שימוש dUTP בתיווך טרנספראז מסוף מבחני סיום ניק-תוויות (TUNEL) ו קספאז 3/7 כדי למדוד מות תאים באפידרמיס של צפרדעים עם צ'יטרידיומיקוסיס
Summary
אנחנו לכמת מוות תאי אפידרמיס של צפרדעים עם צ’יטרידיומיקוסיס באמצעות שתי שיטות. ראשית, אנו משתמשים dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק labelling-סוף (TUNEL) בחיי עיר היסטולוגיה כדי לקבוע את ההבדלים בין בעלי חיים נגועים קליניות, נגוע. שנית, אנו מבצעים ניתוח סדרות זמן של אפופטוזיס על זיהום באמצעות ניתוח חלבון קספאז 3/7.
Abstract
דו-חיים חווים אובדן גדול של המגוון הביולוגי באופן גלובלי, והוא אחד הגורמים העיקריים צ’יטרידיומיקוסיס מחלה זיהומית. מחלה זו נגרמת על ידי המחלה פטרייתי כיטרידיומיקוסיס (Bd), אשר מדביק ומפריע האפידרמיס צפרדע; עם זאת, שינויים פתולוגיים לא היה מפורש שאפיינו. אפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת) יכול לשמש על ידי פתוגנים לפגיעה ברקמות הפונדקאי, אך ניתן גם מנגנון המארח של ההתנגדות המחלה להסרת הפתוגן. במחקר זה, נוכל לכמת מוות תאי אפידרמיס של בעלי חיים נגועים, נגוע, באמצעות שני מבחני שונות: dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק סוף-תוויות (TUNEL) ולאחר קספאז 3/7. שימוש הגחוני /, הגבי, ואת רקמת עור הירך ב- TUNEL וזמינותו, נתבונן תא מוות תאים אפידרמיס בחיי עיר של חיות נגועות קלינית והשווה מוות של תאים בעלי נגוע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבוע כיצד רמות אפופטוזיס האפידרמיס לשנות במהלך זיהום אנחנו להסיר דגימות הבוהן-עצה כל שבועיים על פני תקופה 8 שבועות, והשתמש וזמינותו של קספאז 3/7 עם חלבונים שחולצו לכמת פעילות בתוך הדגימות. אנחנו מכן לתאם פעילות קספאז 3/7 עם עומס זיהום. וזמינותו TUNEL שימושית לוקליזציה של התא המוות בחיי עיר, אבל אינטנסיבית יקר והשעה עבור דגימה. וזמינותו קספאז 3/7 יעיל עבור מדגמים גדולים וזמן הקורס ניסויים. עם זאת, מכיוון צפרדע הבוהן עצה ביופסיות קטנות יש תמצית מוגבלת זמין התקינה מדגם באמצעות שיטות כימות חלבון, כמו וזמינותו ברדפורד. לכן, אנו מציעים הערכת שטח העור בעזרת צילומי ניתוח ביופסיות הבוהן כדי להימנע מצריכת תמציות במהלך דגימה תקינה.
Introduction
דו-חיים כיום חווים אחד ההפסדים הגדולים של המגוון הביולוגי העולמי של כל חוליות taxa1. הגורם העיקרי ירידות אלה הוא צ’יטרידיומיקוסיס מחלת העור קטלנית, הנגרמת על ידי המחלה פטרייתי כיטרידיומיקוסיס, Bd2. הפתוגן באופן שטחי מדביק האפידרמיס, אשר יכול להוביל לשיבוש בתפקוד העור וכתוצאה מכך איבוד חמור אלקטרוליט, דום לב ומוות3. פוטנציאל מארח המערכת החיסונית מנגנונים שונים נגד Bd הם כיום נחקר, פפטידים מיקרוביאלית4,5, עורית חיידקי הפלורה6, תא החיסון רצפטורים7,8, ו לימפוציטים פעילות9,10 עם זאת, מחקרים מעטים לחקור אם המוות אפופטוזיס ותא באפידרמיס הוא מנגנון החיסון כנגד הפתוגן הקטלני הזה.
מוות של תאים, או באמצעות אפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת) או נמק (מוות unprogrammed), האפידרמיס ייתכן פתולוגיה של זיהום Bd . מחקרים קודמים מרמז כי Bd זיהום עלול לגרום אפופטוזיס בגלל שיבוש צמתים תאיים נוצרת כאשר העור explants נחשפים zoospore supernatants במבחנה11. בנוסף, שינויים ניווניים עוריות Bd-צפרדעים נגוע שנצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים12,13. ניתוחים Transcriptomic מצביעים על כך אפופטוזיס ישנן upregulated העור הנגוע14, דו-חיים splenocytes עוברים אפופטוזיס כאשר הם נחשפים supernatants במבחנה Bd 15. למרות הנפח גדל והולך של הראיות המצביע Bd יכול לגרום אפופטוזיס ומנחה תא מוות במבחנה, מחקרים ויוו לחקור או לכמת אפופטוזיס חסרים מנגנונים דרך ההתקדמות של זיהום. יתר על כן, לא ידוע אם המחשב המארח משתמש אפופטוזיס כמו אסטרטגיה הגנתית המערכת החיסונית להילחם Bd זיהום, או אם אפופטוזיס הוא פתולוגיה של מחלות.
במחקר זה, כיוונו כדי לזהות מוות תאי אפידרמיס של אפופטוזיס חיות נגועות ויוו באמצעות שתי שיטות: שיטת קספאז 3/7, dUTP טרנספראז בתיווך מסוף ניק labelling-סוף (TUNEL) בחיי עיר וזמינותו. כמו כל assay מגלה היבטים שונים של מוות תא16, יחד שיטות אלה מספקים הבנה מלאה של המנגנונים המעורבים מוות תאי ולהבטיח מדד מדויק של האפקט. וזמינותו קספאז 3/7 מכמת את הפעילות של caspases אפקטור 3 ו- 7, המאפשר כימות של שני המסלולים אפופטוזיס פנימי ולא חיצוני. לעומת זאת, וזמינותו TUNEL מזהה פיצול הדנ א, אשר נגרמת על ידי מנגנוני מוות התא כולל אפופטוזיס, נמק, pyroptosis17. אנו משתמשים וזמינותו TUNEL לחקור את המיקום של מוות של תאים בתוך האפידרמיס של חיות הן נגועות קלינית והן נגוע באמצעות שלושה מקטעים עור שונים: את dorsum, ונטר את ירכו של Pseudophryne corroboree. שיטה זו מזהה האתר האנטומי של מוות של תאים, כמו גם הבחנה מיקומו בתוך שכבות עוריות מסוימות. ואז נשתמש וזמינותו קספאז 3/7 לערוך סדרת זמן כימות אפופטוזיס לאורך כל זיהום 8 שבועות ליטוריה verreauxii alpina. אקח דגימות קצה הבוהן כל שבועיים החיות באותה ואנו מסוגלים לתאם הפתוגן זיהום עומס עם פעילות קספאז 3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
חרשנו אפופטוזיס עוריות ומוות תא כמנגנון פוטנציאלי של פתולוגיות של צ’יטרידיומיקוסיס מחלה קטלנית או מנגנון של ההתנגדות המחלה במינים רגישים Bd . השתמשנו שתי שיטות הערכת מוות תאי האפידרמיס, TUNEL assay בחיי עיר ניתוח מוות תאים באפידרמיס ולאחר assay קספאז 3/7 עבור ניטור מוות תאי אפידרמיס לאור?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים האנשים הבאים שסייעו עם גידול ואיסוף נתונים: Tegtmeier ד, ג דה יונג, ג’יי הוקס, ק’ Fossen, פרסיבל ס, מ McWilliams, ל’ Bertola, סטיוארט מ, הרני ש ו ט Knavel; Merces מ לקבלת סיוע עם ניתוח. כן נרצה להודות מ מקפאדן, עמ’ הארלו Taronga גן החיות לגידול של ל’ נ’ alpinaואת ג’י Marantelli לגידול של corroboree פ. אנו מודים Pasmans פ, א מרטל לקבלת ייעוץ אודות מבחני אפופטוזיס, קונסטנטין ג, Kladnik א ו ר ווב לקבלת סיוע עם TUNEL assay, ולעזור Emeto ט ו וו Weßels עבור פרוטוקול, ערכת assay קספאז 3/7. זה כתב היד ופרוטוקול מותאמת מ Brannelly ואח 2017 J עמית22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
