Summary
우리는 두 가지 방법을 사용 하 여 chytridiomycosis와 개구리에서 상피 세포 죽음 계량. 먼저, 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 제자리에서 조직학 사용 하 여 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물 간의 차이 확인 하려면. 둘째, 우리는 caspase 3/7 단백질 분석을 사용 하 여 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 분석을 실시 합니다.
Abstract
양서류 세계적으로 생물 다양성에 큰 손실을 겪고 그리고 주요 원인 중 하나 전염병 chytridiomycosis. 이 병은 곰 팡이 병원 균 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), 감염 하 고 개구리 표 피;를 방해에 의해 발생 그러나, 병 적인 변화는 계속 명시적으로 특징 되지. Apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 호스트 조직 손상에 병원 균에 의해 사용할 수 있습니다 하지만 병원 체 제거에 대 한 질병 저항의 호스트 메커니즘을 수도 있습니다. 이 연구에서 우리는 두 개의 서로 다른 분석 실험을 사용 하 여 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 세포 죽음 계량: 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 caspase 3/7. 사용 하, 등, 복 부 및 허벅지 피부 조직을 TUNEL 분석 결과에 우리가 관찰 세포 죽음 표 피 세포에는 제자리에서 임상적으로 감염 된 동물의 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 되지 않은 동물 세포 죽음을 비교. 표 피에서 apoptosis 수준 감염의 과정을 통해 변경 하는 방법을 결정 하기 위해 우리는 8 주 동안 격주 발가락 끝 샘플을 제거 하 고 추출 된 단백질 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 샘플 내에서 활동을 계량. 우리는 다음 감염 부하 caspase 3/7 활동을 상관 관계. TUNEL 분석 결과 세포 죽음에서 제자리에서의 지역화에 대 한 유용 하지만 비용과 시간 샘플 당 집중. Caspase 3/7 분석 결과 큰 샘플 크기와 시간에 대 한 효율적인 실험 과정. 그러나, 개구리 발가락 팁 biopsies 작기 때문에 있다 제한 추출 샘플 표준화 Bradford 분석 실험과 같은 단백질 정량화 방법을 통해 사용할 수 있습니다. 따라서, 피부 표면 영역 샘플 표준화 동안 추출 물을 사용 하지 않으려면 발가락 biopsies의 사진 분석을 통해 추정 하는 것이 좋습니다.
Introduction
양서류는 현재 발생 하나 모든 척추 동물 taxa1의 세계 생물 다양성의 가장 큰 손실. 이러한 하락의 주요 원인 치명적인 피부 질병 chytridiomycosis, Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2곰 팡이 병원 균에 의해 발생 이다. 병원 체는 표면적으로 표 피, 피부 기능 심한 전해질 손실, 심장 마비, 그리고 사망3결과의 중단으로 이어질 수 있는 감염. Bd 에 대 한 다양 한 잠재적인 호스트 면역 메커니즘은 현재 공부 되 고, 항균 성 펩 티 드4,5, 피부 세균 식물6,8, 면역 세포의 수용 체7, 그리고 림프 구 활동9,10. 그러나, 몇 가지 연구는 상피 apoptosis와 세포 죽음은이 치명적인 병원 체에 대 한 면역 메커니즘을 탐구 한다.
세포 죽음, apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 또는 괴 사 (unprogrammed 죽음), 표 피에서 통해 Bd 감염의 병리학을 있을 수 있습니다. 이전 연구 Bd 감염 세포내 접합의 피부 explants zoospore supernatants 생체 외에서11. 에 노출 되는 때 관찰 하기 때문에 apoptosis를 유도 수 있습니다 하는 것을 건의 한다. 또한, Bd에 퇴행 성 상피 변화-감염 된 개구리 전자 현미경12,13를 사용 하 여 관찰 된다. Transcriptomic 분석 나타냅니다 apoptosis 경로 감염 된 피부14, upregulated 양서류 splenocytes 그들은 체 외에서 Bd supernatants15에 노출 되 면 apoptosis를 받 다. Bd 를 일으킬 수 있는 제안 하는 증거의 증가 볼륨에도 불구 하 고 apoptosis와 호스트 죽음 생체 외에서 vivo에서 연구에 하거나 감염의 진행을 통해 메커니즘 부족 apoptosis를 계량 하는 세포. 또한, 그것 아니다 알려진 호스트 Bd 감염을 방지 하기 위해 면역 방어 전략으로 apoptosis를 사용 하는 경우 또는 apoptosis 질병의 병 리.
이 연구에서 우리가 감염된 동물에서 vivo에서 두 가지 방법을 사용 하 여 표 피 세포 죽음 및 apoptosis를 감지 목적: caspase 3/7 단백질 분석 결과, 및 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 현장에서 시험. 각 분석 결과 감지 세포 죽음16의 다른 측면, 함께 이러한 방법을 세포 죽음에 관련 된 메커니즘의 완전 한 이해를 제공 하 고 효과의 정확한 측정을 보장. Caspase 3/7 분석 결과 단정 이펙터 caspases 3, 7, 내장 및 외부 apoptosis 경로의 정량화를 가능 하 게의 활동. 반면, TUNEL 분석 결과 검색 DNA 파편, apoptosis, 괴 사 및 pyroptosis17를 포함 하 여 세포 죽음 메커니즘에 의해 발생 합니다. TUNEL 분석 결과 사용 하 여 세 가지 다른 피부 섹션을 사용 하 여 모두 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 내 세포 죽음의 위치를 조사 하는 우리: 고 등는 venter와 Pseudophryne 코의 허벅지. 이 메서드는 특정 상피 층 내에서 위치를 구별 뿐만 아니라 세포 죽음의 해 부 사이트를 식별 합니다. 우리는 다음 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 Litoria verreauxii alpina에 8 주 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 정량화를 수행. 우리 같은 동물에서 발가락 끝 샘플을 격주 걸릴 고 caspase 3/7 활동 병원 체 감염 부하를 연결할 수 있습니다.
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Protocol
제임스 쿡 대학 승인 응용 프로그램 A1875 P. 코 와 A1897 및 A2171 L. alpina 대동물 윤리.
1. 축산 및 모니터링
- 적절 한 물, 수 유 및 일정을 청소와 종족에 대 한 적절 한 환경에서 동물을 개별적으로, 집. 매일 동물을 확인 합니다.
- 비판적으로 멸종 위기에 놓인된 Pseudophryne 코 의 성인 개인 (TUNEL 분석 결과, 제 4)를 사용 하 고 (Caspase 3/7 분석 결과, 5)에 대 한 위협된 Litoria verreauxii 피나 에서 기증 포로 사육 시설. 이끼에 15-18 ° C에서 동물을 유지 하 고 자갈 기판, 역방향 삼 투 물으로 매일 그들을 안개 창 로드 귀뚜라미와 3 번 매주 피드.
- 매주 각 개인 한 번에 데이터를 수집 합니다. 면봉 Bd 에 대 한 개인 단계 2.1에 설명 된 대로. Neared 0.1 g, 규모를 사용 하 여 각 동물의 무게 하 고 그들의 주 둥이 환기 (SVL) 길이 다이얼 캘리퍼스를 사용 하 여 가장 가까운 0.01 m m를 측정 한다.
- (섹션 3에서 설명)로 접종 후 매일 동물 윤리 지침을 준수 (불규칙 한 피부 슬 라우, inappetence, 다리 빨갛게, 혼 수, 또는 지연된 righting 반사) 감염의 임상 증상에 대 한 동물을 확인 합니다. 임상 증상 및 병 적 동물을 안락사.
- Tricaine methanesulfonate (MS222)의 과다와 안락사 (0.1 %w / v MS222 ~ 세 수도 물에 중 탄산 나트륨으로 pH 6-7). 10 분 후 모든 움직임을 중단 하 고 그들은 자극에 대 한 응답이 표시 MS222에 동물 유지.
2. Bd 감염에 대 한 테스트
- Bd 를 보라고
- 새로운 살 균 주 면봉 (동물 당 1 개의 면봉)으로 각 동물 면봉. 다음 swabbing 메서드를 사용 하 여:는 venter에 5 번, 5 번 각 허벅지, 측면, 그리고 다리에. 이것은 45 획의 총 이다.
- 부드럽게 돌려 면봉 중 DNA의 효과적인 캡처 되도록 선 사이의. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 면봉 끝을 끊다 고 추출까지-20 ° C에서 저장 합니다.
- DNA 추출 및 정량 분석 결과
- 0.5 m m 실리 카 구슬의 30-40 mg와 상용 DNA 추출 시 약의 50 µ L을 추가 하 여 면봉에서 게놈 DNA를 추출 합니다. 구슬 구슬 때리는 셀 disrupter 2 분에 대 한 최대 속도에서 샘플을 이길. 비드 때리는 단계 1 분에 2000 x g에서 샘플 원심.
- 10 분, 100 ° C에서 샘플을 품 어과 냉각 수 있습니다. 3 분, 5000 x g에서 샘플 원심 다음 개별 1.5 mL 마이크로 원심 관에는 상쾌한을 전송 하 고 정량까지-20 ° C에서 저장.
- 사용 양이 많은 PCR (정량) 다음 보일 외. 200418 감염 부하 분석을 합니다. 사용 하 여 다음과 같은 수정:
- DNA 추출 샘플 6:100 이중 이온을 제거 된 물으로 희석. 각 잘 PCR 저해 방지를 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.7 µ L를 추가 합니다. Singlicate에서 각 샘플을 실행 합니다. 각 접시에 네거티브 (템플릿) 제어 및 긍정적인 통제 희석 기준의 시리즈를 사용 zoospore (감염) 부하 추정.
3입니다. 접종
- 문화 Bd
- Tryptone의 16 g, 젤라틴의 2 세대 및 4g 유 (TGHL)의 이온을 제거 된 물 1 L에 추가 하 여 문화 국물을 준비 합니다. 오토 클레이 브 (40 분 동안 121 ° C) 냉각 국물을 허용.
- (이 경우, 뉴 사우스 웨일즈 격리, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, 통로 번호 11에서에서 분리)에 Bd 분리 접종 TGHL 국물에 23 ° C에서 7 d에 대 한 성장 그리고 TGHL 한 천 배지를 국물 문화를 전송.
- 접시, 추가 tryptone의 16 g, 젤라틴의 2 세대, 유 당 (TGHL)의 4 g와 세균 agar의 10 g의 이온을 제거 된 물, 고압 (40 분 동안 121 ° C) 1 l. 일단 혼합물은 충분히 멋진 터치, 하지만 그것은 고형화 하기 전에 TGHL agar에 붓고 92 m m 직경 문화 접시 그래서 그들은 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 1/4 ~ 1/3 가득.
- 때는 한 천 경화가 고 완전히 냉각, 각 접시 액체 국물에서 Bd 의 0.5 mL를 접종 하 고 균등 하 게 확산. 약 1 시간에 대 한 접시에 건조 하 고 다음 플라스틱 파라핀 영화와 번호판 봉인 Bd 국물 혼합물을 허용 한다. 5-7 d 23 ° C에서 내려 접시 한 쪽을 품 어.
- 홍수 zoospore 접종 솔루션에 대 한 번호판
- 접종 전에 매일 생존을 보장 하기 위해 거꾸로 가벼운 현미경 zoospore 운동 성을 확인 합니다. Zoospore 릴리스는 높은, 많은 zoospores는 sporangia 외부 수영으로 때 문화는 접종에 대 한 준비.
- 접시에 물을 붓는 하 고 물으로 출시 zoospores 수 있도록 10 분 동안 실 온에서 배양 하 여 각 접시 세 수도 물 또는 인공 연못 물 3 mL를 홍수. 인큐베이션 기간이 지난 후 새로운 멸 균 용기에 zoospore 현 탁 액을 가만히 따르다.
- 견적 zoospore 농도 haemocytometer를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라. Zoospore 현 탁 액의 농도가 되 면, 세 꼭지 물 3 mL 당 1 x 106 zoospores의 농도에 정지 희석.
- 동물 접종
- 개별 50 mL 용기에서의 벤 터19 위로 쏟아지는 3 mL inoculum 혼합물에 의해 각 동물 접종. 초과 inoculum 접종 컨테이너의 자료로 수집을 허용 합니다. 감염, 되도록 24 h에 대 한 개별 접종 컨테이너에 각 동물을 두고 고 24 h 접종 후 소독된 terrarium을 각각 반환 합니다.
- 울림 13% 볼륨/볼륨 (v/v) 상업적인 표 백제 솔루션20를 사용 하 여 소독, 두 번 이상 물으로 씻어 다음 보다 24 h 동안 건조를 허용 합니다.
- Bd에 대 한-컨트롤을 부정, 모의 3.2 3.3와 동일한 방법을 사용 하 여 동물 접종 하지만 Bd홍수- Bd 의 세 수돗물의 5 mL와 함께 무료 한 천 배지 대신는 한 천 배지를 주사.
- 개별 50 mL 용기에서의 벤 터19 위로 쏟아지는 3 mL inoculum 혼합물에 의해 각 동물 접종. 초과 inoculum 접종 컨테이너의 자료로 수집을 허용 합니다. 감염, 되도록 24 h에 대 한 개별 접종 컨테이너에 각 동물을 두고 고 24 h 접종 후 소독된 terrarium을 각각 반환 합니다.
4. TUNEL 분석 결과
- 1.3.1, 단계 및 Bd의 동등한 수에서 설명한 대로 chytridiomycosis의 임상 증상을 보이고 있다 동물 안락사-부정적인 제어 동물.
- 피부를 해 부 (등, 복 부, 그리고 허벅지) 각 동물에서 샘플. 4 %v / v 인산 염 버퍼 포름알데히드에 2 h의 피부 샘플을 수정. 짧은 하 고 일관 된 시간을 고정 수 있습니다 완벽 하 게 고정, 조직 뿐만 아니라 효과적이 고 정확한 immunohistochemistry 얼룩에 대 한 수 있습니다. 다음 단면에 대 한 포함까지 80% 에탄올으로 전송 합니다.
- 다음과 같은 표준 메서드21조직학 준비를 위한 파라핀 왁 스에 피부를 포함 합니다. 간단히, 프로토콜은 다음과 같습니다.
- 에탄올의 등급된 시리즈에 조직을 탈수 하 고 에탄올 크 실 렌을 취소 합니다. 파라핀 왁 스에 조직을 포함 하 고 한 파라핀 블록에 각각에 대 한 모든 세 가지 피부 샘플을 배치.
- 다음 표준 조직학 준비21톰을 사용 하 여 섹션 피부. 섹션 5 µ m에서 순차적으로 조직 하 고 친수성 유리 슬라이드에 부착. 피부 타입 슬라이드 당 당 4 개의 직렬 histosections 장소. 직렬 피부 섹션 개인 당 세 개의 슬라이드, 각 슬라이드 각 조직 부착의 4 개의 단면도 기억.
- 다음과 같은 순서로 슬라이드를 얼룩:
- 되며 (H & E) counterstaining 오신 다음으로 첫 번째 슬라이드를 얼룩. 이 슬라이드는 Bd sporangia 피부 내에서 위치를 시각화 하는 것입니다.
- 조직학 준비에 대 한 상용 TUNEL 분석 결과 다음 두 번째 슬라이드를 얼룩 하 고 아래 설명 된 제조업체의 지침을 따르십시오.
- 첫째, 세척, 당 5 분 크 실 렌의 3 개의 변경 슬라이드를 세척 하 여 coplin jar에서 조직 섹션 deparaffinize와 5 분 동안 100% 에탄올의 변화 2 함께 각 세척 하십시오. 5 분에 대 한 PBS의 한 세척과 95% 에탄올 3 분 그리고 3 분 마무리에 대 한 70% 에탄올의 한 세척을 따르십시오.
- 갓 희석 단백질 소화 효소 (가수분해는 PBS에 희석 20 μ g/mL의 농도에서 K), 조직 pretreat을 슬라이드에 직접 추가 합니다. 15 분 세척 2 분 coplin jar에 PBS의 두 가지 변화에 대 한 알을 품을 수 있습니다.
- 과잉 액체를 누르고 방 온도에서 2 분 동안 coplin jar에 PBS에 3.0%의 과산화 수소에에서 끄다. 린스 두 번 PBS, 5 분 동안 각 세척 합니다.
- 과잉 액체를 누릅니다 다음 슬라이드에는 조직에 직접 평형 버퍼의 75 µ L/5 c m2 을 적용 합니다. 10 미 탭 섹션 주위 초과 액체를 incubate 고 터미널 deoxynucleotidyl tranferase (TdT) 효소의 55 µ L/5 c m2 을 적용 합니다. 37 ° c.에서 1 h 습도 챔버에 품 어
- 작업 강도 중지/워시 버퍼, coplin jar에 슬라이드를 넣어 TdT 부 화 후 15 선동 s와 실 온에서 10 분 동안 품 어. 워시 워시 당 1 분에 대 한 PBS의 3 개의 변경 슬라이드. 과잉 액체를 누릅니다.
- 안티 digoxigenin 공액 (rhodamine) 조직, 65 µ L/5 c m2에 실내 온도에 예 열을 적용. 온도 실 온에서 30 분 동안 습도 챔버에 incubate 고 빛에 노출 하지 마십시오. 워시 워시 당 2 분에 대 한 PBS의 4 개의 변화. 과잉 액체를 누릅니다.
- 0.5-15 µ L 추가 하 여 마무리 역할 카운터 얼룩을 슬라이드에 슬라이드 설치 중간에 1 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole). 다음 커버 슬립 커버와 매니큐어 또는 고무 시멘트와 함께 인감. 분석 결과 빛에 민감한 어둠을 슬라이드 수 있습니다.
- 얼룩 세 번째 슬라이드 TUNEL 분석 결과 DAPI counterstain를 사용 하 여 스테인드는 하지만 각 샘플에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어로 사용.
참고: 컨트롤 슬라이드 4 histosections의 첫 번째 2는 긍정적인 제어 복제 되며 지난 2 부정적인 제어 복제.- 단계 4.5.2.2, 대신 긍정적인 컨트롤에 대 한 사전 DN 버퍼 (30 m m trizma, pH 7.2, 4 mM MgCl2, 0.1 m m DDT) 조직 치료 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 Dnase I DN에 0.1ug의 최종 농도 대 한 버퍼를 분해 / mL, 슬라이드에 직접 적용. 실 온에서 15 분 동안 품 어. 그런 다음, 씻어 슬라이드 dH2O 5 세척 3 분 동안 각 세척. 과잉 액체를 되 리. 다음 단원의 4.5.2.3 지시 대로 TUNEL 분석 결과 다시 시작 합니다.
- 부정적인 컨트롤에 대 한 추가 하지 마십시오 터미널 deoxynucleotidyl tranferase (TdT) 효소 그 샘플에 (섹션에서에서 설명한 대로 4.5.2.4).
- 분석 결과의 완료 되 면 즉시 TUNEL 슬라이드를 관찰 합니다.
- 받아 사진을 무작위로 각 피부 부분 모두 rhodamine 얼룩, apoptotic 세포를 보여준다는 빨강과 DAPI는 모든 핵을 밝혀 나타나고 파란색 표시에 대 한 필터를 사용 하 여 형광 현미경을 사용 하 여 X 200에 따라 간격을의 오버레이 세포를 생성할 수 있습니다. 적어도 100 셀 샘플 당 피부 섹션 당 사진 확인 합니다. -20 ° c.에 있는 어두운 현미경 상자에 슬라이드 저장
- 이미지 당 셀 (블루 DAPI 스테인드)을 계산. 적어도 100 셀 피부 섹션 당 계산 됩니다 확인 합니다. 100 셀에 도달, 이미지 내의 모든 셀을 계산. 적은 다음 100 셀 하나의 이미지에 존재 하는 경우 적어도 100 셀은 피부 섹션 동물 당 당에 도달할 때까지 또 다른 이미지를 계산 합니다.
- 다음, 같은 이미지 (붉은 rhodamine 스테인드)에 TUNEL 긍정적인 셀의 수를 계산 합니다. TUNEL 긍정적인 세포 apoptosis와 괴 사 또는 배경 나타내는 명확한 세포 가장자리 (막 아무 세포와 본래 이다)와 단일 세포 이다. 때로는 세포 형태 apoptotic 시체를 축소합니다.
- TUNEL 분석 결과에 계산 영역 찾아서 H & E histosections 스테인드에 해당 영역을 분석 합니다. H & E 섹션 스테인드 보장 Bd, Bd 감염의 사이트에 해당 확인-감염 된 사이트 TUNEL 분석 결과에 apoptotic 세포를 계산 하는 경우에 사용 됩니다.
5. Caspase 3/7 분석 결과
- ( Bd-노출 및 Bd-부정) 각 동물에서 발가락 끝을 수집 한번 매주 3 주 게시물 접종, 및을 통해 격주 개인 당 8 발가락까지 실험의 끝.
- 두 번째 지 골에서 화 염 소독가 위, 발가락 끝을 잘라 고 1.5 mL microtube 놓고-80 ° c.에 즉시 동결
- 냉동된 발가락 샘플에서 단백질을 추출 합니다.
- 2 스테인리스 구슬 (3.2 m m) 1.5 mL 나사 모자 microtube 샘플 버퍼 (25mm HEPES pH 7, 5 mM MgCl2)의 100 µ L에 샘플을 배치 합니다. 최대 속도 (1.2.1에서 사용 단계로 같은 구슬 때리는) 얼음에 3 분 뒤에 1 분 구슬의 4 사이클에 의해 샘플을 lyse. 세포의 용 해, 후 12000 g x와 5 분 수집 상쾌한 분석 결과에 사용을 위한 4 ° C에서 샘플 원심.
- Bradford 분석 실험을 사용 하 여 샘플 당 단백질 농도 계량.
- 384 잘 플레이트에서 Bradford 시의 10 µ L 10 µ L의 단백질 추출 혼합 하 고 실 온에서 2 분 동안 품 어. 중복에서 각 샘플을 실행, 5 시리즈와 함께 접어 BSA 희석 기준. 595에서 흡 광도 읽고 nm 흡 광도 플레이트 리더에.
- 또는, 발가락 끝 샘플 (단백질 농도 낮은 표준 근처 단계 4.3.1에서 Bradford 분석 실험에서 결정 또는 샘플링 개구리 3 g 총 중량) 너무 작은 경우, 표준화 샘플 피부 표면을 추정 하 여 Bradford 분석 실험 대신 사진을 사용 하 여 영역.
- Caspase 분석 결과 대 한 샘플에서 단백질을 추출 하기 전에 40 X 확대를 거꾸로 가벼운 현미경을 사용 하 여 각 발가락 사진.
- 발가락의 위치를 추정 하 여 이미징 소프트웨어, 컴퓨터를 사용 하 여 발가락 샘플을 분석 합니다. 발가락 클립의 가장자리 주위 선 그리기 하 여이 작업을 수행 하 고 모양 내 이미징 소프트웨어 예상 지역. 다음 3 차원 피부 샘플의 표면적을 대략적인 것 이다 pi (3.14)를 곱하면 그 지역 (길이 단면적 x로 (pi x 직경) 튜브의 바깥 표면 영역을 제공).
- Caspase 3/7 분석 결과 수행 합니다.
- 384 잘 발광 접시에서 상용 caspase 3/7 시 약의 10 µ L 및 단백질 추출 10 µ L를 추가 합니다. 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.
- 실 온에서 30 분 동안 빛에서 접시 15 미 품에 대 한 접시를 천천히 흔들어는 시 약을 혼합. 발광은 발광 격판덮개 리더를 사용 하 여 측정 합니다.
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Representative Results
TUNEL 분석 결과
감염된 제어 동물에 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 보다 감염 된 동물에 있었습니다. 셀에 달랐다 긍정적인 TUNEL 제자리에 위치 감염 하 고 동물을 제어. 제어 동물, TUNEL 셀 및 표 피는 피부를 통해 피부 레이어 (참조 그림 1A), 수준 낮은 하지만 감염 된 동물에 TUNEL 긍정적인 세포 표 피 (그림에에서 더 자주 긍정적인의 동등한 배급이 했다 1B). 감염 (H & E 슬라이드 스테인드 관찰)로의 사이트 했다 관찰 clumped Bd sporangia 허벅지와 복 부 피부 등 섹션에서 없음 섹션을 통해 흩어져. TUNEL 동안 긍정적인 세포에 집중 되었고 직접 감염 된 세포 (그림 1C)의 사이트에 인접 한, 또한 있었다 더 널리 TUNEL 긍정적인 세포 표 피 고 있던 곳 보다 깊은 상피 층에서 Bd 살고. Bd 에서 있었다 분석 하 고, 모든 3 개의 피부 타입에 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 하지만 허벅지와 벤 터 피부에 특히 높은 수준의 동물 감염 (12.01 배 (95 %CI: 4.92 26.30) 허벅지 피부와 22.31 시간 높은 (95% CI 5.25-94.82)에 벤 터 피부) (그림 2).
Caspase 3/7 분석 결과
감염의 과정 동안 caspase 활동에 변화가 했다. Bd 감염 동물에 감염 강도 caspase 3/7 활동 (그림 3)와 긍정적으로 상관 된다. 또한 시간, 게시물 접종을 통해 감염 되 고 감염 되지 않은 동물 사이의 차이 했다. Caspase 3/7 활동 (와 48.36% 감염 된 동물에서 활동), 접종 후 처음 몇 주 내에서 감소 하 고 주 7 (그림 4) Bd 에 감염 동물, 하지만 감염에 일정의 끝으로 증가 개인입니다.
그림 1: 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-(TUNEL)에서 라벨의 분석 결과 원래의 감염 및 감염 되지 않은 동물. A) Bd-제어 허벅지 피부 부분의 Pseudophryne 코 와 B) Bd+ 허벅지 피부 피 코 TUNEL 분석 결과 현장에 의해 스테인드의 섹션. 파란색 얼룩이 지는 세포의 핵을 나타내는 DAPI 이며 빨간색은 독특하게 apoptosis에 의해 발생 하는 DNA 파편을 나타내는 rhodamine 얼룩. 노란색 화살표는 패널 C. C에서에서 본 Bd 클러스터의 위치를 나타냅니다) P. 코 부분의 허벅지 피부 물 H & e. H & E 섹션은 패널 B. 직렬 빈 Bd sporangia의 클러스터는 (화살표)와 약간 어두운 미 숙 sporangia 피부 표면 근처. 모든 세 가지 패널에 대 한 표 피는 사진 맨 이다. B와 C에서는 표 피 세포를 얼룩이 rhodamine 주위와 Bd 의 클러스터 아래에 집중 하 고 어디 피부 손상 패널 비교 기저 상피 세포 사이 마이크로 소포 형성 등 표시 됩니다. 400 배 확대 및 눈금 막대 나타냅니다 0.03 m m. 그림 2 에서 적응 Brannelly 외. 2017 피어 J22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 긍정적인 TUNEL의 비율 (TUNEL +) 피부 타입 당 세포. 감염 된 동물 질병에 굴복 하는 동물을 나타내는 P. 코에 피부 타입 당 TUNEL 긍정적인 apoptotic 세포의 비율 (n = 9) 및 감염된 제어 동물 (n = 10). 오차 막대 표시는 비율의 95% 신뢰 간격 및 * TUNEL + 셀 크기에 상당한 증가 나타냅니다. 등 쪽 피부에 감염 된 동물 제어 동물 보다 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 번 14.38 (95% CI 3.32 62.24) 했다 (확율 비율: Z = 3.57, p < 0.01). 허벅지 피부에 감염 된 동물 했다 12.01 (95 %CI: 4.92-26.30; 확율 비율: Z 5.46, p = < 0.01) 시간 제어 동물 보다 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 (Pearson의 카이 제곱: χ21 44.30, p = < 0.01). 벤 터 피부에 감염 된 동물 제어 동물 보다 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 번 22.31 (95% CI 5.25-94.82) 했다 (확율 비율: Z = 4.21, p < 0.01). Brannelly 외. 2017 피어 J22. 에 그림 3 에서 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 감염 강도, 로그10(zoospore 등가물), 및 caspase 3/7 사이의 상관 관계 로그10(Caspase)의 주사 Litoria verreauxii alpina 실험의 과정을 통해. 감염 강도와 caspase 활동 사이의 상호 관계는 0.463, 트렌드 라인 있으며 y 방정식 (0.229) x + 0.939 =. 그림 4 에서 Brannelly 외에 적응. 2017 피어 J22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Caspase 3/7 활동 Litoria verreauxii alpina의 각 그룹에 대 한 주 7 통해: Bd-감염 동물 질병에 굴복 (n = 4)와 감염 되지 않은 컨트롤 (n = 8). Caspase 활동 독서 발광 샘플 당 단백질 농도 대 한 제어로 정의 되 고 로그 10 변형. Caspase 활동 (로그10 변형) / 주 각 그룹에 대 한. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. * 감염 된 동물 그 주에 감염 되지 않은 컨트롤에서 차이 나타냅니다. (선형 혼합된 효과 모델: 주, F4 = 11.974, p < 0.01; 주 * 상태, F8 = 2.139, p = 0.037; 3 주 배치법, F2,18 = 5.512, p = 0.014), Brannelly 그 외 여러분 2017 피어 J22. 에 그림 5 에서 적응 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리는 표 피 apoptosis와 세포 죽음의 치명적인 질병 chytridiomycosis 병리학 또는 Bd 취약 종에 질병 저항 메커니즘의 잠재적인 메커니즘으로 탐험. 우리 세포 죽음 표 피, 표 피 세포 죽음 분석, 현장에 대 한 분석 결과 TUNEL 및 감염의 진행을 통해 표 피 세포 죽음을 모니터링을 위한 caspase 3/7 분석 결과 평가의 두 가지 방법을 사용 합니다. 우리는 세포 죽음 및 apoptosis 감염 부하와 상관은 세포 죽음은 감염의 사이트에 훨씬 더 높은 발견. 초기 감염에는 표 피에 있는 apoptosis에 감소 하지만 apoptosis 감염된 조직 내의 병원 체 부담 증가로 증가.
세포에 있는 Apoptosis 이점 및 제한에 각각 수많은 다른 방법을 사용 하 여 테스트할 수 있습니다. 그것은 여러 분석 실험을 사용 하 여 결과 확인 하는 apoptosis와 세포 죽음을 연구 해야 합니다. 이 연구에서 우리는 조사 상피 세포 죽음 및 chytridiomycosis와 개구리에 있는 apoptosis를 두 개의 다른 분석 실험 탐험. 첫 번째, 우리 trialled는 TUNEL 세포 죽음 제자리를 평가 하기 위해 시험. 이 테스트 시간이 소모 및 비싼 샘플, 당 이며 형광 신호를 신속 하 게 페이드로 슬라이드 즉시 읽을 수 있어야 합니다. 이러한 제한에도 불구 하 고이 위치에 실험의 결과 호스트 병원 체 상호 작용의 메커니즘을 이해 하는 더 중요 하다. 이 메서드를 사용 하 여 지역화에 대 한 정보를 확인할 수 있습니다 그리고 우리의 연구에서 apoptosis 높은 레벨과 곰 팡이 감염의 사이트에 더 만들어진다 다른 사이트에 존재 했다. 또한 TUNEL 분석 결과 DNA 손상, apoptosis, 괴 사 및 pyroptosis17를 포함 하 여 다른 세포 죽음 메커니즘의 숫자에 의해 발생할 수 있습니다 측정 주목 해야 합니다. Apoptosis에 관련 된 세포 죽음의 서명 하는 동안 (와 같은 멤브레인과 단일 셀은 여전히 그대로 프로토콜 라인 4.6.3 참조, 분류 의존 하는 연구원의 해석. 세포 죽음의 메커니즘 TUNEL 분석 결과 의해 결정 되지 않습니다, 때문에 그 다른 비 apoptosis 세포 죽음 통로 발생 할 수 있습니다 증가 감염 된 동물의 병 적에 TUNEL 긍정적인 세포에 가능 하다. 어떤 각 분석 결과 조치 2에서 패턴 차이 설명할 수 있는 차이 분석 trialled 여기 실험.
Caspase 3/7 분석 결과 시간을 통해 감염의 효과 척도를 사용할 수 있습니다. 그러나, 개구리 발가락 샘플은 작은, 분석 및 표준화에 대 한 제한 된 샘플이입니다. 샘플 규격화를 위한 일반적인 방법은 각 추출의 총 단백질 농도 결정 하는. Bradford 단백질 정량화 분석 실험 샘플을 사용 하는으로 작은 추출 물에 대 한 효과적인 방법이 아니다. 또한, 우리는 개구리 내 안료 나노 UV에 대 한 분석에 의해 배제 분석 피부 발견. 작은 샘플 크기는 또한 건조 중량에 의해 표준화를 방지. (이 개구리 했다 몸 크기에 3 세대 미만) 발가락 끝 샘플 했다 단백질 농도 및 caspase 농도 분석 실험을 허용 하도록 너무 작은 사진을 사용 하 여 발가락의 피부 표면 영역을 추정 하는 것이 좋습니다. 우리는 발가락을 촬영 하 고 피부 표면적 견적을 사용 하 여 효과적으로 전통적인 단백질 농도 분석은 발견.
이 연구에서 우리는 측정 세포 죽음 및 apoptosis, 두 가지 표준 기술을 사용 하지만 양서류와 작은 조직 샘플에 대 한 방법을 적응. TUNEL 분석 결과 대 한 충분 한 조직 분석 결과, 사용할 수 있었습니다 그리고 다른 피부 위치의 비교에 대 한 허용 되도록 동물 안락사 우리. 이 메서드는 동물의 안락사 필요 하지 않으며 발가락 웨 빙 생 검 같은 작은 조직 샘플에 적용 가능 하다. 동물의 크기에 따라 생 검 동안에 수 시리즈 테스트 caspase 3/7 분석 결과 대 한 우리의 접근 방식은 비슷합니다.
미래에 연구, 우리는 아직 많이 chytridiomycosis pathogenesis의 인과 메커니즘을 배울 수 있기 때문에 chytridiomycosis 감염의 과정을 통해 세포 죽음 및 apoptosis를 탐험에 대 한 추가 분석 실험의 사용을 제안 합니다. 이 결과 apoptosis와 표 피 세포 죽음 Bd;의 병 인에 중요 한 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 그러나, 더 많은 연구 결과, 특히 감염. 에 굴복 하지 않는 호스트에서에서 apoptosis의 영향을 결정 하기 위해 필요
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리 축산 및 데이터 수집 지원 다음과 같은 사람들에 게 감사: D. Tegtmeier, C. 드 종, J. 호크스, K. Fossen, S. 퍼시벌, M. 맥 윌리엄스, L. Bertola, M., 명 Harney, 스튜어트와 T. Knavel; 그리고 해와 지원에 대 한 M. Merces입니다. 우리 또한 M. 맥 퍼 든, 피 할로 타롱가 동물원 alpina v. L., 양육에 대 한 G. Marantelli P. 코양육에 대 한 감사 하 고 싶습니다. F. Pasmans, A. 마 텔 apoptosis 분석 실험, C. 콘스탄틴, A. Kladnik, R. Webb TUNEL 분석 결과, 지원에 대 한 조언 감사 그리고 T. Emeto와 W. Weßels에 대 한 프로토콜 및 caspase 3/7 분석 결과 대 한 키트 도움이. 이 원고와 프로토콜은 Brannelly 외 2017 피어 J22. 에서 적응
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) |
Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3′) |
Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
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