 所检查的片段不包括左侧和右侧的 t dna 边界, 因此不检查整个 t dna 的完整性, 而只是包含感兴趣转基因的部分。
荧光报告基因的表达是在独立的单拷贝转基因线上确定的, 只有基因组定位的 T DNA。CaMV-35S 启动子驱动的 mTurquoise eYFP 记者的相对转录水平由 RT-qPCR 测量, 其四 DM19 的报告线携带完好, 单拷贝积分, 其中基因组位置确定为10。在报告基因表达水平之间的变化是次要的: mTurquoise-eYFP RNA 水平的最大差异是2倍 (图 8A)。
接下来, ODM 在这些记者行中进行。三在四独立的报告员线显示相当相似的 ODM 效率 (图 8B)。然而, 一条线, DM19 [4] 1, 产生了一个非常低的 ODM 效率比其他线。这些结果表明, ODM 受局部基因组上下文的影响。在什么方式 T 脱氧核糖核酸综合化的地方基因组上下文在 DM19 [4] 1 不同从那在其他线仍然将被辨认。非转基因植物基因组 T DNA 积分中活性和不活性染色质标记的可用数据分析没有提供应答10。
图 1: pBIBAC 向量的函数映射.pBIBAC-GW 衍生物可用于膦 (bar) 的抗性或种子大衣 (DsRed) 中的 DsRed 荧光作为植物中的选择标记。对于这两种载体, 卡那霉素抗性基因是细菌的选择标记。网关ccdB盒显示在表示复合站点 "R1" 和 R2 的绿色箭头之间. 请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 突变报告器构造.mTurquoise-eYFP 的报告基因是由三十五年代-CaMV 助剂驱动的。mTurquoise 编码区域融合到一个 eYFP 编码区域, 在核苷酸位置120上携带 C 型突变, 导致过早的平移停止密码子 TAA, 并过早终止融合蛋白的翻译。3′ Nopaline 合酶 (3 ' nos) polyadenylation 信号用于终止构造22的转录。核定位信号 (NLS) 用于靶向细胞核的转化蛋白。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 在膦铵处理前后填充拟南芥幼苗的托盘.幼苗未表达的酒吧基因, 是存在于 pBIBAC-GW T DNA 死亡后, 喷出膦铵溶液。这些照片显示同一盘苗 (A) 之前喷洒膦铵, 播种后14天, (B) 10 天后, 喷两次。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 一般的 DNA 限制策略, 用于识别插入的完整性的数目和数量.(A) 在 t dna 中间的一个限制站点 (R) 允许对 t dna (绿色 R) 的左 (红 L) 和右部分进行独立探查。右边的卡通片显示, 依赖于单拷贝或多复制的 T dna 积分, 用 DNA 印迹获得不同的条纹图案。标记有 * 的带有一个定义的长度, 而其他波段的长度取决于侧翼基因组 DNA 中最近的限制点。单个插入:L 和 R 探针都给出一个独立的片段。预期的平均碎片大小可以根据基因组中限制点的频率来计算。最小大小是从限制站点到左边框 (磅) 或右边框 (RB) 的距离, 具体取决于正在探查的集成的末尾, 以及 T DNA 是否完好。串联重复:L 和 R 的探头给出两个碎片;对于每个探针, 其中一个片段包括侧翼基因组 DNA, 第二个片段有一个预期的大小, 并由两个探针识别。反转重复:根据集成卡带的方向性, 可以识别一个 l 和两个 r 片段, 或者两个 l 和一个 r。单个插入:结果是多个独立的片段, 并且片段的数量对应于集成的数量。(B) 在 T DNA 的四肢上的限制站点允许确定限制站点之间的片段的完整性。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 具有限制模式和匹配透明度的琼脂糖凝胶.(A) 在琼脂糖凝胶上, 显示了用EcoR消化的基因组 DNA。DNA 的正确消化是由离散的卫星波段的存在所说明的。(B) 在透明度上标记插槽和标记带的位置, 可以以后轻松地计算杂交片段的大小。这里, MRC 荷兰标记 (蓝色和红色) 被使用, 由 m.请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 毛细管印迹的设置.在毛细管印迹设置中, 滤纸放在塑料板上, 纸的两端悬挂在 20x SSC 缓冲器中。该纸被湿润的 20x SSC, 和一个琼脂糖凝胶放置在顶部, 其次是尼龙膜, 过滤纸, 和一堆组织。重量轻放在上面。注意去除凝胶、纸和膜之间的气泡。保鲜膜用于避免在安装过程中干燥。请单击此处查看此图的较大版本.
图 7: DNA 印迹策略和实验结果的示例.(A) dna 印迹策略来确定 T dna 积分的数量和完整性。在 T 脱氧核糖核酸之内选定的制约酵素的切口位置用垂直的酒吧表明。用于与已消化的基因组 DNA 杂交的eYFP和bar探头使用与 T DNA 下面的终端点线进行表示。(B-D)示例 DNA 印迹. 用ScaI 切割基因组 DNA, 并使用bar和eYFP探测器 (B和C) 探测印迹。用BglII 和PciI 切割基因组 DNA, 并用bar探针进行探测。完整的片段大小为 5.5 kbp (D)。请注意, D 中的样本集与 B 和 C 中显示的示例不同. * 表示预期的片段大小;M, 马克。在 B、C 和 D 中使用相同大小的标记。请单击此处查看此图的较大版本.
图 8: 独立 mTurquoise eYFP 报告器行中的 mTurquoise eYFP 表达式级别和 ODM 效率.(A) 相对 mTurquoise-eYFP 记录级别, 由 DM19 记者行中的 RT qPCR 测量。使用肌动蛋白的规范化转录水平。(B) 在 DM19 报告器行中测量的 ODM 效率。对于 A 和 B, 条形表示至少五种生物复制的平均值。误差线表示 SEM.请单击此处查看此图的较大版本.
| T 型 DNA 轨迹类型 | T DNA 积分的 Nr | 记者行 | 检测到的片段数 | 完整性 | |||
| Sca我 | Bgl二 | Bgl二/PciI | |||||
| 栏 | eYFP | 栏 | eYFP | eYFP | |||
| 单轨迹积分 | 1 | 19 [2]-2 | 1 | 1 | 1 | 1 | + |
| 1 | 19 [2]-5 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | 19 [2]-9 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | 19 [2]-11 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | 19 [4]-1 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 1 | 19 [4]-2 | 1 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 2、倒置重复 | 19 [2]-10 | 2 | 1 | 1 | 1 | + | |
| 2、不完全集成 | 19 [2]-3 | 1 | 2 | 1 | 1 | 钕 | |
| 多个轨迹集成 | 2 | 19 [2]-6 | 2 | 2 | 2 | 钕 | |
| 2 | 19 [2]-7 | 2 | 2 | 2 | 2 | 钕 | |
| 3/4 | 19 [2]-1 | 4 | 3 | 3 | 3 | 钕 | |
| 不确定。 | |||||||
表 1:与 pDM19 转换后转基因分离的 DNA 印迹数据摘要.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
对产生转基因的关键是单一的, 完整的整合的转基因是使用二进制向量的选择。BIBAC 家族载体已被用来交付许多植物物种的利益序列23,24,25,26,27,28。BIBAC 向量, 包括 BIBAC, 具有高效率的单拷贝集成: 每行插入的平均数量是1.5 到 2, 而最常用的二进制向量5,9,29. 与其他 BIBAC 向量相比, 与 BIBAC 的向量比较起来, 兴趣序列可以很容易地通过网关重组站点12来插入。修正后的向量克服了传统克隆策略中使用的 BIBAC 向量的一般问题: i) 有限数量的唯一限制点和 ii) 低 DNA 产量。网关重组站点使 BIBAC-GW 向量成为其他二进制载体的一个有吸引力的替代品, 用于生成转基因植物。
本文介绍了一系列的协议, 从产生的 BIBAC-GW 衍生物的利益序列, 植物转化, 和 DNA 印迹分析的数量和完整性的转基因序列。本文报告的几种协议, 即网关克隆、细菌电穿孔和植物转化, 是许多实验室的常见实践, 也可以进行轻微的修改。重要的是要知道, BIBAC 是一个单拷贝向量在大肠杆菌和. 农杆菌。因此, 在分离 DNA 时, 收率低;建议扩展隔离过程。
在转基因携带多个 T DNA 集成, 介绍转基因经常受到基因沉默1,2,4,30, 因此, 应避免大多数应用程序。为了确定转基因植物的单一, 完整的整合, 建议使用 DNA 印迹分析。虽然 dna 印迹以外的方法可用于确定转基因线 (分离分析、尾 pcr、定量 pcr (qPCR) 和数字滴 pcr) 的 t dna 拷贝数和完整性, 但人工密集, DNA 印迹往往是选择的方法。分离分析无法区分单个基因座上的多基因和单 T DNA 积分。尾 PCR 通常低于估计复制数, 特别是如果多个 T DNA 集成存在31, 并且 qPCR 需要对可靠结果进行精心优化31,32。如果所需的设备可用31, 则数字滴 PCR 是一种相当精确的拷贝数检测方法。DNA 印迹的额外好处是对截断的 t-dna 的简易检测, 在所有 PCR 技术中容易被遗漏。
在 DNA 印迹分析中, 印迹上的杂交片段需要在信号和大小上得到很好的识别。已知影响 DNA 印迹结果的几个因素。除了适当选择限制酶 (在图 4中指出的策略) 和大小标记之外, 还需要足够的高质量的 DNA。不到2µg 的基因组拟南芥DNA 不会产生良好的可识别片段。当处理更大的基因组时, 需要更多的 DNA。要获得足够数量的拟南芥DNA, 可以使用花组织或1周的老苗。在一个培养皿上生长的一批幼苗产生2–8µg 的 DNA。为了避免 DNA 在分离过程中降解, 应注意快速处理植物材料。此外, 基因组 DNA 应悬浮三 EDTA, 以减少其降解的核酸, 并储存在4°c 而不是-20 摄氏度, 以防止 DNA 偷由于反复冻融循环。如果不确定所有的 dna 样本完全消化, 建议 rehybridize dna 印迹与一个探针识别内源, 独特的基因组区域。选择用于识别转基因或内源序列的探针序列时, 只选择唯一序列是至关重要的。为了能够精确地确定杂交片段的大小, dna 凝胶槽和 dna 标记带的位置应该在透明 (图 5B) 上标记, 当在 UV 上可视化一溴溴染的凝胶 (图 5A) 时。transilluminator。如果标记序列不杂交探针 DNA, 或杂交是部分, 它是唯一的方法来跟踪的大小杂交片段。
一旦注意到获得良好的杂交信号和碎片大小的估计, 印迹结果的解释是直接的。当使用一个限制酶, 并与不同的探针杂交检测的左或右部分的 t dna, 检测到的碎片数量反映了 t dna 插入的数量。例如,图 7B、C使用图 7A中显示的策略显示相同的 DNA 印迹, 与不同的探针、 bar (图 7B) 和增强型黄色荧光蛋白 (eYFP) (图 7C) 进行杂交。所有车道, 除了 4, 在两个污点上显示相同数量的碎片: 6 行的两个碎片和所有其他行的单个片段。检测到的碎片数量是 T DNA 插入的数量。
当检测到的带探针的碎片数量与 t DNA 的左或右部分不同 (如图 7B、C、4行) 时, 不存在不完整的插入, 或者 t 脱氧核糖核酸已插入串联排列。串联插入显示一个 T DNA 片段的非随机片段长度 (图 4A, 右面板), 并可以通过比较混合片段大小与预期的基于限制策略来识别。可能需要额外的印迹策略来确认 T DNA 插入的串联排列。在4行 (图 7B、C) 中显示的示例中, 两个插入是按反向重复方向排列的。
当估计 T DNA 的完整性或部分时, 可以根据限制策略计算杂交片段的长度。任何与预期大小的偏差都表明插入不完整。例如, 在图 7D中的4条中, 杂交片段迁移到 8 kbp (而不是预期的 5.5 kbp), 表示由于缺少一个限制站点而导致片段大小增加。
BIBAC-GW 向量是在许多植物物种中生成单拷贝完整集成的优秀工具。这里报告的议定书提供了一个可靠的程序, 以确定植物的单一, 完整的整合的转基因的利益。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人没有宣布任何竞争性的金融利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到荷兰技术基金会 STW (12385) 的支持, 该基金是荷兰科学研究组织 (NWO) 的一部分, 由经济事务部 (检察官办公室赠款12385至 MS) 部分资助。 我们感谢卡罗尔 m. 汉密尔顿 (美国康奈尔大学) 提供 pCH20, BIBAC 的主干。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kanamycin sulphate monohydrate | Duchefa | K0126 | |
| Gentamycin sulphate | Duchefa | G0124 | |
| Rifampicin | Duchefa | R0146 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma | T-3383 | |
| DB3.1 competent cells | Thermo Scientific - Invitrogen | 11782-018 | One Shot ccdB Survival 2 T1R Competent Cells (A10460) by Invitrogen or any other ccdB resistant E. coli strain can be used instead |
| DH10B competent cells | Thermo Scientific - Invitrogen | 18290-015 | |
| Gateway LR clonase enzyme mix | Thermo Scientific - Invitrogen | 11791-019 | |
| tri-Sodium citrate dihydrate | Merck | 106432 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| EDTA disodium dihydrate | Duchefa | E0511 | |
| Proteinase K | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Sodium chloride | Honeywell Fluka | 13423 | |
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck | 108346 | |
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm gap | Biorad | 1652089 | |
| Electroporator Gene Pulser | BioRad | ||
| Magnesium sulfate heptahydrate | Calbiochem | 442613 | |
| D(+)-Maltose monohydrate 90% | Acros Organics | 32991 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Silwet L-77 | Fisher Scientific | NC0138454 | |
| Murashige Skoog medium | Duchefa | M0221 | |
| Agar | BD | 214010 | |
| Glufosinate-ammonium (Basta) | Bayer | 79391781 | |
| Restriction enzymes | NEB | ||
| Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1610433 | |
| Electrophoresis system | Bio-Rad | ||
| Sodium hydroxide | Merck | 106498 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100316 | |
| Blotting nylon membrane Hybond N+ | Sigma Aldrich | 15358 | or GE Healthcare Life Sciences (RPN203B) |
| Whatman 3MM Chr blotting paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-931 | |
| dNTP | Thermo Fisher | R0181 | |
| Acetylated BSA | Sigma-Aldrich | B2518 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck | 805740 | |
| Sephadex G-50 Coarse | GE Healthcare Life Sciences | 17004401 | or Sephadex G-50 Medium (17004301) |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | US Biological | S5010 | |
| Salmon Sperm DNA | Sigma-Aldrich | D7656 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Storage Phosphor screen and casette | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-74 | |
| Phosphor imager | GE Healthcare Life Sciences | Typhoon FLA 7000 | |
| UV Crosslinker | Stratagene | Stratalinker 1800 | |
| cling film (Saran wrap) | Omnilabo | 1090681 | |
| Agarose | Thermo Scientific - Invitrogen | 16500 | |
| Boric acid | Merck | 100165 | |
| DNA marker ‘Blauw’; DNA ladder. | MRC Holland | MCT8070 | |
| DNA marker ‘Rood’; DNA ladder | MRC Holland | MCT8080 | |
| Hexanucleotide Mix | Roche | 11277081001 | |
| Large-Construct Kit | Qiagen | 12462 | |
| Heat-sealable polyethylene tubing, clear | various providers | the width of the tubing should be wider than that of blotting membrane | |
| Heat sealer | |||
| Membrane filter disk | Merck | VSWP02500 | |
| Magnesium chloride | Merck | 105833 | |
| Hybridization mesh | GE Healthcare Life Sciences | RPN2519 |
References
- Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).
- Stam, M., et al. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 12, 63-82 (1997).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants. Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Jin, Y., Guo, H. S. Transgene-induced gene silencing in plants. Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).
- Oltmanns, H., et al. Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA]. Plant Physiol. , (2010).
- Ye, X., et al. Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Res. , (2011).
- Hamilton, C. M. A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA. Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato. Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).
- Vega, J. M., et al. Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors. Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).
- Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta. Plasmid. 89, 27-36 (2017).
- Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).
- Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing. PLoS Genet. 9 (10), e1003773 (2013).
- Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
- Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange. Plant Methods. 7, 33 (2011).
- Woodman, M. E., et al. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).
- Ausubel, F. M., et al. Mol Biol. Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349 (1991).
- Clarke, J. D. Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation. Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning. , CSH Press. (2012).
- Sosa, J. M. Chromatography with Sephadex Gels. Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).
- Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).
- Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization. Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).
- Lee, M. K., et al. Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L). BMC Genomics. 14, 208 (2013).
- Wang, W., et al. A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes. Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).
- Wu, C., et al. A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome. Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).
- Xu, Z., et al. Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum. Nucleic Acids Res. 33 (5), e50 (2005).
- Zhang, M., et al. Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L. PLoS One. 7 (3), e33644 (2012).
- Frary, A., Hamilton, C. M. Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato. Transgenic Res. , (2001).
- Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants. Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).
- Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants. Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).
- Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants. Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).
